裂殖壺菌pks基因啟動(dòng)子的克隆及活性檢測(cè)

王振東，臧曉南，叢曉梅，朱清

(中國海洋大學(xué) 海洋生物遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

引 言

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)是一種具有抗炎、保護(hù)心腦血管、促進(jìn)視覺細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等重要生理功能的n-3多不飽和脂肪酸。裂殖壺菌是一種單細(xì)胞球形真菌，被認(rèn)為是一種新興的理想的二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)來源。裂殖壺菌能夠在脂滴內(nèi)積累大量的多不飽和脂肪酸(PUFAs)，主要是n-3 PUFAs。裂殖壺菌總脂肪酸含量超過其細(xì)胞干重的50%，尤其是DHA，含量占總脂的30%～40%[1]。這意味著和DHA合成相關(guān)的基因的啟動(dòng)子能高效地啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，而裂殖壺菌DHA合成途徑中的關(guān)鍵酶基因主要包含在三個(gè)基因簇pks1、pks2和pks3中，所以本實(shí)驗(yàn)嘗試擴(kuò)增得到pks1及pks3基因的啟動(dòng)子序列，為裂殖壺菌的基因工程操作提供有效的啟動(dòng)子元件。

啟動(dòng)子是一段脫氧核糖核酸序列，一般位于結(jié)構(gòu)基因的5′端上游，可以活化RNA聚合酶，使之與啟動(dòng)子特異性識(shí)別并結(jié)合，從而起始轉(zhuǎn)錄，調(diào)控下游基因的表達(dá)[2]。啟動(dòng)子自身并不具有基因調(diào)控功能，需要和多種轉(zhuǎn)錄因子及RNA聚合酶結(jié)合后形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體，然后才可以調(diào)控基因的表達(dá)[3]。啟動(dòng)子是基因的重要組成成分，是基因表達(dá)調(diào)控過程中的順式作用元件，影響基因的表達(dá)水平，同時(shí)啟動(dòng)子也在基因工程載體的研究中發(fā)揮著重要的作用。一般按表達(dá)方式將啟動(dòng)子分為：組成型啟動(dòng)子、組織特異性表達(dá)型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子三類[4]。但這種分類也不是絕對(duì)的，某些啟動(dòng)子可能會(huì)兼具兩種類型的特點(diǎn)[5]。

已經(jīng)有許多啟動(dòng)子成功應(yīng)用到了裂殖壺菌的轉(zhuǎn)化體系中。Cheng等人利用18S rDNA作為同源重組位點(diǎn)，將TEF1啟動(dòng)子和ble基因?qū)肓阎硥鼐?，使裂殖壺菌具有了Zeocin抗性，說明TEF1啟動(dòng)子成功啟動(dòng)了ble基因的表達(dá)，同時(shí)也是構(gòu)建了一種用于裂殖壺菌遺傳轉(zhuǎn)化篩選的系統(tǒng)[6]。Kobayashi等人通過由破囊壺菌泛素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的脂肪酸Δ5去飽和酶基因的表達(dá)來改變破囊壺菌的脂肪酸組成，該基因在裂殖壺菌中進(jìn)行了功能表達(dá)，從而增加了通過Δ5去飽和酶從二十碳四烯酸(ETA)轉(zhuǎn)化成二十碳五烯酸(EPA)的量[7]。Suen等人利用裂殖壺菌微管蛋白啟動(dòng)子啟動(dòng)透明顫菌血紅蛋白基因(VHb)在裂殖壺菌中表達(dá)，所得重組菌株的總脂肪酸含量比野生型高了44%，蝦青素含量提高了9倍[8]。Sun等人將酵母啟動(dòng)子PGKpromoter和綠色熒光蛋白基因(egfp)導(dǎo)入裂殖壺菌基因組中，結(jié)果表明PGKpromoter使綠色熒光蛋白成功表達(dá)[9]。

目前在裂殖壺菌的基因工程操作中，多采用外源啟動(dòng)子，外源啟動(dòng)子由于物種間的差異，會(huì)出現(xiàn)啟動(dòng)活性弱或者沒有啟動(dòng)活性等問題，顯然無法滿足日益發(fā)展的裂殖壺菌基因工程操作的需求，因此研究者對(duì)裂殖壺菌內(nèi)源啟動(dòng)子的需求日益強(qiáng)烈。故本實(shí)驗(yàn)克隆得到pks基因的5′端序列并檢測(cè)其活性，以期為裂殖壺菌的基因工程操作提供可能的啟動(dòng)子元件。

1 實(shí)驗(yàn)菌株與載體

表1 實(shí)驗(yàn)菌株、載體及來源

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 裂殖壺菌基因組DNA的提取及5′側(cè)翼序列的擴(kuò)增

采用Takara公司提供的酵母基因組DNA提取試劑盒Yeast DNAiso Kit提取裂殖壺菌OUC168的基因組DNA。通過染色體步移法擴(kuò)增得5′側(cè)翼序列，采用Takara公司的Genome Walking Kit試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。

2.2 pks1基因和pks3基因5′側(cè)翼序列的分析

通過PlantCARE[10]及Meth Primer[11]等啟動(dòng)子分析軟件對(duì)得到的5′側(cè)翼序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。得到結(jié)果后，我們將pks1基因的啟動(dòng)子序列用pks1promoter表示，將pks3基因的啟動(dòng)子序列用pks3promoter表示。

2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

首先構(gòu)建克隆載體pEASY-Blunt-T1-pks1promoter、pEASY-Blunt-T1-pks3promoter，然后使用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII雙酶切克隆載體及載體pAcGFP1-1，最后用T4連接酶分別將pks1promoter和pks3promoter與pAcGFP1-1載體相連接，得到重組表達(dá)載體pAcGFP1-1-pks1promoter和pAcGFP1-1-pks3promoter。質(zhì)粒圖譜如圖1所示。

圖1 原核表達(dá)載體圖譜

2.4 真核表達(dá)載體的構(gòu)建

首先使用兩組限制性內(nèi)切酶NotI和HindIII對(duì)PYD1載體及原核表達(dá)載體pAcGFP1-1-pks1promoter和pAcGFP1-1-pks3promoter進(jìn)行雙酶切，得到pYD1線性載體及片段pks1promoter-GFP和pks3promoter-GFP，然后構(gòu)建真核表達(dá)載體pYD1-pks1promoter-GFP和pYD1-pks3promoter-GFP。質(zhì)粒圖譜如圖2所示。

圖2 真核表達(dá)載體圖譜

2.5 重組表達(dá)菌株的構(gòu)建

將提取的原核表達(dá)載體及空載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，得到大腸桿菌重組菌株；將構(gòu)建好的真核表達(dá)載體通過酵母轉(zhuǎn)化試劑盒Frozen-EZ Yeast Transformation IITM轉(zhuǎn)化到酵母菌EBY100中，得到酵母菌重組菌株。

2.6 重組菌株的啟動(dòng)子活性檢測(cè)

根據(jù)劉暢[12]的方法，對(duì)大腸桿菌及酵母菌重組菌株進(jìn)行熒光檢測(cè)及SDS-PAGE蛋白檢測(cè)，以分析這兩段啟動(dòng)子序列在原核表達(dá)系統(tǒng)及真核表達(dá)系統(tǒng)中的活性。

3 結(jié)果分析

3.1 pks基因5′側(cè)翼序列分析

將所得pks1基因和pks3基因的5′側(cè)翼序列用PlantCARE軟件進(jìn)行啟動(dòng)子分析，結(jié)果表明(圖3)，pks1基因和pks3基因的5′側(cè)翼序列均含有CAAT-box和TATA-box順式作用元件，pks1基因的5′側(cè)翼序列含有MBS區(qū)，pks3基因的5′側(cè)翼序列含有Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

圖3 pks基因5′側(cè)翼序列的序列分析

Meth Primer的預(yù)測(cè)結(jié)果如圖4所示，在pks1基因5′側(cè)翼序列的49～198 bp之間有一段長為149 bp的CpG區(qū)域；在pks3基因5′側(cè)翼序列的317～460 bp之間有一段長為143 bp的CpG區(qū)域。經(jīng)初步分析認(rèn)為這兩段序列具有啟動(dòng)子特征，含有上游調(diào)控元件，可能為裂殖壺菌pks1基因和pks3基因的啟動(dòng)子。

(a)

3.2 重組菌株熒光檢測(cè)分析

對(duì)大腸桿菌重組菌株進(jìn)行熒光光譜檢測(cè)，結(jié)果如圖5(a)所示?？梢钥闯?，在475 nm波長光的激發(fā)下，重組菌株均在505 nm處呈現(xiàn)出熒光峰。與對(duì)照組相比，重組菌株中綠色熒光蛋白的特征峰均高于對(duì)照組，并且pks3promoter啟動(dòng)的綠色熒光蛋白峰值高于pks1promoter，說明綠色熒光蛋白在原核及真核表達(dá)系統(tǒng)中均成功表達(dá)，pks1基因和pks3基因的啟動(dòng)子均具有一定的啟動(dòng)活性，且pks3promoter的活性略高于pks1promoter。

圖5 重組菌株熒光檢測(cè)結(jié)果

3.3 重組菌株SDS-PAGE蛋白檢測(cè)分析

構(gòu)建得到的大腸桿菌重組菌株經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖6(a)所示。泳道3為對(duì)照菌株BL21，泳道1、2為重組菌株BL21-pAcGFP1-1-pks1promoter，在25～30 kDa之間出現(xiàn)一條略微加深的條帶，泳道4為重組菌株BL21-pAcGFP1-1-pks3promoter，在25～30 kDa之間也出現(xiàn)一條略微加深的條帶與綠色熒光蛋白(26.7 kDa)大小相符。

圖6 重組菌株的SDS-PAGE檢測(cè)

構(gòu)建得到的酵母菌重組菌株經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖6(b)所示。泳道1為對(duì)照菌株EBY100，泳道2為重組菌株EBY100-pYD1-pks1promoter-GFP，在25～30 kDa之間出現(xiàn)一條加深的條帶，泳道3、4為重組菌株EBY100-pYD1-pks3promoter-GFP，在25～30 kDa之間也出現(xiàn)一條略微加深的條帶，與綠色熒光蛋白(26.7 kDa)大小相符。說明綠色熒光蛋白在原核及真核表達(dá)系統(tǒng)中均成功表達(dá)，這兩段啟動(dòng)子序列是具有啟動(dòng)活性的。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過染色體步移技術(shù)，得到pks1基因和pks3基因的5′側(cè)翼序列，通過PlantCARE及Meth Primer等啟動(dòng)子分析軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，得到pks1promoter和pks3promoter兩段啟動(dòng)子序列。pks1基因和pks3基因的5′側(cè)翼序列均含有CAAT-box和TATA-box順式作用元件，pks1基因的5′側(cè)翼序列含有MBS區(qū)，pks3基因的5′側(cè)翼序列含有Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。pks1基因5′側(cè)翼序列的49～198 bp之間有一段長為149 bp的CpG區(qū)域；在pks3基因5′側(cè)翼序列的317～460 bp之間有一段長為143 bp的CpG區(qū)域。初步分析認(rèn)為這兩段序列具有啟動(dòng)子活性。然后通過構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)及真核表達(dá)系統(tǒng)研究這兩段啟動(dòng)子序列的活性，以綠色熒光蛋白作為指示劑，對(duì)重組菌株進(jìn)行熒光檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)其綠色熒光蛋白的特征峰均高于對(duì)照組，并且pks3promoter啟動(dòng)的綠色熒光蛋白峰值高于pks1promoter，SDS-PAGE檢測(cè)也表明，重組菌株均出現(xiàn)一條與綠色熒光蛋白(26.7 kDa)大小相符的條帶?？梢钥闯?，這兩段啟動(dòng)子序列pks1promoter及pks3promoter在原核表達(dá)系統(tǒng)及真核表達(dá)系統(tǒng)中均具有一定的啟動(dòng)活性。

但是從結(jié)果來看，本實(shí)驗(yàn)中無論是大腸桿菌重組菌株還是酵母菌重組菌株，其顏色并沒有呈現(xiàn)出明顯的綠色，綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度也較低，說明綠色熒光蛋白表達(dá)量不高，這兩段啟動(dòng)子序列活性不強(qiáng)。李丁等人將煙草葉綠體16SrRNA基因的啟動(dòng)子Prrn與綠色熒光蛋白相連，檢測(cè)Prrn啟動(dòng)子在大腸桿菌中的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純的Prrn啟動(dòng)子無法啟動(dòng)綠色熒光蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)，而在啟動(dòng)子和基因之間引入一段轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列之后，基因得到了有效的表達(dá)[13]。分析大腸桿菌重組菌株中兩段啟動(dòng)子活性均不高的原因，可能是因?yàn)檎婧藛?dòng)子在原核中表達(dá)添加需要適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄調(diào)控序列。

然而這兩段啟動(dòng)子序列在酵母中的表達(dá)活性與在大腸桿菌中相似，重組菌株的熒光檢測(cè)結(jié)果均較弱，說明這兩段啟動(dòng)子活性確實(shí)不高，推測(cè)有可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)所擴(kuò)得的啟動(dòng)子序列不完整，缺少必要的順式作用元件。一些基因工程中常用的真核啟動(dòng)子，比如磷酸甘油酸激酶基因(PGK)啟動(dòng)子，其序列長度就達(dá)到了1498 bp，其啟動(dòng)活性很強(qiáng)[14]。本實(shí)驗(yàn)中得到的兩段啟動(dòng)子序列長度都較短，pks1promoter為403 bp，pks3promoter為796 bp，所包含的順式作用元件也較少。因此猜測(cè)我們實(shí)驗(yàn)獲得的兩段啟動(dòng)子由于沒有完整克隆出其順式作用元件，從而啟動(dòng)活性較弱。另外，在野生型裂殖壺菌中，pks1和pks3基因啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性較強(qiáng)，并且其起始基因的表達(dá)是不需要誘導(dǎo)條件的，可能屬于組成型啟動(dòng)子，然本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果顯示啟動(dòng)子活性較低，是否這兩段啟動(dòng)子序列在酵母展示系統(tǒng)中的表達(dá)受到物種限制，或者裂殖壺菌中存在不為我們所知的元件在調(diào)控啟動(dòng)子的活性？需要我們繼續(xù)深入研究。

本文通過綠色熒光蛋白研究了pks基因啟動(dòng)子的活性，為裂殖壺菌的基因工程操作提供了可能的啟動(dòng)子元件，同時(shí)也為改造裂殖壺菌獲得高產(chǎn)DHA的菌株奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。