柳枝稷與苜蓿的共發(fā)酵對厭氧發(fā)酵體系產(chǎn)氣效率及微生物群落的影響

孫 宇 劉 燕 陳嘯天 于海茹 袁旭峰 趙洪顏* 崔宗均*

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉133002；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，北京100193；3.四川碩盟農(nóng)業(yè)科技有限公司，成都 610093；4.延邊州特色產(chǎn)業(yè)中心，吉林 延吉 133002)

隨著我國生物質(zhì)能源的生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，對生產(chǎn)生物質(zhì)能源的原料需求也急劇增長。在保證糧食安全和耕地面積的基礎(chǔ)上，合理且充分地利用我國的各種邊際土地，種植能源草等植物可以有效地解決生物質(zhì)原料短缺的問題[1]。柳枝稷原產(chǎn)于美國，為多年生C4草本植物，生物質(zhì)產(chǎn)量可達(dá)20 t/hm2，是一種高生產(chǎn)和低投入的能源作物[2]。由于其在栽培上適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，被作為能源草廣泛利用于水土保持和風(fēng)障植物。紫花苜蓿為多年生豆科植物，含有豐富的營養(yǎng)成分，尤其是蛋白質(zhì)含量高，具備很高的綜合利用價(jià)值[3]，并且紫花苜蓿也是一種較好的能源草，其在改善邊際土地生物多樣性具有重要意義。

厭氧發(fā)酵是含纖維素能源作物轉(zhuǎn)化為能源為數(shù)不多的成功途徑，作為一種能源作物柳枝稷的沼氣發(fā)酵也備受關(guān)注。但柳枝稷作為厭氧發(fā)酵的原料，首先遇到的問題是由于柳枝稷的碳氮比高，在單獨(dú)發(fā)酵時(shí)，有機(jī)酸過度積累，pH下降，從而導(dǎo)致沼氣發(fā)酵過程受阻[4]。楊富裕等[5]以柳枝稷為原料通過微波，蒸汽加熱和NaOH預(yù)處理方法，研究柳枝稷的結(jié)晶度和纖維結(jié)構(gòu)的影響及厭氧發(fā)酵特性，結(jié)果表明：3種預(yù)處理方法都可以降低原料結(jié)晶度，但由于碳氮比較高，對厭氧發(fā)酵并無明顯改善作用。這是因高碳氮比會(huì)抑制沼氣的產(chǎn)生，對厭氧發(fā)酵的穩(wěn)定性產(chǎn)生負(fù)面影響[6]。原料與緩沖基質(zhì)共發(fā)酵是可以克服物料高碳氮比問題的一種方法，并可以提高發(fā)酵過程穩(wěn)定性。與單發(fā)酵法相比，共發(fā)酵法具有提高沼氣產(chǎn)量、平衡整個(gè)系統(tǒng)、易于處理混合廢物等優(yōu)點(diǎn)。鄭澤慧[7]將柳枝稷與牛糞按不同比例(柳枝稷與牛糞原料的含固率配比分別為4∶0、3∶1、2∶2、1:3、0∶4)混合共發(fā)酵探索其產(chǎn)甲烷特性，結(jié)果表明：3種混合比例的甲烷產(chǎn)量均高于單一原料發(fā)酵的疊加產(chǎn)量；Zheng等[8]在柳枝稷與牛糞共發(fā)酵研究中采用定量PCR和克隆文庫分析，結(jié)果表明：共發(fā)酵底物比例不同，細(xì)菌群落存在顯著差異，共發(fā)酵可以顯著增加細(xì)菌的總量，并且綠彎菌門、厚壁菌門的豐度均顯著增加，因此混合發(fā)酵可以很好的提高發(fā)酵效率。目前在畜牧區(qū)，牛糞已經(jīng)大量用于厭氧發(fā)酵中，但由于生物質(zhì)能源的生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，導(dǎo)致一些非畜牧區(qū)甚至畜牧區(qū)出現(xiàn)了厭氧發(fā)酵高含氮原料短缺的問題。為解決因此出現(xiàn)的發(fā)酵體系中碳氮營養(yǎng)平衡問題，本研究擬以苜蓿作為牛糞的高含氮替代原料與柳枝稷共發(fā)酵，設(shè)置不同的柳枝稷和苜蓿原料含固率配比，探討和對比其產(chǎn)氣效率以及微生物群落的影響，得出柳枝稷與苜蓿的合理發(fā)酵組合配比，以期為非牧區(qū)能源作物種植區(qū)，沼氣-生物天然氣產(chǎn)業(yè)技術(shù)在非畜牧區(qū)的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

柳枝稷、苜蓿均取自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實(shí)驗(yàn)站，收割后切成2～3 cm長度，后在105 ℃烘箱殺青10 min后，60 ℃烘干至恒重，粉碎并密封保存，其具體組成見表1。污泥取自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)工程中心，活性污泥的pH 7.2，總固體(TS)，揮發(fā)性固體(VS)分別為6.0%和4.1%。

表1 柳枝稷及苜蓿的基本性質(zhì)Table 1 Chemical composition of switchgrass and alfalfa

1.2 試驗(yàn)裝置

發(fā)酵裝置采用800 mL抽濾瓶，集氣袋為2 L容量的鋁箔復(fù)合膜采樣袋，裝置示意圖如圖1。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

批次試驗(yàn)采用中溫發(fā)酵(35±1 ℃)，試驗(yàn)周期為30 d。柳枝稷和苜蓿不同TS配比如下：A組為0∶4；B組為1∶3；C組為1∶1；D組為3∶1；E組為4∶0。發(fā)酵裝置有效體積為600 mL，專門設(shè)一取樣瓶，有效體積為1.2 L，物料是發(fā)酵瓶的兩倍。試驗(yàn)依照總TS為4%添加原料，料泥比(原料與污泥比例)為1.4，每天均勻攪拌一次。發(fā)酵瓶3個(gè)平行處理，用于測定每日產(chǎn)氣量以及氣體成分的測定。發(fā)酵前9 d每天取樣，9 d之后3 d取樣一次，從取樣瓶抽取10 mL在-20 ℃保存以及用于pH的測定，同時(shí)監(jiān)測取樣瓶產(chǎn)氣情況，保證與發(fā)酵瓶的狀態(tài)一致。

圖1 發(fā)酵裝置主要結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the major structure for fermentation experiments

1.4 測定方法

1.4.1理化指標(biāo)測定

產(chǎn)氣量采用集氣排水法收集測量，氣體成分采用氣相色譜法測定。TS、VS采用干重法測定[9]，纖維素采用范式洗滌法，總碳、總氮分別用重鉻酸鉀容量法-稀釋熱法和凱氏定氮法[10]。pH用日本Horiba公司生產(chǎn)的B-212型微量pH計(jì)進(jìn)行測定。VFA用日本島津QP2010型液相色譜儀測定[11]。

1.4.2微生物分析

DNA提取與Q-PCR擴(kuò)增：對0、5、9、15、30 d后發(fā)酵體系的樣品進(jìn)行微生物檢測，將樣品8 000 r/min 離心10 min，取0.1～0.3 g沉淀，提取DNA，用多功能DNA純化回收試劑盒純化DNA；在ABI 7500 定量PCR儀(型號(hào)7500,Applied Biosystems,USA)上進(jìn)行Q-PCR反應(yīng)。細(xì)菌引物是B27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和B907r(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTT-3′)，古菌引物為A109f(5′-ACKGCTCAGTAACACGT-3′)和A912rt(5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCTTTA-3′)。

細(xì)菌16S rRNA基因克隆文庫構(gòu)建：將純化后的PCR產(chǎn)物與載體pGEM-T Easy Vector(A1360，Promega，USA)連接，采用熱激轉(zhuǎn)化法將連有目的片段的載體導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞(BMJM109，BIOMED，北京)，37 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)1 h。涂布在含有LBA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，每個(gè)樣品涂兩個(gè)培養(yǎng)皿，陰性對照和陽性對照，各涂一個(gè)培養(yǎng)皿，37 ℃倒置培養(yǎng)16 h進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。每個(gè)樣品隨機(jī)挑選200個(gè)陽性克隆子構(gòu)成該點(diǎn)的克隆文庫，再進(jìn)行菌落PCR，引物T7(5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′)和Sp6(5′-ATTTAGGTGACACTATAG-3′)，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，根據(jù)不同酶切帶型將克隆子進(jìn)行分類，挑取不同種類的一個(gè)陽性克隆子送去測序(上海生工生物工程有限公司)。

細(xì)菌、古菌的定量PCR：在ABI 7500 定量PCR儀(型號(hào)7500，Applied Biosystems，USA)上進(jìn)行Q-PCR反應(yīng)。不同的古菌有特定的引物和探針序列，本試驗(yàn)所用的5 種古菌特異引物及探針(TaqMan探針上標(biāo)有FAM熒光基團(tuán)和BHQ-1猝滅基團(tuán))：甲烷桿菌(MBT)(MBT857F，MBT929F，MBT1196R；擴(kuò)增長度：343 bp)；甲烷微菌(MMB)(MMB282F，MMB749F，MMB832R；擴(kuò)增長度：506 bp)；甲烷八疊球菌(MSC)(Msc380F，Msc492F，Msc828R；擴(kuò)增長度:408 bp)和甲烷鬃毛菌(MST)(Mst702F，Mst753F，Mst862R；擴(kuò)增長度：164 bp)。定量PCR反應(yīng)體系使用2×TaqMan Universal PCR Master mix(DRR390A，TaKaRa，大連)。用上述引物對每個(gè)菌株的rRNA基因序列進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物純化后采用多功能DNA回收試劑盒回收DNA，并將DNA連接到載體pGEM-T Easy Vector(Promega，USA)上，隨后通過熱轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，擴(kuò)大培養(yǎng)后采用高純質(zhì)粒小量快速提取試劑盒(PL0301，博邁德，北京)提取質(zhì)粒，在分光光度計(jì)測定質(zhì)粒濃度后，通過公式將質(zhì)粒濃度變換成以copies/μL為單位的數(shù)值，最后分別對5種質(zhì)粒以10倍的梯度進(jìn)行逐級稀釋，用來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析樣品中菌群16S rRNA基因克隆文庫。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2020，并且使用SPSS 26對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析與相關(guān)性分析，方差分析使用Duncan的多范圍檢測，其顯著性P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同配比的柳枝稷與苜蓿共發(fā)酵的日產(chǎn)甲烷量與累積產(chǎn)甲烷量變化

沼氣產(chǎn)量可作為監(jiān)測反應(yīng)器運(yùn)行效率的指標(biāo)[12]，對試驗(yàn)中5組的產(chǎn)甲烷量進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，如圖2為每g VS的日產(chǎn)甲烷量與累計(jì)產(chǎn)甲烷量。圖2(a)為柳枝稷與苜蓿共發(fā)酵30 d的日甲烷量變化，可見5組的產(chǎn)甲烷量均表現(xiàn)三峰趨勢，總體由高逐漸下降；5個(gè)組均在24 h后出現(xiàn)第1次產(chǎn)氣高峰，之后略有回落，在4～6 d出現(xiàn)2次產(chǎn)氣峰，3次產(chǎn)氣峰出現(xiàn)在8～11 d。從時(shí)間上，苜蓿成分多者產(chǎn)氣峰出現(xiàn)得早，柳枝稷成分多者產(chǎn)氣峰推后。柳枝稷與苜蓿A、B、C組在10 d時(shí)已結(jié)束大量產(chǎn)氣，分別達(dá)到總產(chǎn)氣量的95.6%、93.3%和93.8%，D組在13 d，E組在16 d產(chǎn)氣量回落到很低水平。這時(shí)D組與E組產(chǎn)氣量分別達(dá)到總產(chǎn)氣量的94.4%和97.2%。從產(chǎn)氣周期變化可見，原料中的不同成分分別在不同時(shí)間陸續(xù)被分解利用。純苜蓿的處理產(chǎn)氣都集中在前2次峰值上，說明苜蓿產(chǎn)氣主要依靠可溶性成分，這與表1中的數(shù)值相吻合；隨著原料中柳枝稷含量的增加，半纖維素、纖維素被逐漸降解利用，發(fā)酵周期就要往后延長，總產(chǎn)氣量也隨之增加，從表1可見柳枝稷的半纖維素含量顯著高于苜蓿，而纖維素含量兩者接近，說明柳枝稷后端的產(chǎn)氣主要靠半纖維素的分解利用。表2為柳枝稷與苜蓿日產(chǎn)甲烷量顯著性差異，從表中可以看出整個(gè)產(chǎn)氣周期中D組整體顯著性優(yōu)于A、B、C、E組。

由圖2(b)可見，試驗(yàn)剛開始時(shí)，苜蓿成分越多產(chǎn)氣積累越快，發(fā)酵到8 d左右后A、B、C組產(chǎn)氣積累乏力，逐漸被D、E組超越，最終累積產(chǎn)氣以E組最高，D組次之。A、B、C、D、E，5個(gè)組的累計(jì)產(chǎn)甲烷量分別達(dá)到291.7、287.7、320.3、357.4和362.2 mL/g VS，表3為柳枝稷與苜蓿累積產(chǎn)甲烷量顯著性差異，從表3中可知累積產(chǎn)甲烷量D、E組顯著優(yōu)于A、B、C組。而且D組和E組的產(chǎn)甲烷量沒有顯著差異。

柳枝稷與苜蓿TS比：A為0∶4；B為1∶3；C為1∶1；D為3∶1；E為4∶0。TS ratio of switchgrass to alfalfa:A was 0∶4;B to 1∶3;C is 1∶1;D is 3∶1;E is 4∶0.圖2 柳枝稷與苜蓿不同含固率配比下日產(chǎn)甲烷量(a)和累計(jì)產(chǎn)甲烷量(b)Fig.2 Daily methane production (a) and cumulative methane production (b) of switchgrass and alfalfa under different solid content ratios

2.2 不同含固率配比的柳枝稷與苜蓿共發(fā)酵pH、揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)的變化

柳枝稷與苜蓿共發(fā)酵pH，VFAs情況如圖3所示，pH整體變化趨勢是試驗(yàn)開始后1～3 d較明顯下降后上升，在第9 天和12 天附近2次略有下降，15 d之后基本穩(wěn)定在7.5～7.7。pH的這種變化與日產(chǎn)氣量變化曲線(圖2(a))完全吻合。在活躍的活性污泥的作用下，試驗(yàn)第1天最容易分解的可溶物質(zhì)表現(xiàn)出較高產(chǎn)氣量，但第2天開始pH迅速下降，隨之產(chǎn)氣量也陡然下降。之后pH的回升速度與柳枝稷和苜蓿的量緊密相關(guān)，柳枝稷少苜蓿多者pH回升快而高，柳枝稷多苜蓿少者pH回升慢，上升幅度也小，隨之產(chǎn)氣量比苜蓿多者高得多。在不同組合之間，苜蓿成分多者在初期pH下降幅度小，并且上升多，隨著柳枝稷成分的增加pH下降明顯，回升幅度減小，純柳枝稷的E組pH下降幅度大，最低時(shí)下降到6.2，回升比其他組緩慢，最終回升到穩(wěn)定點(diǎn)需要21 d。由圖3(a)可見在所有組合中，A、B、C、D組的pH均未出現(xiàn)劇烈波動(dòng)，說明苜蓿增強(qiáng)了反應(yīng)體系的C、N平衡和系統(tǒng)緩沖能力，使發(fā)酵系統(tǒng)更加穩(wěn)定，E組柳枝稷單發(fā)酵雖然最終累積產(chǎn)氣量最高，從pH曲線上看，其對發(fā)酵體系帶來一定酸敗的風(fēng)險(xiǎn)。

表2 柳枝稷與苜蓿不同含固率配比下日產(chǎn)甲烷量Table 2 Methane production of switchgrass and alfalfa under different solid content ratios

表3 柳枝稷與苜蓿不同含固率配比下發(fā)酵體系累積產(chǎn)甲烷量Table 3 Cumulative methane production of switchgrass and alfalfa under different solid content ratios

揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)是直接影響發(fā)酵體系pH的因素，在厭氧發(fā)酵體系中，VFAs含量不應(yīng)過高，過量的酸會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵反應(yīng)過度酸化，導(dǎo)致甲烷產(chǎn)量下降甚至停止。在厭氧發(fā)酵體系中常見的酸有：甲酸、乳酸、乙酸、丁酸和丙酸等有機(jī)酸，其中被認(rèn)為比較理想的VFAs為乙酸和丁酸，這些有利于甲烷的生成[13]。本試驗(yàn)中，也檢測到了常見的5種有機(jī)酸(圖3)，其中5個(gè)組中都出現(xiàn)酸有甲酸、乙酸、丙酸。甲酸出現(xiàn)在發(fā)酵過程的后期，乙酸主要出現(xiàn)在發(fā)酵過程的前期，主要存在于前8 d，5個(gè)組的第1天到第4天均有乙酸大量積累，使pH迅速下降，并奠定了第1個(gè)產(chǎn)氣高峰。柳枝稷含量高的處理，乙酸存在時(shí)間也越長，5個(gè)組合中乙酸消失的時(shí)間分別為5 d(A組、B組)、6 d(C組)、7 d(D組)、8 d(E組)，且在這階段pH下降最明顯，產(chǎn)氣量上升也最明顯；丙酸在整個(gè)發(fā)酵過程中均存在的時(shí)間較長，且不同組的丙酸含量差別不大，在第6天積累達(dá)到最大值后慢慢被降解利用，丁酸主要出現(xiàn)在C、D、E 3個(gè)組的前期，且柳枝稷含量越高的處理，丁酸出現(xiàn)的時(shí)間越長，濃度越高；而乳酸僅僅在苜蓿含量高的A、B、C 3個(gè)組中檢測到，而且僅出現(xiàn)在原料沒經(jīng)過厭氧發(fā)酵前，這有可能是因?yàn)檐俎１旧砗腥樗帷?/p>

3）凝膠時(shí)間變化。膠凝時(shí)間需要根據(jù)被加固土體的性質(zhì)調(diào)整。地層含水量大時(shí)，漿液易被地下水稀釋，影響固結(jié)效果，需要縮短凝膠時(shí)間；含水量少，為了擴(kuò)散一定范圍，需延長凝膠時(shí)間。

圖3 柳枝稷與苜蓿不同含固率配比下pH變化與揮發(fā)性脂肪酸含量變化Fig.3 Changes in pH and volatile fatty acid of switchgrass and alfalfa under different solid content ratios

2.3 柳枝稷與苜蓿共發(fā)酵細(xì)菌定性、定量分析

為確定發(fā)酵體系中微生物群落結(jié)構(gòu)，采用16S rRNA基因克隆文庫方法對發(fā)酵液進(jìn)行了細(xì)菌多樣性分析，每個(gè)處理隨機(jī)挑取細(xì)菌陽性克隆子200個(gè)，通過RFLP帶型分析以及在數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性檢索，分析微生物菌群親緣關(guān)系及相似性，各配比序列分析結(jié)果如表4所示。通過細(xì)菌16S rRNA基因序列進(jìn)化分析，表明細(xì)菌主要屬于6個(gè)門，主要包括變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes) 以及一些尚未歸類的不可培養(yǎng)菌。

原始污泥中的細(xì)菌多樣性最高，共獲得25個(gè)OTUs，Bacteroidetes、Proteobacteria和Firmicutes為優(yōu)勢菌群，分別占細(xì)菌克隆總數(shù)的28.6%、18.8%和18.8%；A組共獲得18個(gè)OTUs，Bacteroidetes、Firmicutes和Chloroflexi為優(yōu)勢菌群，分別占細(xì)菌克隆總數(shù)的31.8%、20.5%和9.4%；B組共獲得24個(gè)OTUs，Bacteroidetes和Firmicutes為優(yōu)勢菌群，分別占細(xì)菌克隆總數(shù)的37.1%和25.8%；C組共獲得16個(gè)OTUs，Chloroflexi、Firmicutes和Bacteroidetes為優(yōu)勢菌群，分別占細(xì)菌克隆總數(shù)的30.0%、25.7%和20.0%；D組共獲得15個(gè)OTUs，Bacteroidetes和Synergistetes為優(yōu)勢菌群，分別占細(xì)菌克隆總數(shù)的35.3%和21.6%；E組合共獲得23個(gè)OTUs，Bacteroidetes、Firmicutes和Synergistetes為優(yōu)勢菌群，分別占細(xì)菌克隆總數(shù)的41.7%、31.3%和12.5%。不同試驗(yàn)組之間優(yōu)勢菌群稍有差別，但是擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)在所有配比中含量均較高，豐度在20.0%～41.7%和7.8%～31.3%。有研究表明：厚壁菌門和擬桿菌門是厭氧發(fā)酵的重要細(xì)菌。其可以將有機(jī)物分解為甲烷古菌可以利用的氫或乙酸[14]。擬桿菌門細(xì)菌參與了水解與酸化階段，可以將水解產(chǎn)生的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類分別通過糖酵解、氧化、脫氨基轉(zhuǎn)化為古菌可用的有機(jī)物。厚壁菌門(Firmicutes)被認(rèn)為是一種可以降解各種底物并產(chǎn)生VFAs的共養(yǎng)細(xì)菌[12]，本試驗(yàn)中的厚壁菌門的克隆子大多屬于Clostridia(梭菌綱)，這是一種嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽性桿菌，是一種水解酸化菌，喜歡中溫環(huán)境，為嗜氫產(chǎn)乙酸，可以通過分泌纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶降解纖維素成揮發(fā)性有機(jī)酸及醇類。

表4 接種污泥及柳枝稷與苜蓿不同含固率配比的細(xì)菌16S rRNA克隆子序列分析結(jié)果Table 4 Sequence analysis of bacterial 16S rRNA clones inoculated sludge and switchgrass and alfalfa under different solid content ratio

除了優(yōu)勢菌群外，發(fā)酵體系內(nèi)還含有一些豐度較低的門，如浮霉菌門(Planctomycetes)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)等。浮霉菌門被認(rèn)為是細(xì)菌中分支多樣性最高的門。浮霉菌門菌體形態(tài)均為梨形，化能異養(yǎng)生長，可利用葡萄糖等多種糖類作為底物，不能利用有機(jī)酸、醇類、氨基酸作為碳源生長[15]。綠彎菌門(Chloroflexi)是自養(yǎng)型細(xì)菌，普遍存在于厭氧顆粒污泥中，包括在中溫和高溫條件下處理不同種類的有機(jī)廢物的厭氧反應(yīng)器。該菌主要利用不同碳水化合物及氨基酸來進(jìn)行自我生長，具有降解大分子有機(jī)物的能力，并能促進(jìn)污泥顆粒結(jié)構(gòu)的形成[16]。

圖4為試驗(yàn)期5組細(xì)菌總量的定量PCR含量圖，從圖中可知細(xì)菌總量與產(chǎn)氣量變化呈現(xiàn)對應(yīng)關(guān)系。苜蓿成分多，產(chǎn)氣反應(yīng)進(jìn)程快的A組與B組第5天細(xì)菌總量達(dá)到最大值，之后逐漸下降；而產(chǎn)氣反應(yīng)進(jìn)程比前者慢的C組與D組則在第9天細(xì)菌總量達(dá)到最大，如圖4，純柳枝稷的處理，細(xì)菌總量在第9天出現(xiàn)較高值，但前期一直沒有其他組合高，反而到30 d時(shí)才細(xì)菌量最高值。此外，30 d的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):純苜蓿A組細(xì)菌總量最少，各組隨著柳枝稷成分的提高,細(xì)菌總量也在增加。結(jié)合產(chǎn)氣變化、pH變化以及細(xì)菌總量可以發(fā)現(xiàn)，柳枝稷與苜蓿混合處理對發(fā)酵系統(tǒng)有利，在D組中，其pH變化溫和，細(xì)菌增殖活躍，產(chǎn)氣量多，厭氧反應(yīng)體系穩(wěn)定；純苜蓿雖然有利于細(xì)菌增殖，但產(chǎn)氣量不足；純柳枝稷雖然產(chǎn)氣量大，但反應(yīng)體系穩(wěn)定性較差。

圖4 柳枝稷與苜蓿不同含固率配比下細(xì)菌總量定量PCRFig.4 Quantitative PCR of total bacterial population in switchgrass and alfalfa under different solid content ratios

2.4 柳枝稷與苜蓿共發(fā)酵體系古菌的定量分析

利用本試驗(yàn)樣品中檢測到的4種優(yōu)勢甲烷菌-甲烷鬃毛菌(Mst)、甲烷桿菌(MBT)、甲烷八疊球菌(Msc)及甲烷微菌(MMB)的16S rDNA為模板，對本試驗(yàn)的5個(gè)試驗(yàn)組的樣品進(jìn)行了定量PCR(Q-PCR)分析，結(jié)果如圖5所示?？梢姡焊鱾€(gè)組合中總體數(shù)量上，甲烷鬃毛菌(Mst)絕對優(yōu)勢；其次是甲烷桿菌(MBT)和甲烷八疊球菌(Msc)；最少的是甲烷微菌(MMB)。

圖5 柳枝稷與苜蓿不同含固率配比下產(chǎn)甲烷古菌定量PCRFig.5 Quantitative PCR of methanogenic archaea of switchgrass and alfalfa under different solid content ratios

甲烷鬃毛菌是一類專營性嗜乙酸型古菌，以乙酸為唯一底物進(jìn)行物質(zhì)能量代謝[17]。其占優(yōu)勢說明本試驗(yàn)中各處理均是以嗜乙酸產(chǎn)甲烷途徑為主要的產(chǎn)甲烷途徑，甲烷鬃毛菌底物的親和性是甲烷八疊球菌的5～10倍，而且甲烷鬃毛菌屬是中溫厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌群[18]。在共發(fā)酵的5個(gè)組中甲烷鬃毛菌的總體趨勢基本一致，為先增加后減少，最后在發(fā)酵結(jié)束時(shí)數(shù)量基本恢復(fù)到原始污泥中的水平甚至更低，可以推測甲烷鬃毛菌的盛衰與底物中可利用有機(jī)物的量同步，可見本研究的底物和發(fā)酵條件與甲烷鬃毛菌有高度的親和性。相對于原始污泥中，A、B、C、D、E 5組的甲烷鬃毛菌數(shù)量最大值，分別增長了70%、101%、42%、62%、35%。苜蓿含量多的處理，產(chǎn)氣進(jìn)程快，甲烷鬃毛菌相應(yīng)的在前期數(shù)量增長較快；而柳枝稷含量多的配比，產(chǎn)氣進(jìn)程慢，甲烷鬃毛菌數(shù)量的增長則相對延遲，有研究表明，厭氧發(fā)酵過程中約70%的甲烷產(chǎn)量來自嗜乙酸型產(chǎn)甲烷菌[19]。甲烷桿菌是一類重要的嗜氫產(chǎn)甲烷菌，其在厭氧發(fā)酵過程中的總體趨勢與甲烷鬃毛菌基本一致，前期增加快后迅速降低，最后數(shù)量接近原始污泥中。而總量比甲烷鬃毛菌少得多。A、B、C、D、E 5組的甲烷桿菌數(shù)量最大值，分別是原始污泥數(shù)量的5.24、5.14、5.86、6.14、2.51倍。甲烷八疊球菌的數(shù)量變化趨勢與甲烷鬃毛菌和甲烷桿菌不同，在整個(gè)發(fā)酵反應(yīng)進(jìn)程中，數(shù)量逐漸增加，后期比前期多，與原始污泥相比，5組的發(fā)酵后期甲烷八疊球菌的數(shù)量出現(xiàn)了較大的增長，相對數(shù)量雖然增加很多，但在甲烷菌群總量的比例卻比較少。甲烷微菌是一種嗜氫型產(chǎn)甲烷菌，只能利用二氧化碳作為唯一碳源，利用氫氣或甲酸鹽為電子供體還原，而不能利用乙酸[20]。甲烷微菌的數(shù)量變化趨勢與甲烷八疊球菌相似，前期相對增殖緩慢，發(fā)酵后期逐漸增加，但增殖量卻不像甲烷八疊球菌那么劇烈。甲烷八疊球菌和微菌，常常在反應(yīng)體系相對處于逆境時(shí)表現(xiàn)相對數(shù)量增加，而本研究中未出現(xiàn)這兩者突然增殖的現(xiàn)象，說明本研究的原料組合及反應(yīng)條件對甲烷菌比較適合，并且本研究的累積甲烷產(chǎn)量高于大多數(shù)同類以柳枝稷為原料的試驗(yàn)數(shù)據(jù)也證明這一點(diǎn)。

表5為產(chǎn)甲烷量與不同產(chǎn)甲烷菌的相關(guān)性分析結(jié)果。表中可知產(chǎn)甲烷量與甲烷桿菌(MBT)在P<0.01 呈極顯著正相關(guān)，與甲烷鬃毛菌呈正相關(guān)，與甲烷微菌(MMB)，甲烷八疊球菌(Msc)呈負(fù)相關(guān)，以上相關(guān)系數(shù)分別為0.577、0.349、-0.365、-0.202，以上與前文中甲烷鬃毛菌的富集有利于產(chǎn)氣量的提升，這與此相關(guān)性分析結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

目前，已經(jīng)有大量的研究探討了含纖維素原料與牛糞的共發(fā)酵。本研究中柳枝稷與苜蓿共發(fā)酵30 d的日甲烷量變化均出現(xiàn)三峰趨勢，總體由高逐漸下降。這與Zhao等[21]的結(jié)果類似，A、B、C、D、E 5個(gè)組的累計(jì)產(chǎn)甲烷量分別達(dá)到291.7、287.7、320.3、357.4、362.2 mL/g VS，此均高于Zheng等[8]柳枝稷與牛糞在產(chǎn)氣最高產(chǎn)甲烷量(158.6 mL/g VS)。其比ünyay等[4]用成熟干燥的柳枝稷為材料的甲烷產(chǎn)量(203.9 mL/g VS)高出77.6%。與柳枝稷的理論甲烷產(chǎn)量442.8 mL/g VS相比，本研究中E組的最高產(chǎn)甲烷量為理論值的81.8%。該產(chǎn)甲烷率在柳枝稷的厭氧發(fā)酵文獻(xiàn)中罕見。應(yīng)該可以指出，能夠獲得如此高的甲烷產(chǎn)量，與本研究的柳枝稷原料取自正在生長中的綠色樣品有關(guān)，樣品可溶性物質(zhì)含量較大，C/N也比較低(42)。結(jié)合上述產(chǎn)氣量和表1的C/N數(shù)據(jù)可見在C/N21～42均能得到較高的產(chǎn)氣量。ünyay等[4]指出干燥的柳枝稷C/N120，厭氧發(fā)酵時(shí)即使與大量的活性污泥混合也仍表現(xiàn)出養(yǎng)分不足。因此，柳枝稷中配比苜蓿共發(fā)酵其產(chǎn)氣效率在一定范圍內(nèi)優(yōu)于糞便、污泥等物料的混合發(fā)酵，本試驗(yàn)結(jié)果證明高碳作物與高氮作物的共發(fā)酵可以為遠(yuǎn)離牧區(qū)的地區(qū)以純植物為原料的沼氣工程解決發(fā)酵體系營養(yǎng)平衡問題提供重要途徑。

表5 產(chǎn)甲烷量與不同產(chǎn)甲烷菌相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis between methane production and different methanogens

另外，在柳枝稷與苜蓿共發(fā)酵中，原始污泥中的微生物多樣性最高，共發(fā)酵可以降低發(fā)酵體系的多樣性，這是因?yàn)榘l(fā)酵使得優(yōu)勢菌群大量富集，相對降低了其他菌群的豐度，此與賈述飛[22]的觀點(diǎn)一致。發(fā)酵體系中細(xì)菌主要有6個(gè)門，其中最優(yōu)勢菌門為擬桿菌門與厚壁菌門，這與喬江濤等[23]的研究相似，在含有纖維素的物料中，擬桿菌門與厚壁菌門，一般為主要的菌門。不同的是，除優(yōu)勢菌門以外的其他菌門不同，可能的原因是發(fā)酵條件與物料不同。古菌方面，5個(gè)組中甲烷鬃毛菌為絕對優(yōu)勢古菌，其含量遠(yuǎn)大于其他菌種，有研究表明，當(dāng)乙酸的濃度高于0.25～0.5 g/L時(shí)，同為嗜乙酸甲烷菌的甲烷八疊球菌將會(huì)成為優(yōu)勢菌群，本試驗(yàn)中，乙酸濃度一直維持于較小的水平，所以此時(shí)甲烷鬃毛菌含量較高，這與Luo等[24]、閆晶等[25]的研究一致，因此可以得出，柳枝稷、苜蓿共發(fā)酵菌群情況與牛糞、秸稈共發(fā)酵的菌群情況較為相近，不同的是牛糞發(fā)酵可以顯著增加發(fā)酵體系菌群的總量，但從產(chǎn)氣效率來看，柳枝稷與苜蓿共發(fā)酵菌群方面較為穩(wěn)定。

通過研究和對比柳枝稷與苜蓿5組不同含固率配比的共發(fā)酵，本研究主要結(jié)論如下：

1)以新鮮柳枝稷和苜蓿為原料的批次厭氧發(fā)酵，5個(gè)組均在前15 d釋放出總產(chǎn)氣量的96%以上；

2)雖然純柳枝稷的累積產(chǎn)氣量最高，但其發(fā)酵系統(tǒng)發(fā)酵過程中pH偏低，D組(柳枝稷和苜蓿TS配比為3∶1)在緩沖能力和體系穩(wěn)定性最優(yōu)；

3)甲烷鬃毛菌為發(fā)酵體系微生物群的絕對優(yōu)勢菌群，說明柳枝稷與苜蓿厭氧共發(fā)酵是較優(yōu)越的厭氧發(fā)酵體系。

因此，柳枝稷與苜蓿厭氧共發(fā)酵可推薦作為無動(dòng)物糞污地區(qū)高纖維原料厭氧發(fā)酵的新有效途徑。