混合青貯微生物多樣性研究進(jìn)展

宗亞倩， 韓 博， 段新慧， 周 凱， 何承剛， 姜 華

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 云南 昆明 650201)

青貯作為一種保存飼料的手段已有3 000多年的歷史，是常見的保存牧草的方法，可以減少牧草損耗，保障青綠飼料全年平衡供應(yīng)[1-5]。隨著我國北方草地退化，土地沙漠化程度擴(kuò)大，飼料短缺成為限制畜牧業(yè)發(fā)展的主要因素[6]。許多學(xué)者因地制宜，利用一些非常規(guī)飼料資源(如農(nóng)作物秸稈、糧經(jīng)副產(chǎn)物、輕工業(yè)生產(chǎn)的副產(chǎn)品等)進(jìn)行生產(chǎn)混合青貯飼料，不僅可以發(fā)展節(jié)糧型畜牧業(yè)，還能緩解飼草原料短缺帶來的壓力，這也是當(dāng)今世界飼料發(fā)展的一種趨勢[7-8]?；旌锨噘A是將兩種或兩種以上原料混合在一起，利用乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)發(fā)酵來實(shí)現(xiàn)長期保存青綠飼料的一種存貯方式[9-10]。其通過原料之間的互補(bǔ)作用，來增加有益微生物數(shù)量或抑制不良發(fā)酵，進(jìn)而提高青貯品質(zhì)[11-12]?；旌锨噘A作為一種貯存技術(shù)，具有延長飼料儲存時(shí)間、調(diào)節(jié)水分和糖分、增加原料的利用價(jià)值、調(diào)整飼料供應(yīng)時(shí)期、提高飼草消化率和動物適口性等優(yōu)點(diǎn)。從擴(kuò)大資源利用率、減少環(huán)境污染、提高農(nóng)副產(chǎn)品的附加值等角度來看，混合青貯十分必要[7]。

青貯飼料擁有一個(gè)復(fù)雜的微生物體系，主要由原料表面附著微生物、發(fā)酵微生物和腐敗微生物參與[13]。對于混合青貯飼料而言，良好的微生物發(fā)酵環(huán)境是調(diào)制成高品質(zhì)青貯飼料的關(guān)鍵，微生物群落組成及其動態(tài)演替直接影響發(fā)酵品質(zhì)[14]。現(xiàn)有研究表明，在可能影響青貯發(fā)酵的眾多因素中，微生物類型通常決定了青貯飼料的最終質(zhì)量[15-16]。因此，為更好預(yù)防青貯飼料品質(zhì)下降，本文就青貯飼料發(fā)酵過程中的微生物群落及演替過程進(jìn)行詳細(xì)闡述，分析混合青貯飼料中優(yōu)勢微生物組成，闡明影響混合青貯微生物多樣性的原因，為調(diào)制優(yōu)質(zhì)的混合青貯飼料提供科學(xué)依據(jù)。

1 青貯微生物群落組成與演替過程

青貯是各種微生物共同作用的結(jié)果[17-18]，而參與發(fā)酵的微生物主要來源于牧草表面附著的微生物，其在青貯發(fā)酵過程中具有重要作用。附著的微生物中除了有促進(jìn)青貯飼料發(fā)酵的乳酸菌外，還有引起青貯腐敗變質(zhì)的微生物，主要有梭菌屬(Clostridium)、醋酸菌(Acetobacter)、酵母菌、霉菌等[19]。植物表面環(huán)境的特殊性，使得植物表面附著的微生物種類和數(shù)量隨植物生長環(huán)境的不同存在顯著差異[20-22]。但是一般來說，這些青貯原料一旦進(jìn)行密封青貯后，其在發(fā)酵和貯藏過程中發(fā)生生理生化和微生物菌群的變化大致相似。如表1所示，在青貯發(fā)酵過程中微生物種類和數(shù)量是呈動態(tài)變化的，通常青貯原料表面附著的好氧細(xì)菌、腸桿菌、酵母菌和霉菌等微生物數(shù)量較多。在開始時(shí)，青貯環(huán)境中還有氧氣的存在，這時(shí)好氧細(xì)菌生長旺盛。同時(shí)，球狀的鏈球菌(Streptococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)和片球菌(Pediococcus)也在活動，進(jìn)行乳酸發(fā)酵后，乳酸菌開始大量增殖并產(chǎn)生乳酸，其后隨著厭氧和酸性環(huán)境的形成，好氧的和不耐酸的微生物逐漸減少，逐漸被乳桿菌(Lactobacillus)和片球菌共同取代，成為乳酸發(fā)酵的優(yōu)勢菌[23-26]。Ennahar等[27]發(fā)現(xiàn)，在青貯飼料發(fā)酵早期主要的優(yōu)勢菌群為片球菌，糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)和腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，隨后被乳桿菌、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)和布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)等更耐酸的乳酸菌代替。在籽粒莧(Amaranthushypochondriacus)與全株玉米(Zeamays)混合青貯前后微生物種類和數(shù)量的研究中發(fā)現(xiàn)，其微生物也存在這樣的演替規(guī)律，在新鮮樣品中以乳酸球菌的腸球菌(Enterococcus)、乳球菌(Lactococcus)、類腸膜明串珠菌(Leuconostoc)為優(yōu)勢菌群。經(jīng)過青貯發(fā)酵后，乳酸桿菌演替為優(yōu)勢菌群，并且經(jīng)青貯發(fā)酵乳酸菌數(shù)量增加，大腸桿菌和霉菌消失，而酵母菌數(shù)量變化較小[28]。蔣慧[29]將駱駝刺(AlhagisparsifoliaShap.)與紫花苜蓿(MedicagosativaL.)按不同比例進(jìn)行混合，比較混貯前后乳酸菌和酵母菌總數(shù)的變化，發(fā)現(xiàn)青貯后乳酸菌數(shù)量顯著高于青貯原料，酵母菌數(shù)量顯著低于青貯原料。在青貯發(fā)酵過程中，原料本身的營養(yǎng)成分是保證飼料發(fā)酵成功的重要部分。但是，微生物的群落結(jié)構(gòu)及其演替過程也同樣重要，所以了解這些信息可有效調(diào)控青貯飼料的發(fā)酵過程，為調(diào)制優(yōu)質(zhì)的青貯飼料提供技術(shù)支持。

表1 青貯發(fā)酵過程不同微生物菌群變化[23-26]Table 1 Changes of microbial communities during silage fermentation[23-26]

2 混合青貯微生物多樣性

有些原料因自身種類、含水量、化學(xué)成分等原因，常規(guī)青貯難以調(diào)制成優(yōu)質(zhì)青貯飼料，必須要與其他原料混合青貯才能達(dá)到發(fā)酵條件?；旌锨噘A可調(diào)和水分、提升營養(yǎng)價(jià)值、改善適口性和提高發(fā)酵品質(zhì)等，其常見原料包括常規(guī)牧草，各種飼料作物以及農(nóng)、輕工業(yè)副產(chǎn)物等(米糠、甜菜渣、麥麩、各種酒糟以及水果渣等)。目前研究集中在單一青貯中微生物活動特性上[30]，而對于混合青貯對發(fā)酵體系內(nèi)微生物的影響報(bào)道較少，混合青貯如何通過改變微生物特性提高青貯成功率尚不明晰。

2.1 高蛋白飼草與高糖類飼草混合青貯

禾本科牧草水溶性碳水化合物含量高、緩沖能低，蛋白質(zhì)含量少，單獨(dú)青貯往往致青貯營養(yǎng)品質(zhì)不佳。像紫花苜蓿這樣的豆科牧草因水溶性碳水化合物含量低，蛋白質(zhì)含量和緩沖能高，單獨(dú)青貯較難成功，常常會導(dǎo)致梭菌等有害微生物活動旺盛[31]。但是將其與禾本科牧草進(jìn)行混合青貯，兩者互補(bǔ)可達(dá)到較好的青貯效果[32-33]。青貯過程中微生物群落變化，可能是導(dǎo)致青貯質(zhì)量差異的關(guān)鍵因素，對此學(xué)者們對豆科牧草與禾本科牧草混合青貯中的微生物群落組成進(jìn)行了深入的研究。張朝陽[34]用富含蛋白質(zhì)的草木樨(MelilotussuavcolenL.)分別與青綠玉米、玉米秸稈和小麥(TriticumaestivumL.)秸稈混合青貯，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢微生物組成和豐富度各不相同，與青綠玉米混合青貯主要以乳桿菌屬為主；與玉米秸稈混合青貯主要是以魏斯氏菌屬(Weissella)為主；而與不同比例的小麥秸稈混合青貯優(yōu)勢菌不同，以克雷伯氏菌屬(Klebsiella)或植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)屬為主。一般來說，禾本科牧草的水分和自帶的微生物種類不同，進(jìn)而導(dǎo)致混合青貯飼料優(yōu)勢菌不同。飼用大豆(Glycinemax)分別與玉米和高粱(Sorghum)混合青貯后，乳酸菌和魏斯氏菌屬是所有青貯樣品的優(yōu)勢菌[35]。Li等[36]在三葉草與多花黑麥草(LoliummultiflorumL.)混合青貯中發(fā)現(xiàn)乳桿菌為其優(yōu)勢菌，其次為片球菌和芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus)。紫花苜蓿與全株玉米以不同比例混合青貯，細(xì)菌群落發(fā)生改變，當(dāng)玉米從0%增加到40%時(shí)，乳桿菌的相對豐度增加，根瘤菌(Rhizobium)和甲基桿菌(Methylobacterium)數(shù)量減少，混合全株青貯玉米后可以增加啟動發(fā)酵的優(yōu)勢菌的相對豐度[37]；在紫花苜蓿與甜高粱(Sweetsorghum)不同比例混合青貯中分離出19株乳酸菌，分別是鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、植物乳桿菌、耐久腸球菌(Enterococcusdurans)、腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leuconstocmesenteroidessubsp.mesenteroides)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)[38]。將富含蛋白質(zhì)的構(gòu)樹(Broussonetiapapyrifera)與多年生黑麥草(LoliumperennL.)進(jìn)行混合青貯，能夠提升乳桿菌和魏斯氏菌等有益微生物在整個(gè)青貯發(fā)酵過程中的主導(dǎo)地位，減少腸桿菌的數(shù)量，為反芻動物的可持續(xù)生產(chǎn)提供良好的飼草資源[39]。

用富含蛋白質(zhì)的牧草與富含可溶性碳水化合物的飼料進(jìn)行混合青貯，可以提升營養(yǎng)成分，更有利于有益微生物的生長繁殖。雖然同一混合青貯類型微生物組成存在差異，整體來說，混合青貯可以更好地保存飼料營養(yǎng)價(jià)值。

2.2 高水分青貯原料與干飼料混合青貯

在農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)與加工過程中會有大量秸稈、尾菜、酒糟、薯渣、果渣等農(nóng)副產(chǎn)品和輕工業(yè)副產(chǎn)品生成。大多數(shù)的農(nóng)副產(chǎn)品纖維素含量高，營養(yǎng)品質(zhì)差，含水量低。而多數(shù)的輕工業(yè)副產(chǎn)品正好與之相反，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，蛋白質(zhì)含量高，是優(yōu)質(zhì)的粗飼料來源，但是含水量高，不易單獨(dú)青貯。高水分青貯往往面臨出水流失和梭狀芽孢桿菌發(fā)酵的高風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致大量干物質(zhì)損失、蛋白質(zhì)分解嚴(yán)重、丁酸產(chǎn)量高，從而降低飼料消化率、氮利用率和家畜的采食量[40-41]。將這兩者混合青貯可以互相彌補(bǔ)彼此的不足，調(diào)節(jié)微生物族群，減少不良微生物的豐度，提高發(fā)酵質(zhì)量[42]。如在稻草與黑麥草混合青貯過程中優(yōu)勢菌主要有植物乳桿菌、類腸膜魏斯氏菌(W.paramesenteroides)、食竇魏斯氏菌(W.cibaria)、短乳桿菌，隨著青貯時(shí)間延長，優(yōu)勢菌數(shù)量下降[43]。李夢玉[44]從不同發(fā)酵時(shí)間的玉米秸稈與廢棄白菜(Brassicapekinensi)混合青貯的飼料中，檢測出腸桿菌(Enterobacter)、乳桿菌、肉食桿菌(Carnobacterium)、假單胞桿菌(Pseudomonas)、泛菌(Pantoea)、明串珠菌等近27個(gè)細(xì)菌屬。但并不是所有玉米秸稈和白菜混貯飼料中優(yōu)勢菌都是相同的，李志忠等[45]從中分離得到優(yōu)勢菌群卻是植物乳桿菌、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、類干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)和短乳桿菌，混貯發(fā)酵體系中的乳酸桿菌較乳酸球菌豐富。戚如鑫[46]發(fā)現(xiàn)稻草與白菜尾菜混合青貯后的優(yōu)勢屬主要有乳桿菌屬、明串珠菌屬、腸桿菌屬、乳球菌屬(Lactococcus)、短小桿菌屬(Curtobacterium)、克雷伯氏菌屬、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、根瘤菌屬(Rhizobium)等。任海偉等[47]將白酒糟和菊芋渣(HelianthustuberosusL.)進(jìn)行混合發(fā)酵，通過高通量測序技術(shù)解析發(fā)酵微生物菌群多樣性發(fā)現(xiàn)，混合發(fā)酵以厚壁菌門乳桿菌屬細(xì)菌為主。王聰[48]將甜高粱秸稈和酒糟混合青貯發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬和片球菌屬為屬水平優(yōu)勢菌。Ren等[49]在玉米秸稈與甘藍(lán)(BrassicaoleraceavarcapitataL.)廢棄物的混合青貯飼料中發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌和明串珠菌為優(yōu)勢乳酸菌，在混合青貯過程中抑制了腸桿菌科、假單胞菌、黃桿菌和泛菌等不良微生物的生長。玉米與蕎麥(Fagopyrumesculentum)混合青貯飼料中，優(yōu)勢菌群有假單細(xì)胞菌屬、乳桿菌屬、泛菌屬、鏈霉菌屬(Streptomyces)、魏斯氏菌屬、明串珠菌屬、貪銅菌屬(Cupriavidus)、乳球菌屬、腸桿菌屬、沙雷菌屬(Serratia)[50]。高水分玉米莖稈和柱花草(StylosanthesguianensisSw.)與洋紫荊(BauhiniavariegateL.)花莖混合青貯后細(xì)菌多樣性增加，腸桿菌和梭菌的相對豐度降低，乳桿菌、威瑟拉菌和腸球菌等產(chǎn)乳酸細(xì)菌的相對豐度增加[51]。

3 混合青貯微生物多樣性影響因素

3.1 混合比例和原料對微生物的影響

在青貯發(fā)酵過程中，微生物主要來自青貯原料表面天然微生物群落。微生物菌群因飼料作物的特性以及環(huán)境條件的不同，使得飼草本身附著微生物群落結(jié)構(gòu)有著顯著的差異[34,52]，因此不同混合比例、不同青貯原料的青貯發(fā)酵體系中微生物結(jié)構(gòu)也各不相同。

就混合比例而言，兩種青貯原料參與青貯的比例不同，一方面會改變整個(gè)青貯體系中優(yōu)勢菌群的豐度，另一方面會改變青貯原料的營養(yǎng)成分。這些改變都會引起混合青貯飼料中微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。商振達(dá)等[50]以全株蕎麥與全株玉米為青貯原料進(jìn)行混合青貯，發(fā)現(xiàn)兩者以不同比例進(jìn)行混合青貯60 d后，優(yōu)勢菌屬和豐度值均發(fā)生改變。李茂雅等[53]在探究皇竹草(PennisetumsineseRoxb)與茅臺酒糟不同混合比例對微生物多樣性的影響中發(fā)現(xiàn)，兩者混合青貯后優(yōu)勢菌屬雖均為乳桿菌屬，但是隨著茅臺酒糟混合比例的降低，青貯飼料中乳桿菌屬的相對豐度逐漸增高，在90%皇竹草+10%茅臺酒糟青貯中，乳桿菌屬相對豐度最高。

由此可以看出，兩種原料按不同比例進(jìn)行混合青貯，青貯體系中微生物的組成和豐度值會產(chǎn)生較大的改變，引起這些變化的原因可能與原料本身的含水量、可溶性糖以及有益菌豐度等密切相關(guān)。

從青貯原料來看，不同植物由于表面微環(huán)境的特殊性，附生或寄生于植物表面的微生物群體存在一定差異，與不同原料進(jìn)行混貯后微生物多樣性也會隨之發(fā)生改變。Ni等[35]分析了飼用大豆與玉米、高粱混合青貯對微生物群落的影響，結(jié)果表明，乳桿菌和魏斯氏菌雖是所有青貯樣品中的優(yōu)勢微生物，但它們的相對豐度各不相同，且飼用大豆+高粱所有青貯中乳桿菌的豐富度均高于飼用大豆+玉米青貯。將紫花苜蓿與全株青貯玉米進(jìn)行混合青貯后，細(xì)菌群落主要由乳酸桿菌、威塞拉菌和片球菌組成[54]。韓吉雨等[55]在探究苜蓿和玉米青貯中得出的結(jié)論是原料表面附著的細(xì)菌貫穿整個(gè)發(fā)酵過程，說明原料本身附著的微生物對青貯微生物多樣性影響很大。

3.2 青貯時(shí)間對微生物多樣性的影響

同一飼料不同發(fā)酵時(shí)期微生物種類和豐富度是處在一個(gè)不斷變化的狀態(tài)，青貯前、貯藏期以及開窖之后差異顯著。孫安琪[56]證實(shí)了白酒糟原料附著的細(xì)菌主要是乳桿菌、伯克氏菌(Burkholderia)、不動桿菌(Acinetobacter)、志賀氏菌(Shigella)等，菊芋渣原料附著的主要是乳桿菌，兩者混合青貯10 d時(shí)，優(yōu)勢細(xì)菌以乳桿菌和芽孢桿菌屬為主，30和60 d時(shí)，優(yōu)勢細(xì)菌均以乳桿菌屬為主，且隨著青貯時(shí)間的延長乳桿菌豐富度不斷增加。劉蓓一等[57]以稻草秸稈和多花黑麥草為青貯原料，以不同比例進(jìn)行混合青貯，觀察了其不同發(fā)酵時(shí)期青貯微生物的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)不同青貯時(shí)期乳酸菌、酵母菌和霉菌數(shù)量不同且隨著青貯時(shí)間延長，優(yōu)勢菌數(shù)量下降。盧強(qiáng)等[58]分析了紫花苜蓿不同發(fā)酵時(shí)期的微生物群落，發(fā)現(xiàn)同樣規(guī)律，在發(fā)酵初期乳球菌屬和腸球菌屬發(fā)揮主要作用，在發(fā)酵后期，乳酸桿菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬占主導(dǎo)優(yōu)勢，并且腸桿菌屬及霉菌等數(shù)量減少，乳球菌屬、腸球菌屬、乳酸桿菌屬等在不同階段的豐度值有較大區(qū)別。青貯發(fā)酵是微生物動態(tài)變化的過程，在發(fā)酵過程中微生物會產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物[59]，使整個(gè)青貯環(huán)境的發(fā)生改變，微生物為適應(yīng)當(dāng)時(shí)環(huán)境，在種類和數(shù)量上隨之改變。

4 存在的問題與展望

近年來隨著我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，飼料供應(yīng)不足已成為限制畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素?；旌锨噘A飼料因其營養(yǎng)全面，原料來源廣，逐漸被大家所認(rèn)知并成為研究熱點(diǎn)。目前，關(guān)于混合青貯的研究主要集中在混合青貯對發(fā)酵品質(zhì)及微生物多樣性的影響，對于乳酸菌抗菌性研究、混合青貯飼料的推廣利用以及對動物生產(chǎn)性能研究仍存在不足之處。

4.1 乳酸菌抗菌性研究

乳酸菌廣泛用應(yīng)于食品、醫(yī)療和養(yǎng)殖等多個(gè)領(lǐng)域中，是公認(rèn)的安全級微生物，在人和大多數(shù)動物腸道內(nèi)都有存在，具有抑制細(xì)菌和真菌的特性。研究表明乳酸菌代謝產(chǎn)物具有較廣的抑菌作用，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等都有很好的抑制作用，能減緩有害微生物生長速度、延長微生物停滯期、減少微生物成活數(shù)量，增強(qiáng)免疫力和保護(hù)機(jī)體的作用[60-62]。目前，對于乳酸菌抗菌性的研究主要集中在泡菜、冷鮮豬肉等食品中，而關(guān)于混合青貯中乳酸菌抗菌活性的研究較少，從不同地域和不同混合青貯飼料中篩選具有抑菌活性的乳酸菌并研究其抑菌機(jī)理將會成為未來研究的重要方向。

4.2 混合青貯推廣

混合青貯可以實(shí)現(xiàn)原料互補(bǔ)，提高青貯品質(zhì)，增加有益微生物數(shù)量，降低飼養(yǎng)成本，獲得優(yōu)質(zhì)畜產(chǎn)品，緩解飼料短缺帶來的壓力，具有很大的開發(fā)潛力。由于非常規(guī)飼料資源存在季節(jié)性、分布不集中、產(chǎn)業(yè)化程度低等因素的影響，使之推廣利用程度比較低。目前，非常規(guī)飼料資源的各種性能沒有得到全面的開發(fā)和利用，今后應(yīng)關(guān)注糧經(jīng)副產(chǎn)物集中回收管理與利用、混合青貯配比技術(shù)研究，為混合青貯飼料的科學(xué)合理利用提供理論依據(jù)。

4.3 混合青貯對動物生產(chǎn)性能研究

青貯飼料在反芻動物養(yǎng)殖中起到不可或缺的作用。近年來，隨著混合青貯飼料的興起，學(xué)者們進(jìn)行了廣泛的關(guān)于動物生產(chǎn)性能的研究，如日增重、產(chǎn)奶量、飼料轉(zhuǎn)化率以及產(chǎn)蛋、乳量。未來應(yīng)進(jìn)一步關(guān)注混合青貯微生物群落變化對動物瘤胃微生物的影響，如何促進(jìn)動物生長、調(diào)控腸道健康、改善奶制品和肉制品質(zhì)量的具體作用機(jī)理以及不同生長階段混合青貯飼料的合理喂養(yǎng)量等方面的研究，為混合青貯飼料利用提供一定的理論基礎(chǔ)。