微小RNA-16 對急性心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響及其機(jī)制研究

賴震宇，趙展慶，余秉昌，蔡秋燕，林奇棟

急性心肌梗死（AMI）是一種以冠狀動脈閉塞導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺氧和死亡為特征的疾病[1]。微小RNA（miR）是治療心血管疾病的新靶點(diǎn)[2-3]。已經(jīng)在缺血、缺氧的心臟和心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了miR 的異常表達(dá)[4]。miR-16 可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡來加重心肌缺血損傷[5]。在AMI中，抑制miR-16 可保護(hù)大鼠心臟免受缺血性損傷[6]，表明miR-16 可能是挽救缺血性心肌的治療靶點(diǎn)。然而，miR-16 在AMI 中的作用機(jī)制尚不明確。miRNA 和信使RNA（mRNA）之間的相互作用在AMI 后的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，已經(jīng)在AMI患者中發(fā)現(xiàn)了競爭性內(nèi)源性RNA 網(wǎng)絡(luò)[7]。維甲酸受體相關(guān)孤核受體A（RORA）是維持心臟功能的關(guān)鍵保護(hù)劑，上調(diào)RORA 可抑制心肌細(xì)胞的缺氧損傷[8]。此外，RORA 可抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）介導(dǎo)的核因子κB（NF-κB）通路激活[9]。另有研究顯示，miR-16 是一種潛在的NF-κB 相關(guān)miRNA，在心肌梗死大鼠中NF-κB 的激活可上調(diào)miR-16 表達(dá)[10-11]。然而，在AMI中，RORA 是否介導(dǎo)miR-16與NF-κB 的激活還是未知。使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫（TargetScan、starBase、PicTar）搜索了miR-16 下游靶標(biāo)，預(yù)測顯示RORA 與miR-16 具有特定的結(jié)合位點(diǎn)，是miR-16 的潛在靶基因。我們推測miR-16的過表達(dá)可能是AMI 中RORA 低表達(dá)的原因，抑制miR-16 可能通過上調(diào)RORA 來預(yù)防AMI。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠80只，體質(zhì)量（200±20）g，購自濟(jì)南朋悅實驗動物繁殖有限公司，合格證號為SCXK（魯）20190003。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)：溫度（21±1）℃，濕度55%～60%，可自由獲取食物和水。

1.2 主要試劑與儀器

重組腺相關(guān)病毒血清型9（rAAV9）載體攜帶miR-16 抑制劑（rAAV9-anti-miR-16）基因和用于RORA沉默的短發(fā)夾RNA（shRNA）（rAAV9-sh-RORA）及相應(yīng)的陰性對照（rAAV9-anti-NC、rAAV9-sh-NC）、miR-16 模擬物（miR-16 mimic）及其陰性對照（miR-NC）購自上海GenePharm 公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液、核蛋白提取試劑盒購自北京Solarbio 公司；大鼠N 末端B 型利鈉肽原（NT-proBNP）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）ELISA 試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒和TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（綠色熒光）購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；兔源一抗B 細(xì)胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、NF-κB p65、RORA、TNF-α 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、組蛋白H3（Histone H3）購自英國Abcam 公司；兔源一抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、裂解的Caspase-3（cleaved-Caspase-3）購自美國Cell Signaling Technology 公司。動物心電圖系統(tǒng)（Nasiff Associates 公司，美國）；Vevo 2100超高分辨率小動物彩色多普勒超聲實時影像系統(tǒng)（VisualSonics 公司，加拿大）；iMark680 多功能酶標(biāo)儀（Bio-Rad 公司，美國）；BX51 電動顯微鏡（Olympus公司，日本）；ABI Prism?7500 型熒光定量PCR 儀（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國）。

1.3 AMI 大鼠模型的建立

將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham組，n=12）和造模組（n=68）。造模組大鼠采用左前降支（LAD）永久結(jié)扎法[12]建立AMI 模型。通過腹腔注射戊巴比妥鈉（60 mg/kg）來麻醉大鼠。在第四肋間打開胸腔，露出心臟。用6-0 尼龍縫線在距左耳尖2～3 mm 處結(jié)扎LAD。三導(dǎo)聯(lián)心電圖用于監(jiān)測心肌缺血開始時的心率以及典型的心電圖變化。結(jié)扎30 min 后觀察到心電圖ST 段明顯抬高和心肌紫紺，AMI 模型即成功建立[12]。為了降低大鼠的死亡率，在結(jié)扎后即可在心臟表面滴注（1～2 滴）和腹腔注射（0.1～0.2 ml）利多卡因以預(yù)防室性心律失常，并腹腔注射呋塞米（0.1～0.2 ml）以減輕心臟負(fù)荷[13]。然后，逐層縫合。sham 組大鼠不結(jié)扎冠狀動脈，其余操作同上。

1.4 分組與干預(yù)

取60 只造模成功大鼠隨機(jī)分為AMI 組、rAAV9-miR-16 抑制劑陰性對照組（rAAV9-anti-NC 組）、rAAV9-miR-16 抑制劑組（rAAV9-anti-miR-16 組）、rAAV9-miR-16抑制劑+RORA短發(fā)夾RNA的陰性對照組（rAAV9-anti-miR-16+sh-NC組）、rAAV9-miR-16抑制劑+RORA沉默組（rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組），每組12 只。rAAV9-anti-NC 組和rAAV9-anti-miR-16 組大鼠分別通過單次尾靜脈注 射200 μl 的rAAV9-anti-NC 和rAAV9-anti-miR-16（含1×1011個載體基因拷貝）[14]；rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組大鼠以相同的方法將rAAV9-anti-miR-16和rAAV9-sh-NC 共同注射到大鼠體內(nèi)，rAAV9-antimiR-16+sh-RORA 組大鼠以相同的方法和劑量注射rAAV9-anti-miR-16 和rAAV9-sh-RORA，sham組和AMI 組尾靜脈注射等體積的生理鹽水。單次尾靜脈注射，注射2 周后，進(jìn)行取材和相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.5 取材及指標(biāo)檢測

1.5.1 超聲心動圖檢測大鼠心功能

將所有大鼠麻醉并仰臥位固定以進(jìn)行經(jīng)胸超聲心動圖檢測，評估左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室短軸縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）。所有測量值均取自5 個連續(xù)心動周期的平均值。

1.5.2 ELISA 法檢測血清NT-proBNP 水平、CK-MB和LDH 活性

心功能檢測完成后，大鼠經(jīng)腹主動脈取血，靜置后以2 000×g 離心10 min，取血清。ELISA 法檢測血清NT-proBNP 水平、CK-MB 和LDH 活性。

1.5.3 TTC 染色檢測心肌梗死面積

每組隨機(jī)選取6 只大鼠，采集血樣后，迅速收集心臟組織。然后，將心臟組織冠狀面切成五片，用0.2% TTC 溶液快速染色。用數(shù)碼相機(jī)拍攝圖像并使用Image J 軟件進(jìn)行分析。心肌梗死面積百分比計算為白色面積（梗死區(qū)域）/總面積×100%。

1.5.4 HE 染色檢測心肌組織病理學(xué)變化

每組剩余6 只大鼠，取結(jié)扎線下方的左心室組織。將左心室組織冠狀切分為兩部分，一部分于-80℃保存；另一部分用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片厚5 μm，進(jìn)行常規(guī)HE 染色。于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。

1.5.5 TUNEL 染色檢測心肌組織中細(xì)胞凋亡

取心肌組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化后，添加TUNEL 染色溶液并在37℃下避光孵育60 min，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核10 min。封片，在熒光顯微鏡下觀察切片，并使用Image J 軟件計數(shù)TUNEL 陽性（TUNEL+，綠色熒光）細(xì)胞，計算細(xì)胞凋亡率（TUNEL+細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%）。每張切片隨機(jī)選取3 個視野進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.5.6 逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-qPCR）檢測心肌組織miR-16、RORA mRNA 和TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 表達(dá)水平

使用Trizol 試劑從心臟組織中分離總RNA 樣品。通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）。然后，在ABI Prism?7500 型熒光定量PCR 系統(tǒng)中擴(kuò)增cDNA。熱循環(huán)條件如下：95℃10 min，94℃ 15 s，60℃ 30 s 和72℃ 60 s，40 個循環(huán)。2-ΔΔCt方法計算靶基因的相對表達(dá)量，U6 和GAPDH 用于標(biāo)準(zhǔn)化。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5.7 免疫蛋白印跡（Western blot）法檢測心肌組織中蛋白表達(dá)

用放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液提取心肌組織總蛋白，并用核蛋白提取試劑盒提取核蛋白質(zhì)（用于檢測NF-κB p65 水平）。BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度后，將蛋白質(zhì)（30 μg）變性并通過10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜1 h。洗滌3 次后，將膜與一抗Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3、Bax，均以1: 500 稀釋；NF-κB p65、RORA、TNF-α、Histone H3，均以1: 1 000 稀釋；GAPDH，1: 2 000 稀釋在4℃下孵育過夜。然后將山羊抗兔IgG 二抗（HRP，1: 2 000）與膜在室溫下孵育1 h。使用電化學(xué)發(fā)光（ECL）系統(tǒng)檢測免疫反應(yīng)，并用Image J 軟件計算條帶灰度值。GAPDH、Histone H3 為內(nèi)參蛋白。

1.5.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/p>

miR-16 和RORA 的結(jié)合位點(diǎn)由StarBase（http://starbase.sysu.edu.cn/）預(yù)測。構(gòu)建重組熒光素酶報告載體psiCHECK-2，分別攜帶野生型（WT）或突變型（MUT）RORA 的3'-非翻譯區(qū)（3'UTR），命名為WT-RORA、MUT-RORA。使 用Lipofectamine 3 000 試劑將24 孔板中的HEK-293 細(xì)胞與熒光素酶報告載體（WT-RORA、MUT-RORA）和miR-16 mimic 或miR-NC共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后，用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)（Dual-Glo?）測量psiCHECK-2 載體的熒光素酶活性。海腎熒光素酶活性用作內(nèi)部對照，計算螢火蟲螢光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（表2）

表2 各組大鼠的心功能指標(biāo)比較（n=12，）

注：LVEDD：左心室舒張末期內(nèi)徑；LVESD：左心室收縮末期內(nèi)徑；LVEF：左心室射血分?jǐn)?shù)；LVFS：左心室短軸縮短分?jǐn)?shù)；rAAV9：重組腺相關(guān)病毒血清型9；RORA：維甲酸受體相關(guān)孤核受體A；miR：微小RNA。sham 組：假手術(shù)組；AMI 組：急性心肌梗死組；rAAV9-anti-NC 組：rAAV9-miR-16 抑制劑陰性對照組；rAAV9-anti-miR-16 組：rAAV9-miR-16 抑制劑組；rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組：rAAV9-miR-16 抑制劑+RORA短發(fā)夾RNA 的陰性對照組；rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組：rAAV9-miR-16 抑制劑+RORA 沉默的短發(fā)夾RNA 組。與sham 組相比*P＜0.05，與AMI 組、rAAV9-anti-NC 組相比△P＜0.05，與rAAV9-anti-miR-16 組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組相比▲P＜0.05

與sham 組相比，AMI 組大鼠LVEDD、LVESD 均顯著增大，LVEF、LVFS 均顯著下降（P均＜0.05）；與AMI組、rAAV9-anti-NC組相比，rAAV9-antimiR-16組大鼠LVEDD、LVESD均顯著減小，LVEF、LVFS均顯著升高（P均＜0.05）；與rAAV9-anti-miR-16組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組相比，rAAV9-antimiR-16+sh-RORA 組大鼠LVEDD、LVESD 顯著增大，LVEF、LVFS 均顯著下降（P均＜0.05）。

2.2 各組大鼠血清NT-proBNP水 平、CK-MB和LDH活性比較（圖1）

圖1 各組大鼠血清NT-proBNP 水平（1A）、CK-MB（1B）和LDH 活性（1C）比較（n=12）

與sham 組相比，AMI 組大鼠血清NT-proBNP 水平、CK-MB 和LDH 活性均顯著升高（P均＜0.05）；與AMI 組、rAAV9-anti-NC組相比，rAAV9-antimiR-16 組上述指標(biāo)水平均顯著降低（P均＜0.05）；與rAAV9-anti-miR-16組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC組相比，rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA組上述指標(biāo)水平均顯著升高（P均＜0.05）。

2.3 各組大鼠心肌梗死面積比較（圖2）

與sham 組相比，AMI 組大鼠心肌梗死面積百分比顯著升高（P＜0.05）；與AMI 組、rAAV9-anti-NC 組相比，rAAV9-anti-miR-16 組心肌梗死面積百分比均顯著降低（P均＜0.05）；與rAAV9-antimiR-16 組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC組相比，rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組心肌梗死面積百分比均顯著升高（P均＜0.05）。

2.4 各組大鼠心肌組織損傷比較（圖3）

圖3 HE 染色檢測各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變（n=6，比例尺：50μm）

HE 染色結(jié)果顯示，sham 組心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，心肌纖維排列整齊，無明顯水腫和炎性細(xì)胞浸潤；與sham 組相比，AMI 組和rAAV9-anti-NC 組大鼠可見心肌細(xì)胞排列紊亂、腫脹、數(shù)量減少，心肌纖維出現(xiàn)斷裂，炎性細(xì)胞浸潤明顯；與AMI 組和rAAV9-anti-NC 組相比，rAAV9-anti-miR-16組和rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組大鼠可見輕度心肌細(xì)胞水腫，少量心肌纖維斷裂，炎性細(xì)胞浸潤減少；與rAAV9-anti-miR-16 組和rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組相比，rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，炎性細(xì)胞浸潤增加，心肌損傷加重。

2.5 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較（圖4）

圖4 TUNEL 染色檢測大鼠心肌細(xì)胞凋亡（n=6）

TUNEL 染色結(jié)果顯示，與sham 組相比，AMI組大鼠心肌組織中綠色熒光標(biāo)記的TUNEL+細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與AMI組、rAAV9-anti-NC 組相比，rAAV9-anti-miR-16組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）；與rAAV9-antimiR-16 組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組相比，rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。

2.6 各組大鼠心肌組織miR-16、RORA mRNA 和TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 水平比較（圖5）

圖5 各組大鼠心肌組織miR-16（5A）、RORA mRNA（5B）、TNF-α mRNA（5C）、IL-6 mRNA（5D）水平比較（n=6）

與sham 組相比，AMI 組miR-16、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 水平均顯著升高，RORA mRNA水平顯著降低（P均＜0.05）；與AMI 組、rAAV9-anti-NC 組 相 比，rAAV9-anti-miR-16 組miR-16、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 水平均顯著降低，RORA mRNA 水平顯著升高（P均＜0.05）；與rAAV9-anti-miR-16 組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組相比，rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 水平均顯著升高，RORA mRNA 水平顯著降低（P均＜0.05）。

2.7 各組大鼠心肌組織Caspase-3、cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白水平比較（圖6）

與sham 組相比，AMI 組cleaved-Caspase-3/Caspase-3 比值、Bax 蛋白水平均顯著升高，Bcl-2 蛋白水平顯著降低（P均＜0.05）；與AMI 組、rAAV9-anti-NC 組相比，rAAV9-anti-miR-16 組cleaved-Caspase-3/Caspase-3 比值、Bax 蛋白水平顯著降低，Bcl-2 蛋白水平均顯著升高（P均＜0.05）；與rAAV9-anti-miR-16 組、rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組相比，rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA 組cleaved-Caspase-3/Caspase-3 比值、Bax 蛋白水平顯著升高，Bcl-2 蛋白水平均顯著降低（P均＜0.05）。

2.8 各組大鼠心肌組織RORA、TNF-α、NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平比較（圖7）

圖7 各組大鼠心肌組織RORA、TNF-α、NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平（n=6）

與sham 組相比，AMI 組RORA 蛋白水平顯著降低，TNF-α 和NF-κB p65 蛋白水平均顯著升高（P均＜0.05）；與AMI 組、rAAV9-anti-NC 組相比，rAAV9-anti-miR-16 組RORA 蛋白水平顯著升高，TNF-α 和NF-κB p65 蛋白水平均顯著降低（P均＜0.05）；與rAAV9-anti-miR-16 組、rAAV9-antimiR-16+sh-NC 組相比，rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA組RORA蛋白水平顯著降低，TNF-α 和NF-κB p65 蛋白水平均顯著升高（P均＜0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

2）采集套管氣的技術(shù)路線。對于正在生產(chǎn)的抽油井，回油干線的壓力稱為回壓。一般情況下，回壓取決于原油集輸系統(tǒng)的流動阻力。一旦建設(shè)完成原油集輸系統(tǒng)，回壓波動將是一個穩(wěn)定值Ph。

注：6A：蛋白電泳圖；6B：各組Caspase-3、cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)量比較。A：假手術(shù)組（sham 組）；B：急性心肌梗死組（AMI組）；C：rAAV9-miR-16 抑制劑陰性對照組（rAAV9-anti-NC 組）；D：rAAV9-miR-16 抑制劑組（rAAV9-anti-miR-16 組）；E：rAAV9-miR-16 抑制劑+RORA短發(fā)夾RNA的陰性對照組（rAAV9-anti-miR-16+sh-NC 組）；F：rAAV9-miR-16 抑制劑+RORA 沉默的短發(fā)夾RNA 組（rAAV9-anti-miR-16+sh-RORA組）。Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；cleaved-Caspase-3：裂解的Caspase-3；Bcl-2：B 細(xì)胞淋巴瘤/因子2；Bax：Bcl-2 相關(guān)X 蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；miR-16：微小RNA-16；rAAV9：重組腺相關(guān)病毒血清型9；RORA：維甲酸受體相關(guān)孤核受體A。與sham 組相比*P＜0.05；與AMI 組、rAAV9-anti-NC 組相比 △P＜0.05；與rAAV9-anti-miR-16 組、rAAV9-antimiR-16+sh-NC 組相比▲P＜0.05

2.9 miR-16 靶向調(diào)控RORA 表達(dá)（圖8）

圖8 靶基因預(yù)測和細(xì)胞熒光素酶活性結(jié)果

通過StarBase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測編碼RORA 的3'UTR mRNA 含有miR-16 的結(jié)合位點(diǎn)。

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-NC 相比，轉(zhuǎn)染miR-16 抑制劑后，含有WT-RORA 質(zhì)粒的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），含MUT-RORA 質(zhì)粒的細(xì)胞熒光素酶活性未受顯著影響（P＞0.05）。

3 討論

TNF-α 是一種促炎細(xì)胞因子，其介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的下游靶標(biāo)是NF-κB。心臟組織中TNF-α/NF-κB 激活被認(rèn)為是心肌梗死的標(biāo)志[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，病情嚴(yán)重且預(yù)后不良的AMI 患者NF-κB p65表達(dá)水平顯著增加，與AMI 發(fā)展和預(yù)后相關(guān)[16]。RORA 為心肌梗死的關(guān)鍵基因[8]。RORA 的缺乏會加劇高脂飲食引起的心肌肥大、纖維化和功能障礙[17]。重要的是，RORA 是一種炎癥調(diào)節(jié)劑，RORA 的缺失會導(dǎo)致IL-6 表達(dá)增強(qiáng)和NF-κB 核轉(zhuǎn)位[18]。相反，RORA 的過表達(dá)可以通過阻斷NF-κB p65 核轉(zhuǎn)位和調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白1（SIRT1）表達(dá)限制NF-κB p65在賴氨酸310 處的乙酰化來緩解體內(nèi)和體外脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥和器官損傷[19]。這些研究表明，RORA 在維持心肌細(xì)胞存活中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本研究結(jié)果顯示，缺血性心臟中RORA 表達(dá)降低，而miR-16 和NF-κB p65 核轉(zhuǎn)位均增加。在敲低miR-16后，RORA 上調(diào)，TNF-α 表達(dá)、NFκB p65 核轉(zhuǎn)位和心肌細(xì)胞凋亡均受到抑制。通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-16 包含RORA 的結(jié)合序列。由此猜想miR-16 和RORA 可能存在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。隨后的雙熒光素酶實驗顯示，miR-16 的過表達(dá)可降低WT-RORA 細(xì)胞的熒光素酶活性，證實miR-16 可靶向調(diào)控RORA。為了進(jìn)一步驗證miR-16 和RORA 的調(diào)控關(guān)系，本研究在敲低miR-16 的基礎(chǔ)上，采用小分子干擾技術(shù)下調(diào)RORA 表達(dá)，結(jié)果顯示下調(diào)RORA 可部分阻斷miR-16 敲低對AMI 大鼠心肌損傷的保護(hù)作用，證實了miR-16 可靶向負(fù)調(diào)控RORA。提示，miR-16 對心肌細(xì)胞的有害作用可能是由RORA 的下調(diào)賦予的。

miRNA 的生物學(xué)功能之一是一個miRNA 可以調(diào)節(jié)多個基因表達(dá)。除RORA外，許多凋亡相關(guān)基因已被證實是miR-16 的靶基因。例如，Cao 等[20]表明miR-16 可靶向調(diào)節(jié)蛋白酪氨酸磷酸酶非受體4型（PTPN4）影響缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和自噬；在阿爾茨海默病模型中，miR-16 的高表達(dá)可直接靶向和抑制Bcl-2 誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[21]。在本研究中，我們確定了RORA 作為miR-16 的直接靶基因，未研究其他潛在靶點(diǎn)，但不能排除所有已驗證的靶基因和miR-16 的其他潛在靶點(diǎn)可能參與其對心肌細(xì)胞的影響，這是本研究的局限性之一，在未來的研究中將結(jié)合體外細(xì)胞實驗對其作用機(jī)制進(jìn)行深入分析。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突