伊曲茶堿溶析結(jié)晶工藝

劉超， 張容容， 劉婷， 楊駟承， 劉建芳

(武漢輕工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 武漢 430023)

結(jié)晶技術(shù)在工業(yè)生產(chǎn)及科研中有著廣泛的應(yīng)用，是制藥工藝中一個(gè)至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，主要涉及固體藥物的分離和純化[1-3]。與液體藥物的制備過程相比，結(jié)晶工藝的設(shè)計(jì)和控制是復(fù)雜的，也是極其重要的。它不僅能夠提高藥物的收率和純度，還控制著藥物的固體形式(晶體粒度、粒度分布、晶型等)，這對藥品的加工、穩(wěn)定性和性能有著深遠(yuǎn)的影響[4-5]。目前制藥工藝中，溶液狀態(tài)結(jié)晶是最普遍的，但溶液狀態(tài)結(jié)晶的控制結(jié)果仍然具有挑戰(zhàn)性。結(jié)晶速率和結(jié)果取決于藥物的固有結(jié)晶趨勢、結(jié)晶參數(shù)等多種因素[6]。1996年美國食品藥品監(jiān)督管理局頒布了關(guān)于藥物使用過程中的規(guī)章制度，要求生產(chǎn)廠家必須提供有關(guān)藥物晶型、溶解度、顏色、純度、顆粒尺寸等數(shù)據(jù)[7]。至此，藥物結(jié)晶技術(shù)引起了國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注，并開展了大量相關(guān)的研究工作。Sharma等[8]探索了難溶性藥物替米沙坦在溶析結(jié)晶中的粒徑和形態(tài)的工藝參數(shù)。經(jīng)過工藝優(yōu)化，最終晶體尺寸控制在320 nm，使其溶解性和生物利用度顯著提升。趙改菊等[9]采取真空降溫結(jié)晶的方式，考察了真空度、攪拌速率等因素對葡萄糖酸鈣結(jié)晶的影響，優(yōu)化工藝后生產(chǎn)的產(chǎn)品的純度及品級均得到顯著的提高，對工業(yè)生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。王崔巖等[10]將陶瓷膜技術(shù)應(yīng)用于兩性霉素B的結(jié)晶工藝中，降低了結(jié)晶的難度，并且去除了大量雜質(zhì)，獲得了高質(zhì)量的兩性霉素B，為工業(yè)生產(chǎn)高品質(zhì)兩性霉素B提供了參考依據(jù)。

伊曲茶堿是全球首個(gè)上市的腺苷A2A受體抑制劑，主要用于帕金森病的治療，可明顯改善因長期服用多巴胺受體藥物導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥，對神經(jīng)系統(tǒng)也有一定的保護(hù)作用，因其良好的治療效果而受到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注[11]。藥物的純度、顆粒尺寸、溶解性、生物利用度等數(shù)據(jù)是藥物注冊申請時(shí)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。Kuroda等[12]采用混合研磨的方式制得了主粒徑不足50 μm的伊曲茶堿晶體，使伊曲茶堿的分散性、溶解性、生物利用度顯著提高。目前國內(nèi)外關(guān)于伊曲茶堿結(jié)晶工藝并沒有詳細(xì)文獻(xiàn)記載。現(xiàn)根據(jù)伊曲茶堿易溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)且難溶于水的特性，以DMF為溶劑，水為溶析劑，采取溶析結(jié)晶的方式，探究結(jié)晶過程中有關(guān)的影響因素。最終經(jīng)過優(yōu)化結(jié)晶工藝參數(shù)，獲得主粒徑為12.6 μm、粒度分布均勻的伊曲茶堿晶體產(chǎn)物，為工業(yè)上制備高質(zhì)量的伊曲茶堿產(chǎn)品提供基礎(chǔ)依據(jù)和參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

伊曲茶堿，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，湖北惠擇普醫(yī)藥科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，AR，體積分?jǐn)?shù)99%，天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水乙醇，AR，體積分?jǐn)?shù)99%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

夾套結(jié)晶器，鹽城壘固科技有限公司；高精度水銀溫度計(jì)，衡水創(chuàng)紀(jì)儀器儀表有限公司；低溫恒溫槽(DHC-1005-A)，杭州齊威儀器有限公司；磁力攪拌器(SCL-RTC+)，杭州齊威儀器有限公司；微量柱塞泵(DP-0502)，北京亞歐德鵬科技有限公司；激光粒度儀(Mastersizer 3000)，英國馬爾文儀器有限公司；掃描電子顯微鏡(JSM-6510LV)，日本電子株式會(huì)社。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置及實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 實(shí)驗(yàn)裝置

本次試驗(yàn)的結(jié)晶裝置如圖1所示。

圖1 伊曲茶堿結(jié)晶工藝裝置Fig.1 Experimental device for dilution crystallization of istradefylline

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

(1)配制一定濃度伊曲茶堿-DMF溶液，加入結(jié)晶器中，攪拌溶解。

(2)將養(yǎng)晶溫度設(shè)置為20 ℃，待溫度恒定時(shí)，用柱塞泵以2 mL/min速率滴加溶析劑(去離子水)。

(3)滴加完畢，靜置60 min，將結(jié)晶母液抽濾，濾餅用無水乙醇淋洗，放入烘箱中，60 ℃真空干燥5 h，稱重，密封保存。

(4)改變結(jié)晶條件，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)步驟。

1.3 結(jié)晶產(chǎn)物評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 產(chǎn)物收率(Y)

根據(jù)結(jié)晶前伊曲茶堿質(zhì)量M1與結(jié)晶析出質(zhì)量M2計(jì)算，公式為Y=M2/M1。

1.3.2 平均粒徑(MS)和變異系數(shù)(CV)

平均粒徑(MS)是指樣品的累積分布分?jǐn)?shù)達(dá)到50%所對應(yīng)的粒徑即D50；變異系數(shù)CV=(D90-D10)/D50；D10和D90分別表示樣品的累積分布分?jǐn)?shù)達(dá)到10%和90%所對應(yīng)的粒徑，反映粒度分布寬度[13]。變異系數(shù)越小，表明晶體粒度分布越集中，反之則表明晶體粒度分布范圍廣。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)晶液初始濃度對伊曲茶堿結(jié)晶影響

2.1.1 初始濃度對產(chǎn)品收率的影響

根據(jù)伊曲茶堿在水+DMF二元混合體系中熱力學(xué)性質(zhì)，結(jié)晶液初始濃度越高，理論上結(jié)晶收率也越高。從圖2(a)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合這一規(guī)律。相同結(jié)晶條件下，隨著伊曲茶堿濃度增加，晶體析出量逐漸增加，當(dāng)初始濃度≥12 mg/mL時(shí)，收率增長緩慢。

2.1.2 初始濃度對伊曲茶堿晶體粒度及其分布的影響

濃度對結(jié)晶結(jié)果的影響與溶液的過飽和度有著緊密的聯(lián)系[14]。從圖2(b)、圖2(d)可以發(fā)現(xiàn)，初始濃度較低時(shí)，晶體主粒度較小且粒度分布集中，隨著濃度的增加，平均粒徑呈增大趨勢，粒度分布變寬。這種現(xiàn)象可以從成核速率與結(jié)晶液濃度間的依賴關(guān)系來解釋[15]。在較高的濃度下，成核速率增加，導(dǎo)致大量的晶核形成，促進(jìn)晶體生長和凝聚。同時(shí)高濃度會(huì)加快晶體間碰撞的頻率，引發(fā)團(tuán)聚，誘導(dǎo)大顆粒的形成。此外，大量的晶核增加了溶液黏度，阻礙了藥物的擴(kuò)散，導(dǎo)致界面處不均勻的過飽和度，增大了粒徑。由圖2(c)可以看出，當(dāng)初始濃度為12 mg/mL時(shí)，此時(shí)的變異系數(shù)最小，而變異系數(shù)越小，則表明晶體的粒度分布更集中。圖3顯示了不同初始濃度重結(jié)晶晶體的掃描電鏡圖像。電鏡圖像表明，在高濃度下，晶體出現(xiàn)明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象。綜上分析可知，初始濃度對于結(jié)晶產(chǎn)物的收率、粒度分布、晶體形貌有著重要的影響，結(jié)晶工藝最佳濃度應(yīng)控制在12 mg/mL。

圖2 初始濃度對伊曲茶堿結(jié)晶的影響Fig.2 Effect of initial concentration on the crystallization of istradefylline

圖3 不同初始濃度時(shí)獲得伊曲茶堿晶體SEM圖像Fig.3 SEM images of istradefylline crystals obtained at different initial concentrations

2.2 溶劑與溶析劑(水)體積分?jǐn)?shù)比對伊曲茶堿結(jié)晶影響

2.2.1 水的加入量對產(chǎn)品收率的影響

圖4 溶劑與溶析劑體積分?jǐn)?shù)對伊曲茶堿結(jié)晶的影響Fig.4 Effect of the volume ratio of solution to anti-solvent on the crystallization of istradefylline

由圖4(a)可知隨著水的加入量逐漸增大，伊曲茶堿收率逐漸升高，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)比例≥1∶3時(shí)，產(chǎn)品析出量增加緩慢，繼續(xù)增加水量，收率提升受阻且浪費(fèi)溶劑，因此溶劑和溶析劑的比例應(yīng)控制在1∶3。

2.2.2 溶析劑的量對伊曲茶堿晶體粒度及其分布的影響

從圖4(b)觀察到，晶體的平均粒徑與溶析劑的體積呈反比，隨著體積比的增加，晶體的主粒度逐漸減小。結(jié)晶包括成核和晶體生長兩個(gè)主要步驟。與晶體生長速率相比，成核速率更依賴于過飽和度[16]。大量的溶析劑迅速增加了溶液過飽和度，提高了成核速率誘導(dǎo)大量細(xì)小晶核生成。相比之下，溶析劑體積較低時(shí)，由于伊曲茶堿在DMF-水中有著較好的溶解度，導(dǎo)致過飽和度較低，晶核形成較少，致使晶體主粒徑偏大。從圖4(c)、從圖4(d)中可以觀察到，當(dāng)溶劑與溶析劑的體積分?jǐn)?shù)比為1∶3時(shí)，此時(shí)的變異系數(shù)最小，粒度均一性較好。圖5顯示了不同體積溶析劑的重結(jié)晶伊曲茶堿掃描電鏡圖像。電鏡圖像證實(shí)了溶劑與溶析劑體積比為1∶3，晶體在尺寸和形狀上更均勻。

2.3 溶析劑滴加速率對伊曲茶堿結(jié)晶的影響

2.3.1 滴加速率對產(chǎn)品收率的影響

由圖6(a)可知，隨著溶析劑滴加速率的增加，伊曲茶堿收率呈先升高后降低的趨勢。是因?yàn)楫?dāng)?shù)渭铀俾蔬^低時(shí)，結(jié)晶液體系過飽和度偏低，晶體析出動(dòng)力不足，且耗費(fèi)時(shí)間，當(dāng)?shù)渭铀俾蔬^高時(shí)，溶液體系過飽和度偏高，致使大量晶核產(chǎn)生，誘導(dǎo)大量細(xì)晶析出，在處理過程中易損失。

圖5 不同比例溶析劑時(shí)獲得伊曲茶堿晶體SEM圖像Fig.5 SEM images of istradefylline crystals obtained with different proportions of anti-solvent

圖6 滴加速率對伊曲茶堿結(jié)晶的影響Fig.6 Effect ofdripping speed on the crystallization of istradefylline

2.3.2 滴加速率對伊曲茶堿晶體粒度及其分布的影響

滴加速率對結(jié)晶過程的影響，取決于藥物溶液和溶析劑之間的過飽和程度和質(zhì)量傳遞[17]。從圖6(b)觀察到，隨著滴加速率的提高，伊曲茶堿平均粒度呈逐漸降低的趨勢。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，滴加速率對晶體粒徑的影響是顯著的，較快的滴加速率加速了傳質(zhì)過程和過飽和度，從而導(dǎo)致較高的成核速率以產(chǎn)生較小的晶體。Zhou等[18]研究表明，溶析劑的加入會(huì)增加晶體表面積，從而加快結(jié)晶過程。而在較低的滴加速率下，最初生成的晶核獲得了更多的晶體生長時(shí)間，因此導(dǎo)致了大晶體的形成。從圖6(c)、從圖6(d)中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)渭铀俾蕿? mL/min時(shí)，此時(shí)的變異系數(shù)最小，粒度分散程度更均勻。圖7顯示了在不同滴加速率下獲得的再結(jié)晶藥物晶體的掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)圖像，形態(tài)清楚，晶體呈短針狀，當(dāng)?shù)渭铀俾蕿? mL/min時(shí)，晶體品質(zhì)最佳。

圖7 不同滴加速率時(shí)獲得伊曲茶堿晶體SEM圖像Fig.7 SEM images of istradefylline crystals obtained at different dripping speed

2.4 結(jié)晶溫度對伊曲茶堿結(jié)晶影響

2.4.1 結(jié)晶溫度對產(chǎn)品收率的影響

圖8 結(jié)晶溫度對伊曲茶堿結(jié)晶的影響Fig.8 Effect of crystallization temperature on the crystallization of istradefylline

由圖8(a)數(shù)據(jù)可知，隨著溫度的升高，結(jié)晶收率呈逐漸降低趨勢，溫度在15～20 ℃范圍內(nèi)，下降趨勢平緩。且結(jié)晶溫度過高，會(huì)促使溶液中分子運(yùn)動(dòng)和碰撞頻率加快，從而誘導(dǎo)微小晶體的生成，在過濾、洗滌等操作過程中易損失。

2.4.2 結(jié)晶溫度對伊曲茶堿晶體粒徑的影響

溫度是結(jié)晶過程中的一個(gè)關(guān)鍵因素，因?yàn)樗梢酝ㄟ^改變亞穩(wěn)態(tài)和穩(wěn)態(tài)的溶解度之比來改變過飽和度，從而產(chǎn)生不同的結(jié)晶結(jié)果[19]。從圖8(b)可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)養(yǎng)晶溫度為20 ℃時(shí)，伊曲茶堿晶體粒徑較大，粒度分布均勻。根據(jù)經(jīng)典成核理論，成核速率與溫度成反比[8]。隨著溫度的降低，結(jié)晶液成核速率逐漸增加，過飽和度逐漸變大，誘導(dǎo)大量晶核產(chǎn)生，從而導(dǎo)致晶體平均粒度較小。隨著結(jié)晶溫度升高，成核速率降低，而晶體有著充足的生長動(dòng)力致使晶體主粒度偏大。同時(shí)溫度也影響藥物在溶劑中的平衡溶解度，較高的溫度增加了藥物的溶解度，導(dǎo)致溶液中晶體延遲沉淀，以及較少的晶核產(chǎn)生，隨后促進(jìn)晶體生長，從而形成更大的顆粒[14,20]。但溫度過高，會(huì)導(dǎo)致結(jié)晶液過飽和度偏低，介穩(wěn)區(qū)寬度變窄，晶體生長動(dòng)力不足，不利于晶體的生長，晶體主粒度減小。從圖8(c)、圖8(d)中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)結(jié)晶溫度為20 ℃時(shí)，此時(shí)的變異系數(shù)最小，粒度一致性表現(xiàn)較好。圖9顯示了在不同溫度下獲得的再結(jié)晶藥物晶體的SEM圖像，可以觀察到粒度大小及粒度分散程度，當(dāng)溫度為20 ℃時(shí)，粒徑及分散程度均較好。

2.5 陳化時(shí)間對伊曲茶堿結(jié)晶影響

2.5.1 陳化時(shí)間對產(chǎn)品收率的影響

陳化時(shí)間即養(yǎng)晶過程中靜置時(shí)間，該過程主要為小晶體的溶解以及大晶體的生長，延長陳化時(shí)間也是工業(yè)中增加收率及增大粒徑的常用方式。從圖10(a)發(fā)現(xiàn)，隨著陳化時(shí)間的增加，伊曲茶堿結(jié)晶收率逐漸增加，當(dāng)陳化時(shí)間≥90 min時(shí)，收率增長趨于水平。

圖9 不同結(jié)晶溫度時(shí)獲得伊曲茶堿晶體SEM圖像Fig.9 SEM images of istradefylline crystals obtained at different crystallization temperatures

圖10 陳化時(shí)間對伊曲茶堿結(jié)晶的影響Fig.10 Effect of the aging time on the crystallization of istradefylline

圖11 不同陳化時(shí)間時(shí)獲得伊曲茶堿晶體SEM圖像Fig.11 SEM images of istradefylline crystals obtained at different aging times

2.5.2 陳化時(shí)間對伊曲茶堿晶體粒徑的影響

從圖10(b)可知，晶體平均粒徑與陳化時(shí)間成正比。陳化時(shí)間在30～90 min范圍內(nèi)，伊曲茶堿晶體主粒徑增長不明顯，但養(yǎng)晶時(shí)間超過90 min后，晶體粒徑增大趨勢明顯。這是因?yàn)殛惢瘯r(shí)間較短，晶核與晶體不能得到充分的生長，導(dǎo)致晶體主粒徑小、粒度分布不均勻。適當(dāng)?shù)难娱L陳化時(shí)間，有利于晶體的生長，得到的晶體粒度分布較為均勻。但如果陳化時(shí)間過長，晶體已獲得充分生長，此時(shí)的大顆粒晶體易出現(xiàn)破碎，導(dǎo)致二次結(jié)晶，晶體的粒度均一性也會(huì)變差[21]。此外，延長陳化時(shí)間增加了結(jié)晶周期，耗能又耗時(shí)。從圖10(c)、從圖10(d)中可以觀察到，當(dāng)陳化時(shí)間為60 min時(shí)，此時(shí)的變異系數(shù)最小，粒度分布更均勻。圖11顯示了不同陳化時(shí)間下獲得的再結(jié)晶藥物晶體的SEM圖像，可以觀察到陳化時(shí)間為60 min時(shí)，結(jié)晶產(chǎn)品的晶體粒徑較大，粒度一致性表現(xiàn)較好。

3 結(jié)論

通過大量的實(shí)驗(yàn)，探究了各種因素對伊曲茶堿晶體收率、主粒度及粒度分布的影響。研究表明，隨著結(jié)晶液初始濃度的增加，伊曲茶堿的收率先逐漸增加后趨于平緩，粒度增大，當(dāng)初始濃度為12 mg/mL時(shí)，粒度分布較集中；隨著溶劑與溶析劑體積分?jǐn)?shù)比的增大，收率增大，粒度減小，當(dāng)體積比為1∶3時(shí)，粒度均一性較好；隨著溶析劑滴加速率的加快，收率呈先增加后降低的趨勢，粒度減小，當(dāng)?shù)渭铀俾蕿? mL/min時(shí)，粒度分布較窄；隨著養(yǎng)晶溫度的增加，收率逐漸降低，粒度先增大后減小，當(dāng)養(yǎng)晶溫度為20 ℃時(shí)，粒度一致性表現(xiàn)較好；隨著陳化時(shí)間的增加，收率和粒度逐漸增大，當(dāng)陳化時(shí)間為60 min時(shí)，粒度分布較均勻。綜合分析以上影響因素，得到伊曲茶堿較佳結(jié)晶方案，為工業(yè)上制備高質(zhì)量的伊曲茶堿產(chǎn)品提供基礎(chǔ)依據(jù)和參考。