南雄辣椒炭疽病菌的分離鑒定與藥劑篩選

鄭 婕 莊遠(yuǎn)航 郭梓琪 許 藝 鐘俊杰 黃維峰 胡 芳 李海渤 雷建軍，2* 吳 昊*

（1 韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東韶關(guān) 512005；2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州 510642；3 廣東省粵北食藥資源利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東韶關(guān) 512005）

辣椒（spp.）是茄科辣椒屬的重要蔬菜作物，也是我國(guó)栽培面積最大的蔬菜作物（鄒學(xué)校 等，2020；王立浩 等，2021）。廣東省作為我國(guó)重要的南菜北運(yùn)基地，辣椒年種植面積達(dá)9.92 萬(wàn)hm（李穎 等，2020）。隨著廣東省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整以及脫貧攻堅(jiān)的大力開展，粵北地區(qū)辣椒種植面積逐年增大，辣椒病害發(fā)生也日趨嚴(yán)重。辣椒炭疽病是一種世界性的辣椒病害，每年全球因炭疽病導(dǎo)致辣椒減產(chǎn)約50%，熱帶或亞熱帶地區(qū)受到的影響最為嚴(yán)重（Than et al.，2008；Ridzuan et al.，2018）。印度每年因炭疽病造成辣椒減產(chǎn)10%～54%，越南因炭疽病導(dǎo)致辣椒產(chǎn)量下降最高可達(dá)80%（Saxena et al.，2016）。辣椒炭疽病在我國(guó)可導(dǎo)致辣椒減產(chǎn)30%～40%，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)50%左右（林清 等，2005；周黛媛 等，2022），廣東省地處亞熱帶和熱帶，是辣椒炭疽病的高發(fā)地區(qū)。

辣椒炭疽病的典型癥狀是在病果和病葉上出現(xiàn)同心輪紋狀病斑，病原菌不僅為害生長(zhǎng)期的辣椒果實(shí)和莖葉，還能在采后貯運(yùn)過(guò)程中持續(xù)造成果實(shí)腐爛，嚴(yán)重影響干鮮椒的產(chǎn)量和品質(zhì)。引起辣椒炭疽病的病原菌屬于半知菌亞門炭疽菌屬（），該屬種類繁多且類別復(fù)雜，常見優(yōu)勢(shì)種有（異名）、（曾被鑒定為）以及（曾被鑒定為）（Mongkolporn，2019）。我國(guó)已報(bào)道的辣椒炭疽病致病菌至少有15種，且不同地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種差異較大（Diao et al.，2017）。由于不同的炭疽病菌對(duì)殺菌劑的敏感性存在差異（滿益龍 等，2016），而殺菌劑的不合理施用不僅會(huì)導(dǎo)致農(nóng)藥浪費(fèi)和環(huán)境污染，還可能導(dǎo)致病原菌出現(xiàn)耐藥性甚至抗藥性。因此有必要針對(duì)辣椒主要產(chǎn)區(qū)的炭疽病菌進(jìn)行分離和鑒定，為指導(dǎo)田間高效防治藥劑的施用奠定基礎(chǔ)。為此，本試驗(yàn)對(duì)采集自廣東省韶關(guān)市南雄市辣椒種植區(qū)的辣椒炭疽病病果進(jìn)行病原菌分離純化和微生物學(xué)、分子生物學(xué)方法鑒定，并利用12 種殺菌劑進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，以期為粵北地區(qū)辣椒炭疽病防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離純化

2020 年10 月于廣東省韶關(guān)市南雄市湖口鎮(zhèn)辣椒基地，采集疑似感染炭疽病的朝天椒果實(shí)樣本。將獲得的果實(shí)樣本帶回實(shí)驗(yàn)室，通過(guò)組織分離法將病果的病健交界處剪成5 mm × 5 mm 小塊，用0.1%HgCl消毒1 min，滅菌ddHO 沖洗5～6 次后用無(wú)菌吸水紙吸干水分，接種到番茄燕麥瓊脂（tomato oatmeal agar，TOA）培養(yǎng)基中進(jìn)行分離培養(yǎng)及菌落純化。TOA 培養(yǎng)基：番茄汁150 mL、CaCO0.6 g、燕麥片40 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L，121 ℃滅菌20 min。

1.2 病原菌孢子懸液制備

用打孔器在TOA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 周的菌落邊緣打取直徑0.3 cm 的小菌塊，取3～5 個(gè)菌塊置于50 mL 液體TOA 培養(yǎng)基中，在28 ℃恒溫?fù)u床中130 r·min培養(yǎng)72 h。在超凈工作臺(tái)中將培養(yǎng)好的菌塊轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入滅菌的蒸餾水，28 ℃光照條件下培養(yǎng)12 h。之后去除培養(yǎng)皿中的蒸餾水，置于28 ℃黑暗條件下處理12 h。待孢子囊成熟后，將菌塊轉(zhuǎn)移至無(wú)菌試管中，加5 mL 滅菌蒸餾水，利用渦旋儀振蕩2 min 使孢子囊脫落。孢子懸液用于顯微觀察和針刺接種。

1.3 病原菌的致病力測(cè)定

為了確定病原菌致病性，依據(jù)柯赫氏法則將病原分離物重新接種朝天椒，發(fā)病后再進(jìn)行分離鑒定（方中達(dá)，1998）。取新鮮健康的朝天椒綠果，對(duì)果實(shí)表面進(jìn)行消毒，采用針刺接種法將5 μL 病菌孢子懸浮液（孢子濃度為1 × 10個(gè)·mL）接種至果實(shí)表面，對(duì)照組接種等量滅菌ddHO，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，濕度80%，每個(gè)處理進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

觀察并記錄病原菌菌落在TOA 培養(yǎng)基上的形態(tài)、大小及顏色等特征。誘導(dǎo)病菌的孢子懸浮液并進(jìn)行顯微制片，通過(guò)顯微鏡觀察并記錄病原菌的分生孢子形態(tài)特征。

1.5 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

利用真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒〔生工生物工程（上海）股份有限公司，B518229〕，對(duì)病原菌的基因組DNA 進(jìn)行抽提和純化。對(duì)病原菌的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔序列（internal transcribed spaces，ITS）、β-微管蛋白基因（β-tubulingene，）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene，）、幾 丁質(zhì)合成酶A 基因（chitin synthase A gene，）和肌動(dòng)蛋白基因（actin gene，）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，所用引物見表1。PCR 的反應(yīng)體系包括病原菌基因組DNA 100 ng，引物4 mmol·L，KOD 酶0.4 μL，2× KOD buffer 10 μL，dNTP 4 mmol·L，ddHO 補(bǔ)足至20 μL。PCR 程序設(shè)置為：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，68 ℃延伸30 s；共35 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，將擴(kuò)增長(zhǎng)度符合預(yù)期的PCR產(chǎn)物連接到pEASY-blunt zero 載體上，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序及進(jìn)一步的序列分析。

表1 病原菌分子鑒定相關(guān)基因克隆所用引物

1.6 多基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將、、、和基 因片段的測(cè)序結(jié)果在GenBank 中進(jìn)行BLAST 序列比對(duì)，利用數(shù)據(jù)庫(kù)中的炭疽菌屬模式菌株的、、、和基因序列作為參考序列（Diao et al.，2017）。將上述基因序列進(jìn)行串聯(lián)分析，利用Geneious v4.8.3 軟件對(duì)組合數(shù)據(jù)集進(jìn)行鄰接（neighbor-joining，NJ）系統(tǒng)聚類分析，通過(guò)自展法（bootstrap analysis）對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)化枝的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，重復(fù)1 000 次。本試驗(yàn)涉及的炭疽菌屬模式菌株的相關(guān)信息詳見表2。

表2 用于系統(tǒng)發(fā)育樹分析的炭疽菌菌株

1.7 藥劑室內(nèi)毒力測(cè)定

供試12 種常用殺菌劑購(gòu)買于本地市場(chǎng)（表3）。先將12 種殺菌劑配制成待測(cè)母液，然后按比例加至TOA 培養(yǎng)基中：在無(wú)菌條件下，按10、100、1 000 μg·mL的終濃度將所需母液量加入培養(yǎng)基中，空白對(duì)照為加入等量無(wú)菌水的培養(yǎng)基。用接種針挑取直徑為3 mm 的菌塊接種至培養(yǎng)基的中央，28 ℃培養(yǎng)7 d，每個(gè)濃度梯度進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。采用“十”字交叉法對(duì)菌落直徑進(jìn)行測(cè)量并記錄數(shù)據(jù)。將抑菌效果較好的6 種有效藥劑挑出進(jìn)行第2輪試驗(yàn)，其中咪鮮胺、苯甲·丙環(huán)唑和甲基硫菌靈濃度梯度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg·mL，腈菌唑、唑醚·代森聯(lián)和醚菌酯濃度梯度為5、10、20、40、80 μg·mL。采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定和計(jì)算不同藥劑的抑菌率。根據(jù)各殺菌劑濃度對(duì)數(shù)值及對(duì)應(yīng)的抑菌率作回歸分析，計(jì)算各殺菌劑的毒力回歸方程（=+）、抑菌有效中濃度（EC）及相關(guān)系數(shù)（）。

表3 供試藥劑及生產(chǎn)廠家

抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-接種菌餅直徑）× 100%

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，利用DPS v7.05 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 南雄朝天椒炭疽病的危害及病原菌的分離

辣椒炭疽病多發(fā)生于每年7 月初至9 月中旬，正是成熟辣椒大量采收和貯運(yùn)的關(guān)鍵時(shí)期。2020年，廣東省韶關(guān)市南雄市朝天椒種植區(qū)大面積暴發(fā)辣椒炭疽病，嚴(yán)重地塊的病果率高達(dá)80%。該病原菌主要為害紅熟后的辣椒果實(shí)，并在采后貯運(yùn)過(guò)程中持續(xù)造成果實(shí)腐爛。發(fā)病初期，被害果實(shí)出現(xiàn)褐色不規(guī)則病斑。貯運(yùn)過(guò)程中密封的濕熱環(huán)境加速病害的蔓延，病斑上出現(xiàn)橘黃色的孢子團(tuán)。發(fā)病后期，病斑擴(kuò)散至整個(gè)果實(shí)，病果失水干枯并發(fā)生脫落（圖1-a）。

圖1 南雄辣椒炭疽病發(fā)病癥狀及病原菌形態(tài)

通過(guò)組織分離法，在TOA 培養(yǎng)基上分離到白色的真菌菌落（圖1-b）。對(duì)分離得到的病原菌進(jìn)行純化，菌落在培養(yǎng)基上呈圓形，菌絲呈白色絨狀，后期逐漸變?yōu)榛疑?，并有同心環(huán)紋（圖1-c）。分生孢子為無(wú)色單胞，形狀為長(zhǎng)棒狀，長(zhǎng)軸為8～17 μm，短軸為4～6 μm（圖1-d）。

2.2 病原菌的致病性測(cè)定

利用針刺接種法對(duì)新鮮的朝天椒綠果進(jìn)行炭疽病菌孢子懸液的接種，2 d 后接種位置出現(xiàn)炭疽病病斑，病情發(fā)展迅速。接種后第6 天，炭疽病病斑凹陷，呈長(zhǎng)橢圓形，直徑可達(dá)10～15 mm，中央產(chǎn)生大量橙色粘稠的孢子團(tuán)，外周呈褐色；對(duì)照未出現(xiàn)病斑，針刺位置可清晰辨認(rèn)（圖2）。根據(jù)柯赫氏法則，將本次試驗(yàn)的發(fā)病組織重新進(jìn)行組織分離，得到的病原菌與之前分離的原始病原菌一致，確定該菌為南雄朝天椒炭疽病的致病菌，并將該菌株命名為NX-1。

圖2 辣椒炭疽病病原菌的致病性測(cè)定結(jié)果

2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)南雄辣椒炭疽病菌NX-1 的、、、和基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度分別為558、759、248、291 bp 和 250 bp的DNA 序列（圖3）。對(duì)上述基因片段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)多基因的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析，結(jié)果表明病原菌NX-1 與炭疽菌模式菌株CBS 120708 為一個(gè)進(jìn)化支（圖4）。結(jié)合NX-1 的形態(tài)學(xué)特征和多基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果，將南雄辣椒炭疽病菌NX-1 鑒定為炭疽菌。

圖3 NX-1 分子鑒定相關(guān)基因的PCR 擴(kuò)增

圖4 炭疽病菌NX-1 的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果

2.4 12 種藥劑對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌效果鑒定

通過(guò)10、100、1 000 μg·mL3 個(gè)濃度梯度的12 種藥劑對(duì)炭疽病進(jìn)行初步的抑菌效果鑒定，結(jié)果表明：咪唑類和三唑類的單劑（咪鮮胺和腈菌唑）或復(fù)配劑（苯甲·丙環(huán)唑）均表現(xiàn)出良好的抑菌效果；取代苯基類的甲基硫菌靈抑菌效果較好，但百菌清效果一般；甲氧基丙烯酸酯類的單劑（醚菌酯）或復(fù)配劑（唑醚·代森聯(lián)）也表現(xiàn)出較好的抑菌效果；春雷·王銅和甲霜·噁霉靈這兩種復(fù)配劑只能在高濃度條件下具有抑菌作用；噁霉·絡(luò)氨銅的抑菌效果較差；烯酰嗎啉和噻菌酮幾乎沒(méi)有抑菌作用（圖5、6）。

圖5 不同濃度殺菌劑對(duì)炭疽病菌NX-1 菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

圖6 不同濃度殺菌劑對(duì)炭疽病菌NX-1 的抑制率

2.5 6 種有效藥劑對(duì)辣椒炭疽病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

采用咪鮮胺、苯甲·丙環(huán)唑、甲基硫菌靈、腈菌唑、唑醚·代森聯(lián)和醚菌酯6 種抑菌效果較好的殺菌劑對(duì)NX-1 進(jìn)一步進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，結(jié)果表明，6 種藥劑均能不同程度地抑制炭疽病菌菌絲的生長(zhǎng)，其抑菌作用由強(qiáng)到弱依次為：咪鮮胺＞苯甲·丙環(huán)唑＞甲基硫菌靈＞腈菌唑＞唑醚·代森聯(lián)＞醚菌酯（圖7）。咪鮮胺和苯甲·丙環(huán)唑的EC均在1 μg·mL以內(nèi)，分別為0.019 6 μg·mL和0.282 8 μg·mL，抑菌效果較強(qiáng)；其次是甲基硫菌靈和腈菌唑，EC分別為1.694 6 μg·mL和7.475 6 μg·mL；唑醚·代森聯(lián)和醚菌酯的EC較高，分別為16.130 8 μg·mL和19.942 8 μg·mL（表4）。

圖7 6 種有效藥劑對(duì)炭疽病菌NX-1 菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

表4 6 種有效殺菌劑對(duì)炭疽病菌NX-1 的室內(nèi)毒力測(cè)定

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，廣東省南雄市的辣椒種植逐漸成為了具有地方特色的北運(yùn)蔬菜產(chǎn)業(yè)。然而，辣椒的炭疽病害也隨著南雄辣椒種植面積的擴(kuò)大而日趨嚴(yán)重。本試驗(yàn)從南雄市湖口鎮(zhèn)辣椒基地采集疑似辣椒炭疽病的自然發(fā)病朝天椒果實(shí)，獲得分離純化的辣椒炭疽病病原菌，通過(guò)致病性測(cè)定、微生物形態(tài)學(xué)分析和分子生物學(xué)研究方法確定南雄朝天椒炭疽病病原菌的種類為。近年來(lái)，分子生物學(xué)在真菌的分類研究中發(fā)揮了很大作用，序列分析、多基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析等方法被廣泛應(yīng)用（Marin-Felix et al.，2017）?；蚴欠肿訖z測(cè)中最常用的靶基因，但該基因沒(méi)有足夠的變異位點(diǎn)用以區(qū)分所有的菌種（Innis et al.，1991）。本試驗(yàn)使用的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析是基于、、、和5 個(gè)基因的串聯(lián)分析，該方法在親緣關(guān)系較近、外形相似的真菌間的分析比較與種類鑒定中較單基因序列分析更具優(yōu)勢(shì)。

通過(guò)對(duì)12 種殺菌劑的抑菌效果鑒定和室內(nèi)毒力測(cè)定，表明咪鮮胺、苯甲·丙環(huán)唑、甲基硫菌靈、腈菌唑、唑醚·代森聯(lián)和醚菌酯均對(duì)南雄辣椒炭疽病菌表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。從EC來(lái)看，咪鮮胺和苯甲·丙環(huán)唑的抑菌作用最強(qiáng)，其EC分別為0.019 6 μg·mL和0.282 8 μg·mL。因此，咪鮮胺和苯甲·丙環(huán)唑均可用于南雄辣椒炭疽病的防治，可將咪鮮胺作為首選殺菌劑，或二者交替使用。此外，由于田間環(huán)境影響因素較多，殺菌劑的室內(nèi)毒力與田間實(shí)際防治效果可能有所差異，今后將進(jìn)一步測(cè)定咪鮮胺和苯甲·丙環(huán)唑在大田中對(duì)辣椒炭疽病菌的影響，以期在實(shí)際的辣椒生產(chǎn)中指導(dǎo)企業(yè)和農(nóng)民在辣椒炭疽病害管理過(guò)程中科學(xué)、高效用藥，降低生產(chǎn)成本和農(nóng)藥施用量，為食品安全和生態(tài)環(huán)境提供保障。