王安麗,朱啟金,吳永貴,夏玲玲
2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)已成為危害公眾健康的重要健康問題。糖尿病引起的肝臟損傷統(tǒng)稱為糖尿病性肝損傷,糖尿病性肝損傷主要表現(xiàn)為肝功能異常、非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)、肝纖維化[1-2]。芍藥苷(paeoniflorin, PF)是白芍總苷的主要有效成分,大量研究[3]表明PF具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性。PF對多種肝臟損傷有潛在的保護(hù)作用,包括肝缺血再灌注損傷、中毒性化學(xué)誘導(dǎo)的肝損傷、肝纖維化和NAFLD[3]。此外,PF通過ROCK/NF-κB、IRS/Akt/GSK3β和LKB1/AMPK信號通路減少NAFLD中的脂肪變性、炎癥和壞死[4-5]。前期研究[6]表明,白芍總苷可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕1型糖尿病小鼠的肝臟損傷。研究[7-8]表明NOD樣受體蛋白-3(NOD-like receptor 3,NLRP3)炎癥小體通路在糖尿病性肝損傷的炎癥和纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。PF可抑制糖尿病足潰瘍中NLRP3炎癥小體通路的激活[9]。該研究旨在探討在db/db小鼠的肝臟損傷中,PF對NLRP3炎癥小體通路介導(dǎo)的炎癥和纖維化的影響。
1.1 實驗動物及分組雄性db/db小鼠24只(6~8周齡,30~40 g/只)和雄性db/m小鼠12只(6~8周齡,20~25 g/只)購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2018-0008,使用許可證號:SYXK(蘇)2018-0027。動物實驗均在安徽醫(yī)科大學(xué)SPF級動物實驗室進(jìn)行,飼養(yǎng)條件為(22±2) ℃、濕度60%,明暗周期為12 h/12 h,自由進(jìn)食和飲水。以db/db小鼠為2型糖尿病小鼠模型,以db/m小鼠為正常對照。后者隨機(jī)分為正常對照(db/m)組、正常對照+PF(PF)組;前者隨機(jī)分為糖尿病(db/db)組、糖尿病+PF 25 mg/kg(db/db+PF 25 mg/kg)組、糖尿病+PF 50 mg/kg(db/db+PF 50 mg/kg)組、糖尿病+PF 100 mg/kg(db/db+PF 100 mg/kg)組。db/db+PF組小鼠每天灌胃PF 1次,PF組每天灌胃100 mg/kg的PF,db/m組和db/db組給予適量生理鹽水,共12周。該研究已獲得安徽醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(NO:LLSC20190519)。
1.2 試劑PF(純度:≥98%)購自上海麥克林生化科技有限公司;抗β-actin、抗Col Ⅲ的特異性抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;抗F4/80特異性抗體購自美國Abcam公司;抗Caspase-1特異性抗體購自美國Abclonal公司;抗NLRP3、抗IL-1β特異性抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;抗TNF-α、抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)特異性抗體購自新竹市Arigo公司;抗IL-18、抗ASC特異性抗體購自美國Affinity公司;總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、非酯化游離脂肪酸(free fat acid,FFA)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;油紅O染色試劑盒購自北京索萊寶;HRP標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠IgG二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;拜安康血糖試紙購自德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司。
1.3 主要儀器石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)和冰凍切片機(jī)購自德國Lecia公司;多功能酶標(biāo)儀購自美國PE公司;BX50光學(xué)顯微鏡購自日本OLYPUS公司;電泳儀和濕轉(zhuǎn)儀購自美國伯樂公司;熒光顯影系統(tǒng)Li-Cor/Odyssey購自美國LI-COR Biosciences公司;拜安康血糖測試儀購自德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司。
1.4 方法
1.4.1一般生化指標(biāo)的檢測 稱量并記錄小鼠的體質(zhì)量。剪去小鼠尾尖,采小鼠尾尖血通過血糖儀測量小鼠血糖。小鼠灌胃PF 12周后,吸入5%異氟醚麻醉小鼠,收集血清樣本,按照說明書檢測血清ALT、AST、TC、TG、和FFA水平。取出小鼠肝臟組織,用紗布吸干組織表明多余水分,稱量肝臟的重量并計算肝質(zhì)量與體質(zhì)量的比值。對于肝臟組織TC、TG和FFA水平的檢測參考說明書步驟進(jìn)行。
1.4.2肝臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察 肝臟組織用4%多聚甲醛固定,脫水后包埋在石蠟中,切成4 μm厚切片,按照說明書進(jìn)行HE染色和天狼星紅染色。對于油紅O染色,肝臟組織在30%蔗糖溶液中固定和脫水,OCT包埋,切成10 μm的切片,根據(jù)說明書,用油紅O染色試劑盒對切片進(jìn)行染色。
1.4.3免疫組化染色 石蠟切片于烘箱中70 ℃加熱至蠟融化,依次浸泡于二甲苯和梯度乙醇中。滴加內(nèi)源性過氧化氫酶阻斷劑覆蓋組織,室溫靜置20 min。使用檸檬酸鹽進(jìn)行微波加熱修復(fù)抗原。隨后10%山羊血清在37 ℃封閉1 h。滴加抗F4/80(1 ∶200)、抗Ⅲ型膠原( collagen Ⅲ, Col Ⅲ)(1 ∶200)和抗α-SMA(1 ∶200)在4 ℃孵育過夜,然后加入二抗37 ℃、45 min。PBS沖洗,DAB染色,在顯微鏡下觀察載玻片并拍照。使用Image J分析圖片,計算陽性面積百分比。
1.4.4Western blot實驗 取適量肝臟組織,加入裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)提取蛋白,并進(jìn)行BCA蛋白定量分析。蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。配制1×快速封閉液,封閉15~30 min后將膜分別放入抗β-actin(1 ∶5 000)、抗NLRP3(1 ∶1 000)、抗ASC(1 ∶1 000)、抗Caspase-1(1 ∶1 000)、抗IL-1β(1 ∶1 000)、抗IL-18(1 ∶1 000)和抗TNF-α(1 ∶1 000)一抗中4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜3次,每次10 min。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠IgG二抗(1 ∶5 000)孵育50 min。TBST洗膜3次,使用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)曝光條帶。使用Image J測量條帶的灰度值。
2.1 PF對小鼠一般指標(biāo)的影響與db/m組相比,db/db組小鼠肝質(zhì)量/體質(zhì)量(P<0.01)和血糖(P<0.001)升高;與db/db組相比,db/db+PF組肝質(zhì)量/體質(zhì)量和血糖無明顯變化。檢測ALT和AST水平顯示,與db/m組相比,PF組ALT、AST水平近似,db/db組ALT、AST上升(P<0.001);與db/db組相比,db/db+PF組ALT、AST水平下降(P<0.001)。與db/m組相比,PF組血清及肝臟組織中TC、TG和FFA水平相近,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,而db/db組升高(P<0.001);與db/db組相比,db/db+PF組血清及肝臟組織中TC、TG和FFA水平下降(P<0.05)。見表1。
表1 PF對db/db小鼠一般指標(biāo)的影響
2.2 PF對小鼠肝組織病理形態(tài)的影響HE染色結(jié)果顯示,db/m組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,小葉結(jié)構(gòu)完整、肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向四周放射狀排列、細(xì)胞形態(tài)清晰,而db/db組小鼠肝小葉排列紊亂、細(xì)胞空泡樣變性、大量炎癥細(xì)胞浸潤。與db/db組相比,db/db+PF組小鼠肝細(xì)胞空泡樣變減少、炎癥細(xì)胞浸潤減少,PF治療逆轉(zhuǎn)了上述病理改變,見圖1A。通過肝臟組織油O染色結(jié)果顯示,與db/m組相比,db/db組小鼠肝組織中可以觀察到大量的脂滴;與db/db組相比,db/db+PF組脂滴減少,見圖1B。肝臟組織天狼星紅染色顯示:與db/m組相比,db/db組小鼠肝臟組織膠原沉積增加;與db/db組相比,db/db+PF組膠原沉積減少,見圖1C。
圖1 PF對db/db小鼠肝臟組織病理改變的影響A:HE染色觀察PF對各組肝臟一般病理形態(tài)的影響 ×400;B:油紅O染色觀察PF對db/db小鼠肝臟組織脂質(zhì)堆積的影響 ×200;C:天狼星紅染色觀察PF對db/db小鼠肝臟組織膠原沉積的影響 ×400;a:db/m組;b:PF組;c:db/db組;d:db/db+PF 25 mg/kg組;e:db/db+PF 50 mg/kg組;f:db/db+PF 100 mg/kg組
2.3 PF對小鼠肝組織炎癥的影響Western blot檢測IL-1β、IL-18和TNF-α,與db/m組相比,PF組肝臟組織IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,db/db組炎癥因子(IL-1β、IL-18和TNF-α)的表達(dá)均升高(P<0.001);db/db+PF組炎癥因子的表達(dá)與db/db組相比均下降(PIL-1β<0.001;PIL-18<0.05;PTNF-α<0.05)。結(jié)果表明db/db小鼠肝臟組織炎癥反應(yīng)增加,PF可以減輕db/db小鼠肝臟炎癥反應(yīng)。見圖2A。免疫組化檢測肝臟組織F4/80的表達(dá),相較于db/m組,db/db組肝臟組織F4/80的表達(dá)升高(P<0.01);與db/db組相比,db/db+PF組肝臟組織F4/80表達(dá)下降(P<0.01)。結(jié)果提示db/db小鼠肝臟組織巨噬細(xì)胞浸潤增加,而PF減少了巨噬細(xì)胞的浸潤。見圖2B。
圖2 PF對db/db小鼠肝臟炎癥反應(yīng)的影響A:Western blot法檢測PF對db/db小鼠肝臟組織IL-1β、IL-18和TNF-α表達(dá)的影響;B:免疫組化法檢測PF對db/db小鼠肝臟組織F4/80表達(dá)的影響 ×400;a:db/m組;b:PF組;c:db/db組;d:db/db+PF 25 mg/kg組;e:db/db+PF 50 mg/kg組;f:db/db+PF 100 mg/kg組;與db/m組比較:**P<0.01,***P<0.001;與db/db組比較:#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001
2.4 PF對小鼠肝臟纖維化的影響免疫組化檢測各組肝臟組織α-SMA和Col Ⅲ的表達(dá),與db/m組相比,PF組肝臟組織α-SMA和 Col Ⅲ表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,db/db組肝臟組織α-SMA和Col Ⅲ的表達(dá)升高(P<0.01);與db/db組相比,db/db+PF組肝臟組織α-SMA和Col Ⅲ表達(dá)下降(P<0.01)。提示db/db小鼠肝星狀細(xì)胞活化增加,肝臟組織纖維化增加,而芍藥苷抑制了糖尿病性肝損傷的纖維化。見圖3。
圖3 免疫組化法檢測PF對db/db小鼠肝臟組織α-SMA和Col Ⅲ表達(dá)的影響 ×400A:免疫組化法檢測PF對db/db小鼠肝臟組織α-SMA表達(dá)的影響;B:免疫組化法檢測PF對db/db小鼠肝臟組織Col Ⅲ表達(dá)的影響;a:db/m組;b:PF組;c:db/db組;d:db/db+PF 25 mg/kg組;e:db/db+PF 50 mg/kg組;f:db/db+PF 100 mg/kg組;與db/m組比較:**P<0.01;與db/db組比較:##P<0.01
2.5 PF對小鼠肝臟NLRP3炎癥小體通路的影響Western blot檢測各組肝臟組織NLRP3、ASC和Caspase-1的表達(dá),與db/m組相比,db/db組NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的表達(dá)均升高(P<0.001);與db/db組相比,db/db+PF組這些蛋白的表達(dá)均下降(PNLRP3<0.001,PASC<0.05,PCaspase-1<0.05)。結(jié)果表明db/db小鼠肝臟NLRP3炎癥小體通路激活增加,芍藥苷可以抑制db/db小鼠肝臟NLRP3通路的激活。見圖4。
圖4 Western blot法檢測PF對db/db小鼠肝臟組織NLRP3、ASC和Caspase-1表達(dá)的影響a:db/m組;b:PF組;c:db/db組;d:db/db+PF 25 mg/kg組;e:db/db+PF 50 mg/kg組;f:db/db+PF 100 mg/kg組;與db/m組比較:***P<0.001;與db/db組比較:#P<0.05,###P<0.001
糖尿病性肝損傷是糖尿病的一種并發(fā)癥,主要表現(xiàn)為NAFLD。據(jù)報道,糖尿病性肝損傷發(fā)生時,肝臟病理發(fā)生明顯改變,肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積、肝臟炎癥細(xì)胞浸潤,隨著疾病進(jìn)展導(dǎo)致肝纖維化以及肝臟組織不可逆損傷[2, 8]。糖尿病肝臟的炎癥和纖維化主要通過脂毒性介導(dǎo),2型糖尿病通常伴有胰島素抵抗,由胰島素抵抗引起的高胰島素血癥會促進(jìn)脂質(zhì)在肝細(xì)胞中的積累,受損肝細(xì)胞產(chǎn)生自由基和釋放損傷相關(guān)模式分子(DAMP),激活枯否細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞(HSC),導(dǎo)致炎癥和纖維化,除了肝細(xì)胞損傷的間接影響外,高胰島素血癥可能直接激活HSC[10]。糖尿病患者的肝纖維化在使用藥物治療后或在體質(zhì)量明顯減輕后(嚴(yán)重肥胖患者)是可逆的。因此,研究糖尿病性肝損傷的發(fā)病機(jī)制,找到治療糖尿病性肝損傷的藥物非常重要。
在長期的高血糖環(huán)境下,肝細(xì)胞表現(xiàn)為大泡性脂肪滴聚集、氣球樣變,肝細(xì)胞中脂質(zhì)堆積導(dǎo)致肝臟脂肪病變,脂質(zhì)過氧化,促炎細(xì)胞因子釋放,促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化導(dǎo)致肝臟纖維化的發(fā)生[8]。有文獻(xiàn)表明,即使在正常飲食條件下,db/db小鼠也表現(xiàn)出肝臟脂質(zhì)積累、炎癥細(xì)胞浸潤以及纖維化[7, 11-12]。該研究表明db/db小鼠肝臟脂質(zhì)堆積、炎癥細(xì)胞浸潤及輕度的纖維化。
PF是一種具有多種藥理活性的傳統(tǒng)中藥,其抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用已經(jīng)被公認(rèn)[3]。該研究表明,PF治療后糖尿病小鼠的ALT和AST下降,然而PF不改變db/db小鼠血糖,表明PF不是通過降低血糖來發(fā)揮保護(hù)肝臟的作用。此外,PF還能改善肝臟組織的病理損傷。進(jìn)一步研究表明,PF能夠降低糖尿病小鼠肝臟炎癥細(xì)胞因子(IL-1β、IL-18、TNF-α)的水平。db/db小鼠肝臟組織α-SMA表達(dá)升高,而PF治療減少了α-SMA蛋白的表達(dá)。同時,該研究結(jié)果顯示,db/db小鼠肝臟組織Col Ⅲ表達(dá)升高,PF處理降低了Col Ⅲ蛋白的表達(dá)水平。這些結(jié)果說明芍藥苷對db/db小鼠肝臟損傷具有抗炎和抗纖維化作用。
已有研究[7-8, 13]表明NLRP3炎癥小體通路與糖尿病性肝損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。NLRP3激活后,促進(jìn)Pro-caspase-1分裂為活化的Caspase-1,隨后活化的Caspase-1催化pro-IL-1β和pro-IL-18的成熟[14]。成熟的IL-1β和IL-18促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化,進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[15]。抑制NLRP3炎癥小體通路的激活可以降低糖尿病性肝損傷的炎癥反應(yīng)和纖維化。據(jù)報道[7],褪黑激素通過抑制NLRP3通路從而改善db/db小鼠肝臟的脂肪變性、炎癥反應(yīng)和纖維化。因此,阻斷NLRP3炎癥小體通路的激活可能可以減輕db/db小鼠的肝臟損傷,從而減輕糖尿病性肝損傷。先前的研究[9]報道,在糖尿病足潰瘍中,PF可通過抑制NLRP3通路的激活減輕炎癥反應(yīng)。該研究評估了PF對NLRP3炎癥小體通路的影響,結(jié)果證實了芍藥苷可以抑制db/db小鼠肝臟中NLRP3炎癥小體通路的激活。
綜上所述,研究表明PF抑制了NLRP3炎癥小體通路并減輕了db/db小鼠肝臟炎癥反應(yīng)及纖維化。PF治療后,明顯改善了db/db小鼠肝臟功能和病理改變。因此,PF在糖尿病性肝損傷的治療上有潛在的可能性。該研究僅從體內(nèi)實驗初步探討PF對糖尿病性肝損傷具有保護(hù)作用,但PF調(diào)控NLRP3炎癥小體具體機(jī)制尚不明確,有待進(jìn)一步探討。