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    鹿紅方對缺血缺氧心肌細(xì)胞SDF-1/CXCR4信號通路的影響*

    2022-11-02 06:41:22徐基杰朱彥華卓德華
    中國中醫(yī)急癥 2022年10期
    關(guān)鍵詞:紅方心肌細(xì)胞通路

    徐基杰 戴 健 朱彥華 陳 松 卓德華 李 檫 周 華

    (上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 201999)

    急性心肌梗死(AMI)后缺血缺氧的環(huán)境是導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的主要原因。減少梗死區(qū)域心肌細(xì)胞的凋亡對防止左室不良重構(gòu)和保留心臟功能具有重要意義[1]。雖然介入治療能開通大的冠脈分支,挽救梗死的心肌,但是仍存在無復(fù)流、微循環(huán)障礙等問題[2]。因此,通過藥物治療,提高缺血缺氧心肌細(xì)胞的抗凋亡能力,對于改善AMI預(yù)后具有重要意義。在本研究中,擬探索中藥鹿紅方對缺血缺氧模型下心肌細(xì)胞抗凋亡能力的影響,并進(jìn)行初步的機(jī)制探討。

    1 材料與方法

    1.1 實驗藥物

    鹿紅方由寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室提供,由鹿角15 g,紅花9 g,桂枝 9 g,黃芪30 g,黨參15 g和葶藶子30 g組成。鹿紅方水提物制備:將藥材加水浸泡1 h,先大火煮沸后再用小火煎煮1 h,18層紗布過濾,濾液備用;另外再加適量水同法再煎煮1次,18層紗布濾過,合并2次藥液,于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干,在60℃真空干燥,干膏稱重,再研為均勻細(xì)粉,備用。

    1.2 細(xì)胞株

    心肌細(xì)胞購自Lonza公司。

    1.3 試劑與儀器

    DMEM/F12培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清、無血清培養(yǎng)基均購自美國GIBCO公司;CCK-8試劑盒購自上海易色公司;AMD3100,購自美國Sigma公司;GAPDH antibody購自天津三箭公司;SDF-1兔抗、CXCR4兔抗、Bcl-2兔抗購自英國abcam公司;Bax兔抗,購自美國Proteintech公司。三氣培養(yǎng)箱購自日本松下公司;水浴恒溫?fù)u床購自上海漢諾公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,購自美國Thermo公司;超凈臺,購自美國BioX公司;多功能酶標(biāo)儀T0-3型,購自瑞士Tecan公司;-80℃冰箱,購自日本Sanyo公司。

    1.4 模型制備

    缺血缺氧模型的制備參考Wohnsland等的報道[3]并加改進(jìn)。取1 mL凍存心肌細(xì)胞(1~10×107),常規(guī)復(fù)蘇后轉(zhuǎn)移至無血清培養(yǎng)基,并置于37℃三氣培養(yǎng)箱中,設(shè)置氣體比例:氮氣95%、二氧化碳5%。將混合氣體以流速10 L/Min通過三氣培養(yǎng)箱,至測氧儀檢測箱中氧氣體積分?jǐn)?shù)為3%時停止通氣。培養(yǎng)時間設(shè)0.5、1、1.5、2、2.5、3 h共6個點,分別用CCK-8檢測細(xì)胞活性,以此確定缺血缺氧和藥物干預(yù)時間。發(fā)現(xiàn)氧糖剝奪時間在1.5 h時即見大量細(xì)胞凋亡,提示造模成功,故本研究將氧糖剝奪和藥物干預(yù)時間設(shè)為1.5 h。見圖1。

    圖1 不同缺血缺氧時間下心肌細(xì)胞OD值

    1.5 鹿紅方干預(yù)濃度的確定

    鹿紅方中劑量濃度根據(jù)臨床使用劑量換算,參照《細(xì)胞培養(yǎng)》[4]公式:試驗藥物質(zhì)量濃度(μg/mL)=(藥物臨床常用劑量×平均體表面積/平均體質(zhì)量)×(100÷60)。平均體質(zhì)量按60 kg,平均體表面積按1.6 m2計算,鹿紅方臨床用常用劑量為4.5 g/(kg·d),代入公式得鹿紅方細(xì)胞實驗中劑量約200 μg/mL,設(shè)立低劑量組為100 μg/mL,高劑量為500 μg/mL及1 000 μg/mL,加藥時根據(jù)各分組(表1)的干預(yù)要求,配成相應(yīng)質(zhì)量濃度,以考察量效關(guān)系。

    表1 鹿紅方對心肌細(xì)胞抗凋亡能力影響的干預(yù)分組

    1.6 分組及干預(yù)

    首先探討不同濃度的鹿紅方處理,對缺血缺氧模型下心肌細(xì)胞抗凋亡能力的影響,分組和干預(yù)方式如表2所示。然后從SDF-1/CXCR4信號通路探討鹿紅方作用機(jī)制,分組和干預(yù)方式如表2所示。

    表2 鹿紅方對心肌細(xì)胞抗凋亡能力影響機(jī)制研究的干預(yù)分組

    1.7 檢測指標(biāo)

    1.7.1 CCK-8法測定活細(xì)胞數(shù)目 待測心肌細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中(104細(xì)胞/孔),按分組加入干預(yù)藥物;然后加入10 μL CCK-8試劑,混勻后37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h,測定450 nm處OD值;酶標(biāo)儀讀取待測樣品和空白參照在450 nm處的OD值,將各待測樣本的OD值記為測量值,空白參照的OD值記為空白值,終值=測量值-空白值;通過判定OD值的高低反映活細(xì)胞數(shù)量。

    1.7.2 Western blotting檢測心肌相關(guān)蛋白的表達(dá) 各組心肌細(xì)胞表達(dá)SDF-1、CXCR4、Bax以及Bcl-2蛋白的水平采用Western blotting法進(jìn)行測定。測定方法按照我們之前的研究進(jìn)行[5]。簡述如下:蛋白用SDSPAGE提取分離,然后轉(zhuǎn)膜至聚乙烯二氟膜上。孵育一抗,稀釋比如下:SDF-1 1∶1 000;CXCR4 1∶100;Bax 1∶3 000;Bcl-2 1∶500;過夜,室溫下孵育二抗1 h。最后采用灰度值半定量法分析蛋白表達(dá)量。

    1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以()表示,組間比較采用ANOVA單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組心肌細(xì)胞OD值比較

    對照組與各造模組OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),各造模組OD值顯著降低(P<0.001);鹿紅方低劑量組和模型組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量1組及高劑量2組和模型組及鹿紅方低劑量組比較,OD值顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001);鹿紅方中低劑量組、鹿紅方高劑量1組與高劑量2組之間OD差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示鹿紅方200 μg/mL即可達(dá)到良好的抗凋亡效果,繼續(xù)提高質(zhì)量濃度并未顯示出療效的增強(qiáng),因此,在后續(xù)機(jī)制研究中將鹿紅方的質(zhì)量濃度定為200 μg/mL。見表3。

    表3 各組心肌細(xì)胞OD值比較(%,±s)

    表3 各組心肌細(xì)胞OD值比較(%,±s)

    注:與對照組比較,#P<0.001;與模型組比較,*P<0.001。下同。

    組別對照組模型組鹿紅方低劑量組鹿紅方中劑量組鹿紅方高劑量1組鹿紅方高劑量2組心肌細(xì)胞存活率0.89±0.01 0.21±0.02#0.20±0.03#0.46±0.02#*0.48±0.02#*0.45±0.01#*

    2.2 各組心肌細(xì)胞SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)量比較

    模型組與對照組比較,SDF-1和CXCR4的表達(dá)顯著升高(P<0.001);AMD中劑量組與模型組比較,SDF-1和CXCR4表達(dá)顯著升高(P<0.001);鹿紅方中劑量組與模型組比較,SDF-1和CXCR4的表達(dá)顯著升高(P<0.001)。見表4,圖2~圖3。

    圖2 各組SDF-1蛋白表達(dá)量比較

    圖3 各組CXCR4蛋白表達(dá)量比較

    表4 各組心肌細(xì)胞SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)量比較(±s)

    表4 各組心肌細(xì)胞SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)量比較(±s)

    組別對照組模型組AMD3100組鹿紅方中劑量組鹿紅方+AMD3100組SDF-1/GAPDH 0.04±0.01 0.41±0.05#0.85±0.01#*0.68±0.02#*0.87±0.01#*CXCR4/GAPDH 0.05±0.01 0.37±0.07#0.76±0.04#*0.65±0.04#*0.79±0.08#*

    2.3 各組心肌細(xì)胞Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)量比較

    Western blotting結(jié)果顯示:模型組與對照組比較,Bax的表達(dá)量顯著升高(P<0.001);AMD3100組與模型組比較,Bax表達(dá)量顯著升高(P<0.05),Bcl-2表達(dá)量有降低趨勢(P=0.061),Bax/Bcl-2值顯著升高(P<0.001);鹿紅方中劑量組與模型組比較,Bax表達(dá)顯著降低,Bcl-2表達(dá)量顯著升高,Bax/Bcl-2值顯著降低(P<0.001);鹿紅方+AMD3100組與鹿紅方中劑量組比較,Bax表達(dá)量顯著升高,Bcl-2表達(dá)量顯著降低,Bax/Bcl-2值顯著升高(P<0.001)。見表5,圖4~圖5。

    表5 各組心肌細(xì)胞Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)量比較(±s)

    表5 各組心肌細(xì)胞Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)量比較(±s)

    注:與鹿紅方中劑量組比較,★P<0.001。

    組別對照組模型組AMD3100組鹿紅方中劑量組鹿紅方+AMD3100組Bax/GAPDH 0.02±0.01 0.69±0.08#0.78±0.05#*0.35±0.05#*0.61±0.04#★Bcl-2/GAPDH 0.12±0.01 0.29±0.03#0.23±0.04#0.57±0.05#*0.34±0.04#★Bax/Bcl-2 0.17±0.03 2.3±0.23#3.4±0.6#*0.62±0.14#*1.78±0.13#★

    圖4 各組Bax蛋白表達(dá)條帶

    圖5 各組Bcl-2蛋白表達(dá)條帶

    3 討論

    心肌梗死預(yù)后的改善有賴于更多心肌細(xì)胞的存活。及時的冠脈介入治療能挽救大部分心肌,但無復(fù)流、慢血流和微循環(huán)梗死等問題仍然導(dǎo)致了一部分心肌細(xì)胞的凋亡[2]。研究顯示,SDF-1/CXCR4信號通路在心肌細(xì)胞抗凋亡方面起著重要作用[6]。SDF-1屬于CXC趨化因子亞家族成員,分為SDF-1α和SDF-1β,兩者的差別在于前者比后者少4個氨基酸。CXCR4是SDF-1最主要的受體,為7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體,表達(dá)于多種細(xì)胞表面[7]。SDF-1與CXCR4結(jié)合后,可以通過后者的二聚變構(gòu)和內(nèi)在化激活下游多條信號通路,參與提高細(xì)胞在缺血缺氧環(huán)境下的抗凋亡能力[8]。

    在本研究中,我們以SDF-1/CXCR4信號通路為研究靶點,研究鹿紅方提高心肌細(xì)胞抗凋亡能力的部分機(jī)制。鹿紅方中鹿角溫補(bǔ)肝腎、補(bǔ)益精血,使腎氣有根,陽氣上通于心,紅花活血化瘀通經(jīng),兼涼血解毒,共為君藥;桂枝溫通心陽;黃芪、黨參益氣扶正;葶藶子瀉肺平喘。諸藥合用,共奏溫補(bǔ)心腎陽氣、活血利水之功效。心肌梗死后,罪犯血管堵塞,心梗區(qū)域缺氧無灌注的狀態(tài)當(dāng)屬中醫(yī)學(xué)“心血瘀阻”證范疇[9],鹿紅方益氣活血的功效切合該病機(jī)。鹿紅方長期在臨床應(yīng)用,在改善心衰,尤其是冠心病心衰臨床癥狀和預(yù)后方面,療效顯著。前期的臨床研究結(jié)果也提示,鹿紅方有確切的抗心衰臨床療效[10-12],而其作用機(jī)制研究正不斷深入開展。

    現(xiàn)代藥理研究表明,組成本方的6味藥物均有不同程度的細(xì)胞保護(hù)和增強(qiáng)抗凋亡能力的作用:黃芪中的黃芪甲苷、紅花中的羥基紅花黃色素A有明確抗心肌細(xì)胞凋亡的作用[13-14],葶藶子有效成分能顯著改善缺氧心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激失衡狀態(tài)[15];桂枝有效成分肉桂酸具有保護(hù)心肌梗死后心肌細(xì)胞損傷的作用[16];鹿角蛋白具有保護(hù)急性缺血時心肌微循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用[17];黨參內(nèi)酯可通過作用于胰島素樣生長因子Ⅱ受體減少心肌細(xì)胞凋亡[18]。

    本研究結(jié)果顯示,模型組SDF-1和CXCR4蛋白表達(dá)水平顯著上升。這是因為在缺血缺氧環(huán)境下,缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)家族成員激活,后者可直接調(diào)控一些生長因子的轉(zhuǎn)錄,如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板源性生長因子(PDGF)、生長因子(HGF)等,其中還包括化學(xué)趨化因子如SDF-1的轉(zhuǎn)錄[19-21]。在缺血、缺氧時,SDF-1的表達(dá)在HIF-1的作用下得到上調(diào);而CXCR4也在HIF-1的介導(dǎo)下表達(dá)增加,從而使SDF-1與CXCR4結(jié)合增加,激活下游信號通路發(fā)揮抗缺血缺氧效應(yīng)[19]。本研究結(jié)果顯示的缺血缺氧激發(fā)心肌細(xì)胞分泌SDF-1和CXCR4的效應(yīng)與前期研究報道一致[22]。

    用CXCR4受體拮抗劑AMD3100阻斷SDF-1/CXCR4通路后,Bax的表達(dá)顯著升高,Bcl-2的表達(dá)顯著降低,Bax/Bcl-2數(shù)值升高,表明凋亡程度加重,從反面驗證了SDF-1/CXCR4信號通路激活對心肌細(xì)胞在缺血、缺氧應(yīng)激下的抗凋亡效應(yīng)。同時,我們注意到AMD3100組SDF-1和CXCR4的表達(dá)顯著上升,這可能是因為阻斷兩者結(jié)合后,信號通路的下游關(guān)鍵蛋白的磷酸化受阻,細(xì)胞內(nèi)可能存在某種反饋系統(tǒng),刺激SDF-1和CXCR4的分泌,值得進(jìn)一步研究。鹿紅組與模型組比較,SDF-1/CXCR4表達(dá)顯著上升,同時Bax的表達(dá)顯著降低,Bcl-2的表達(dá)顯著升高,Bax/Bcl-2數(shù)值降低,提示鹿紅方可通過上調(diào)SDF-1/CXCR4軸的表達(dá),提高心肌細(xì)胞的抗凋亡能力。在用AMD3100拮抗SDF-1/CXCR4信號通路后,鹿紅方提高心肌細(xì)胞抗凋亡能力的作用受到抑制,從反面說明鹿紅方發(fā)揮作用的機(jī)制部分是通過上調(diào)SDF-1/CXCR4信號通路的表達(dá)實現(xiàn)的。

    綜上所述,鹿紅方可提高缺血缺氧狀態(tài)下心肌細(xì)胞的抗凋亡能力,其機(jī)制與上調(diào)SDF-1/CXCR4信號通路有關(guān)。本研究的結(jié)果為鹿紅方的臨床應(yīng)用提供了一定的生物學(xué)依據(jù),但進(jìn)一步的作用機(jī)制有待更深入的研究。

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