• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    鹿紅方對缺血缺氧心肌細(xì)胞SDF-1/CXCR4信號通路的影響*

    2022-11-02 06:41:22徐基杰朱彥華卓德華
    中國中醫(yī)急癥 2022年10期
    關(guān)鍵詞:紅方心肌細(xì)胞通路

    徐基杰 戴 健 朱彥華 陳 松 卓德華 李 檫 周 華

    (上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 201999)

    急性心肌梗死(AMI)后缺血缺氧的環(huán)境是導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的主要原因。減少梗死區(qū)域心肌細(xì)胞的凋亡對防止左室不良重構(gòu)和保留心臟功能具有重要意義[1]。雖然介入治療能開通大的冠脈分支,挽救梗死的心肌,但是仍存在無復(fù)流、微循環(huán)障礙等問題[2]。因此,通過藥物治療,提高缺血缺氧心肌細(xì)胞的抗凋亡能力,對于改善AMI預(yù)后具有重要意義。在本研究中,擬探索中藥鹿紅方對缺血缺氧模型下心肌細(xì)胞抗凋亡能力的影響,并進(jìn)行初步的機(jī)制探討。

    1 材料與方法

    1.1 實驗藥物

    鹿紅方由寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室提供,由鹿角15 g,紅花9 g,桂枝 9 g,黃芪30 g,黨參15 g和葶藶子30 g組成。鹿紅方水提物制備:將藥材加水浸泡1 h,先大火煮沸后再用小火煎煮1 h,18層紗布過濾,濾液備用;另外再加適量水同法再煎煮1次,18層紗布濾過,合并2次藥液,于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干,在60℃真空干燥,干膏稱重,再研為均勻細(xì)粉,備用。

    1.2 細(xì)胞株

    心肌細(xì)胞購自Lonza公司。

    1.3 試劑與儀器

    DMEM/F12培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清、無血清培養(yǎng)基均購自美國GIBCO公司;CCK-8試劑盒購自上海易色公司;AMD3100,購自美國Sigma公司;GAPDH antibody購自天津三箭公司;SDF-1兔抗、CXCR4兔抗、Bcl-2兔抗購自英國abcam公司;Bax兔抗,購自美國Proteintech公司。三氣培養(yǎng)箱購自日本松下公司;水浴恒溫?fù)u床購自上海漢諾公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,購自美國Thermo公司;超凈臺,購自美國BioX公司;多功能酶標(biāo)儀T0-3型,購自瑞士Tecan公司;-80℃冰箱,購自日本Sanyo公司。

    1.4 模型制備

    缺血缺氧模型的制備參考Wohnsland等的報道[3]并加改進(jìn)。取1 mL凍存心肌細(xì)胞(1~10×107),常規(guī)復(fù)蘇后轉(zhuǎn)移至無血清培養(yǎng)基,并置于37℃三氣培養(yǎng)箱中,設(shè)置氣體比例:氮氣95%、二氧化碳5%。將混合氣體以流速10 L/Min通過三氣培養(yǎng)箱,至測氧儀檢測箱中氧氣體積分?jǐn)?shù)為3%時停止通氣。培養(yǎng)時間設(shè)0.5、1、1.5、2、2.5、3 h共6個點,分別用CCK-8檢測細(xì)胞活性,以此確定缺血缺氧和藥物干預(yù)時間。發(fā)現(xiàn)氧糖剝奪時間在1.5 h時即見大量細(xì)胞凋亡,提示造模成功,故本研究將氧糖剝奪和藥物干預(yù)時間設(shè)為1.5 h。見圖1。

    圖1 不同缺血缺氧時間下心肌細(xì)胞OD值

    1.5 鹿紅方干預(yù)濃度的確定

    鹿紅方中劑量濃度根據(jù)臨床使用劑量換算,參照《細(xì)胞培養(yǎng)》[4]公式:試驗藥物質(zhì)量濃度(μg/mL)=(藥物臨床常用劑量×平均體表面積/平均體質(zhì)量)×(100÷60)。平均體質(zhì)量按60 kg,平均體表面積按1.6 m2計算,鹿紅方臨床用常用劑量為4.5 g/(kg·d),代入公式得鹿紅方細(xì)胞實驗中劑量約200 μg/mL,設(shè)立低劑量組為100 μg/mL,高劑量為500 μg/mL及1 000 μg/mL,加藥時根據(jù)各分組(表1)的干預(yù)要求,配成相應(yīng)質(zhì)量濃度,以考察量效關(guān)系。

    表1 鹿紅方對心肌細(xì)胞抗凋亡能力影響的干預(yù)分組

    1.6 分組及干預(yù)

    首先探討不同濃度的鹿紅方處理,對缺血缺氧模型下心肌細(xì)胞抗凋亡能力的影響,分組和干預(yù)方式如表2所示。然后從SDF-1/CXCR4信號通路探討鹿紅方作用機(jī)制,分組和干預(yù)方式如表2所示。

    表2 鹿紅方對心肌細(xì)胞抗凋亡能力影響機(jī)制研究的干預(yù)分組

    1.7 檢測指標(biāo)

    1.7.1 CCK-8法測定活細(xì)胞數(shù)目 待測心肌細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中(104細(xì)胞/孔),按分組加入干預(yù)藥物;然后加入10 μL CCK-8試劑,混勻后37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h,測定450 nm處OD值;酶標(biāo)儀讀取待測樣品和空白參照在450 nm處的OD值,將各待測樣本的OD值記為測量值,空白參照的OD值記為空白值,終值=測量值-空白值;通過判定OD值的高低反映活細(xì)胞數(shù)量。

    1.7.2 Western blotting檢測心肌相關(guān)蛋白的表達(dá) 各組心肌細(xì)胞表達(dá)SDF-1、CXCR4、Bax以及Bcl-2蛋白的水平采用Western blotting法進(jìn)行測定。測定方法按照我們之前的研究進(jìn)行[5]。簡述如下:蛋白用SDSPAGE提取分離,然后轉(zhuǎn)膜至聚乙烯二氟膜上。孵育一抗,稀釋比如下:SDF-1 1∶1 000;CXCR4 1∶100;Bax 1∶3 000;Bcl-2 1∶500;過夜,室溫下孵育二抗1 h。最后采用灰度值半定量法分析蛋白表達(dá)量。

    1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以()表示,組間比較采用ANOVA單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組心肌細(xì)胞OD值比較

    對照組與各造模組OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),各造模組OD值顯著降低(P<0.001);鹿紅方低劑量組和模型組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量1組及高劑量2組和模型組及鹿紅方低劑量組比較,OD值顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001);鹿紅方中低劑量組、鹿紅方高劑量1組與高劑量2組之間OD差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示鹿紅方200 μg/mL即可達(dá)到良好的抗凋亡效果,繼續(xù)提高質(zhì)量濃度并未顯示出療效的增強(qiáng),因此,在后續(xù)機(jī)制研究中將鹿紅方的質(zhì)量濃度定為200 μg/mL。見表3。

    表3 各組心肌細(xì)胞OD值比較(%,±s)

    表3 各組心肌細(xì)胞OD值比較(%,±s)

    注:與對照組比較,#P<0.001;與模型組比較,*P<0.001。下同。

    組別對照組模型組鹿紅方低劑量組鹿紅方中劑量組鹿紅方高劑量1組鹿紅方高劑量2組心肌細(xì)胞存活率0.89±0.01 0.21±0.02#0.20±0.03#0.46±0.02#*0.48±0.02#*0.45±0.01#*

    2.2 各組心肌細(xì)胞SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)量比較

    模型組與對照組比較,SDF-1和CXCR4的表達(dá)顯著升高(P<0.001);AMD中劑量組與模型組比較,SDF-1和CXCR4表達(dá)顯著升高(P<0.001);鹿紅方中劑量組與模型組比較,SDF-1和CXCR4的表達(dá)顯著升高(P<0.001)。見表4,圖2~圖3。

    圖2 各組SDF-1蛋白表達(dá)量比較

    圖3 各組CXCR4蛋白表達(dá)量比較

    表4 各組心肌細(xì)胞SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)量比較(±s)

    表4 各組心肌細(xì)胞SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)量比較(±s)

    組別對照組模型組AMD3100組鹿紅方中劑量組鹿紅方+AMD3100組SDF-1/GAPDH 0.04±0.01 0.41±0.05#0.85±0.01#*0.68±0.02#*0.87±0.01#*CXCR4/GAPDH 0.05±0.01 0.37±0.07#0.76±0.04#*0.65±0.04#*0.79±0.08#*

    2.3 各組心肌細(xì)胞Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)量比較

    Western blotting結(jié)果顯示:模型組與對照組比較,Bax的表達(dá)量顯著升高(P<0.001);AMD3100組與模型組比較,Bax表達(dá)量顯著升高(P<0.05),Bcl-2表達(dá)量有降低趨勢(P=0.061),Bax/Bcl-2值顯著升高(P<0.001);鹿紅方中劑量組與模型組比較,Bax表達(dá)顯著降低,Bcl-2表達(dá)量顯著升高,Bax/Bcl-2值顯著降低(P<0.001);鹿紅方+AMD3100組與鹿紅方中劑量組比較,Bax表達(dá)量顯著升高,Bcl-2表達(dá)量顯著降低,Bax/Bcl-2值顯著升高(P<0.001)。見表5,圖4~圖5。

    表5 各組心肌細(xì)胞Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)量比較(±s)

    表5 各組心肌細(xì)胞Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)量比較(±s)

    注:與鹿紅方中劑量組比較,★P<0.001。

    組別對照組模型組AMD3100組鹿紅方中劑量組鹿紅方+AMD3100組Bax/GAPDH 0.02±0.01 0.69±0.08#0.78±0.05#*0.35±0.05#*0.61±0.04#★Bcl-2/GAPDH 0.12±0.01 0.29±0.03#0.23±0.04#0.57±0.05#*0.34±0.04#★Bax/Bcl-2 0.17±0.03 2.3±0.23#3.4±0.6#*0.62±0.14#*1.78±0.13#★

    圖4 各組Bax蛋白表達(dá)條帶

    圖5 各組Bcl-2蛋白表達(dá)條帶

    3 討論

    心肌梗死預(yù)后的改善有賴于更多心肌細(xì)胞的存活。及時的冠脈介入治療能挽救大部分心肌,但無復(fù)流、慢血流和微循環(huán)梗死等問題仍然導(dǎo)致了一部分心肌細(xì)胞的凋亡[2]。研究顯示,SDF-1/CXCR4信號通路在心肌細(xì)胞抗凋亡方面起著重要作用[6]。SDF-1屬于CXC趨化因子亞家族成員,分為SDF-1α和SDF-1β,兩者的差別在于前者比后者少4個氨基酸。CXCR4是SDF-1最主要的受體,為7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體,表達(dá)于多種細(xì)胞表面[7]。SDF-1與CXCR4結(jié)合后,可以通過后者的二聚變構(gòu)和內(nèi)在化激活下游多條信號通路,參與提高細(xì)胞在缺血缺氧環(huán)境下的抗凋亡能力[8]。

    在本研究中,我們以SDF-1/CXCR4信號通路為研究靶點,研究鹿紅方提高心肌細(xì)胞抗凋亡能力的部分機(jī)制。鹿紅方中鹿角溫補(bǔ)肝腎、補(bǔ)益精血,使腎氣有根,陽氣上通于心,紅花活血化瘀通經(jīng),兼涼血解毒,共為君藥;桂枝溫通心陽;黃芪、黨參益氣扶正;葶藶子瀉肺平喘。諸藥合用,共奏溫補(bǔ)心腎陽氣、活血利水之功效。心肌梗死后,罪犯血管堵塞,心梗區(qū)域缺氧無灌注的狀態(tài)當(dāng)屬中醫(yī)學(xué)“心血瘀阻”證范疇[9],鹿紅方益氣活血的功效切合該病機(jī)。鹿紅方長期在臨床應(yīng)用,在改善心衰,尤其是冠心病心衰臨床癥狀和預(yù)后方面,療效顯著。前期的臨床研究結(jié)果也提示,鹿紅方有確切的抗心衰臨床療效[10-12],而其作用機(jī)制研究正不斷深入開展。

    現(xiàn)代藥理研究表明,組成本方的6味藥物均有不同程度的細(xì)胞保護(hù)和增強(qiáng)抗凋亡能力的作用:黃芪中的黃芪甲苷、紅花中的羥基紅花黃色素A有明確抗心肌細(xì)胞凋亡的作用[13-14],葶藶子有效成分能顯著改善缺氧心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激失衡狀態(tài)[15];桂枝有效成分肉桂酸具有保護(hù)心肌梗死后心肌細(xì)胞損傷的作用[16];鹿角蛋白具有保護(hù)急性缺血時心肌微循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用[17];黨參內(nèi)酯可通過作用于胰島素樣生長因子Ⅱ受體減少心肌細(xì)胞凋亡[18]。

    本研究結(jié)果顯示,模型組SDF-1和CXCR4蛋白表達(dá)水平顯著上升。這是因為在缺血缺氧環(huán)境下,缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)家族成員激活,后者可直接調(diào)控一些生長因子的轉(zhuǎn)錄,如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板源性生長因子(PDGF)、生長因子(HGF)等,其中還包括化學(xué)趨化因子如SDF-1的轉(zhuǎn)錄[19-21]。在缺血、缺氧時,SDF-1的表達(dá)在HIF-1的作用下得到上調(diào);而CXCR4也在HIF-1的介導(dǎo)下表達(dá)增加,從而使SDF-1與CXCR4結(jié)合增加,激活下游信號通路發(fā)揮抗缺血缺氧效應(yīng)[19]。本研究結(jié)果顯示的缺血缺氧激發(fā)心肌細(xì)胞分泌SDF-1和CXCR4的效應(yīng)與前期研究報道一致[22]。

    用CXCR4受體拮抗劑AMD3100阻斷SDF-1/CXCR4通路后,Bax的表達(dá)顯著升高,Bcl-2的表達(dá)顯著降低,Bax/Bcl-2數(shù)值升高,表明凋亡程度加重,從反面驗證了SDF-1/CXCR4信號通路激活對心肌細(xì)胞在缺血、缺氧應(yīng)激下的抗凋亡效應(yīng)。同時,我們注意到AMD3100組SDF-1和CXCR4的表達(dá)顯著上升,這可能是因為阻斷兩者結(jié)合后,信號通路的下游關(guān)鍵蛋白的磷酸化受阻,細(xì)胞內(nèi)可能存在某種反饋系統(tǒng),刺激SDF-1和CXCR4的分泌,值得進(jìn)一步研究。鹿紅組與模型組比較,SDF-1/CXCR4表達(dá)顯著上升,同時Bax的表達(dá)顯著降低,Bcl-2的表達(dá)顯著升高,Bax/Bcl-2數(shù)值降低,提示鹿紅方可通過上調(diào)SDF-1/CXCR4軸的表達(dá),提高心肌細(xì)胞的抗凋亡能力。在用AMD3100拮抗SDF-1/CXCR4信號通路后,鹿紅方提高心肌細(xì)胞抗凋亡能力的作用受到抑制,從反面說明鹿紅方發(fā)揮作用的機(jī)制部分是通過上調(diào)SDF-1/CXCR4信號通路的表達(dá)實現(xiàn)的。

    綜上所述,鹿紅方可提高缺血缺氧狀態(tài)下心肌細(xì)胞的抗凋亡能力,其機(jī)制與上調(diào)SDF-1/CXCR4信號通路有關(guān)。本研究的結(jié)果為鹿紅方的臨床應(yīng)用提供了一定的生物學(xué)依據(jù),但進(jìn)一步的作用機(jī)制有待更深入的研究。

    猜你喜歡
    紅方心肌細(xì)胞通路
    如何在方格紙上確定位置
    左歸降糖舒心方對糖尿病心肌病MKR鼠心肌細(xì)胞損傷和凋亡的影響
    活血解毒方對缺氧/復(fù)氧所致心肌細(xì)胞凋亡的影響
    心肌細(xì)胞慢性缺氧適應(yīng)性反應(yīng)的研究進(jìn)展
    槲皮素通過抑制蛋白酶體活性減輕心肌細(xì)胞肥大
    Kisspeptin/GPR54信號通路促使性早熟形成的作用觀察
    proBDNF-p75NTR通路抑制C6細(xì)胞增殖
    通路快建林翰:對重模式應(yīng)有再認(rèn)識
    試論棋例裁決難點
    棋藝(2014年3期)2014-05-29 14:27:14
    Hippo/YAP和Wnt/β-catenin通路的對話
    遺傳(2014年2期)2014-02-28 20:58:11
    日本色播在线视频| 午夜免费观看性视频| 日本熟妇午夜| 亚洲精品自拍成人| 亚洲自偷自拍三级| 美女内射精品一级片tv| 国产91av在线免费观看| 日本熟妇午夜| 亚洲精品成人久久久久久| 久久久精品欧美日韩精品| 国产片特级美女逼逼视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产三级在线视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲精品,欧美精品| 国产 一区精品| 最新中文字幕久久久久| 久久久久久伊人网av| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲国产欧美人成| 成人午夜高清在线视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 精品欧美国产一区二区三| 国产中年淑女户外野战色| 国产在视频线在精品| 精品少妇黑人巨大在线播放| 男的添女的下面高潮视频| 美女大奶头视频| 日本wwww免费看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲av.av天堂| 久久久久久久午夜电影| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久韩国三级中文字幕| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 麻豆成人午夜福利视频| 麻豆av噜噜一区二区三区| av线在线观看网站| 午夜免费观看性视频| 久久久久国产网址| 免费观看在线日韩| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲av.av天堂| 激情 狠狠 欧美| 国产免费视频播放在线视频 | 又大又黄又爽视频免费| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 成人亚洲精品av一区二区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 热99在线观看视频| 午夜免费激情av| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产高清不卡午夜福利| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产精品人妻久久久久久| 男女边摸边吃奶| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 99热全是精品| 搞女人的毛片| 日本wwww免费看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产久久久一区二区三区| 三级经典国产精品| 日日撸夜夜添| 毛片女人毛片| 免费人成在线观看视频色| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲自偷自拍三级| 久久久久精品性色| 免费av观看视频| 国产极品天堂在线| 一个人免费在线观看电影| 女人被狂操c到高潮| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 免费无遮挡裸体视频| 精品国产三级普通话版| 亚洲精品国产av成人精品| 国产色爽女视频免费观看| 大话2 男鬼变身卡| 色综合站精品国产| 国产精品一二三区在线看| 国产精品不卡视频一区二区| 黄片wwwwww| 久久韩国三级中文字幕| 一级爰片在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国国产精品蜜臀av免费| 日本黄色片子视频| 免费大片黄手机在线观看| 欧美bdsm另类| 一本久久精品| 可以在线观看毛片的网站| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲精品国产成人久久av| 韩国av在线不卡| 中文资源天堂在线| 热99在线观看视频| 在线 av 中文字幕| 日韩成人伦理影院| 亚洲成人中文字幕在线播放| 成人午夜高清在线视频| 在线观看人妻少妇| av网站免费在线观看视频 | 亚洲人成网站高清观看| 中文字幕av成人在线电影| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产视频内射| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品一及| 水蜜桃什么品种好| 欧美人与善性xxx| 日韩中字成人| 大香蕉97超碰在线| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产 一区精品| 美女内射精品一级片tv| 秋霞伦理黄片| 啦啦啦啦在线视频资源| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲18禁久久av| 国产人妻一区二区三区在| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲熟女精品中文字幕| 好男人视频免费观看在线| 亚洲在线自拍视频| 免费看a级黄色片| 亚洲精品久久午夜乱码| 又爽又黄a免费视频| 国内精品美女久久久久久| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产精品一二三区在线看| 伦理电影大哥的女人| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | av福利片在线观看| 亚洲av中文av极速乱| 永久免费av网站大全| 午夜免费观看性视频| 国产探花极品一区二区| 国产精品综合久久久久久久免费| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲四区av| 亚洲不卡免费看| 欧美+日韩+精品| 久久精品人妻少妇| 国产 亚洲一区二区三区 | 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产一级毛片在线| 欧美高清成人免费视频www| 国产精品一区二区性色av| 精品久久久久久电影网| 国精品久久久久久国模美| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 一级毛片久久久久久久久女| av黄色大香蕉| 日韩av在线免费看完整版不卡| 青青草视频在线视频观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲精品视频女| 日韩av在线大香蕉| 午夜视频国产福利| 热99在线观看视频| 国产麻豆成人av免费视频| 久久久久国产网址| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲av一区综合| 在线观看人妻少妇| 亚洲成人精品中文字幕电影| 免费观看的影片在线观看| 亚洲精品一二三| 26uuu在线亚洲综合色| 高清欧美精品videossex| 97超碰精品成人国产| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产美女午夜福利| 国产毛片a区久久久久| 爱豆传媒免费全集在线观看| 91精品国产九色| 日本-黄色视频高清免费观看| 搡老乐熟女国产| 成年av动漫网址| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 联通29元200g的流量卡| 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲国产精品成人久久小说| 白带黄色成豆腐渣| 中国国产av一级| 亚洲美女搞黄在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 91精品伊人久久大香线蕉| 成年女人在线观看亚洲视频 | 毛片一级片免费看久久久久| 中文字幕av在线有码专区| 又大又黄又爽视频免费| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产精品一区二区在线观看99 | 成人美女网站在线观看视频| 亚洲精品成人久久久久久| 男插女下体视频免费在线播放| 在线播放无遮挡| 七月丁香在线播放| a级毛色黄片| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 国产午夜精品论理片| 亚洲国产精品专区欧美| 国产中年淑女户外野战色| 国产男女超爽视频在线观看| 青青草视频在线视频观看| 日本一本二区三区精品| 日韩精品有码人妻一区| 少妇人妻精品综合一区二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美性感艳星| 中文字幕久久专区| 久久久成人免费电影| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 色网站视频免费| 激情 狠狠 欧美| 久久久a久久爽久久v久久| 只有这里有精品99| av女优亚洲男人天堂| 黄色一级大片看看| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 午夜日本视频在线| 免费观看的影片在线观看| 十八禁网站网址无遮挡 | 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲av福利一区| 亚洲国产成人一精品久久久| 只有这里有精品99| 亚洲成人久久爱视频| 国产黄片美女视频| 日本免费a在线| 亚洲在线观看片| 在线观看一区二区三区| 国产成人aa在线观看| 大陆偷拍与自拍| 综合色丁香网| 午夜视频国产福利| 国产成人精品婷婷| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产高潮美女av| 色播亚洲综合网| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 美女黄网站色视频| 国产久久久一区二区三区| 只有这里有精品99| 成人av在线播放网站| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产精品av视频在线免费观看| 久久精品国产亚洲网站| 国产高潮美女av| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产视频首页在线观看| 天堂影院成人在线观看| 又大又黄又爽视频免费| 色视频www国产| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 精品人妻偷拍中文字幕| 禁无遮挡网站| 九九在线视频观看精品| 国产av国产精品国产| 赤兔流量卡办理| 国产一区亚洲一区在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 边亲边吃奶的免费视频| 国产精品熟女久久久久浪| 国产毛片a区久久久久| 天堂√8在线中文| 久久久久性生活片| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 人妻少妇偷人精品九色| 中国美白少妇内射xxxbb| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲三级黄色毛片| 免费看a级黄色片| 久久韩国三级中文字幕| 欧美一级a爱片免费观看看| freevideosex欧美| 国精品久久久久久国模美| 国产综合懂色| 男的添女的下面高潮视频| 国产精品女同一区二区软件| 久久久久久久大尺度免费视频| 大陆偷拍与自拍| 国产高清有码在线观看视频| 中文资源天堂在线| 精品一区在线观看国产| 99久久精品一区二区三区| 99热网站在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产精品久久久久久精品电影小说 | 直男gayav资源| 日韩中字成人| 欧美极品一区二区三区四区| 久久99精品国语久久久| 国产亚洲一区二区精品| 久久久亚洲精品成人影院| 日本一二三区视频观看| 老司机影院毛片| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲,欧美,日韩| 97在线视频观看| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲av不卡在线观看| 久久99精品国语久久久| 美女高潮的动态| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产麻豆成人av免费视频| 我的老师免费观看完整版| 99久久精品国产国产毛片| 老司机影院毛片| 嫩草影院新地址| 91狼人影院| a级毛片免费高清观看在线播放| 黄色欧美视频在线观看| 少妇的逼好多水| 免费少妇av软件| 我的女老师完整版在线观看| 99热这里只有是精品50| 国产成人精品婷婷| av专区在线播放| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 水蜜桃什么品种好| 亚洲av二区三区四区| 丰满乱子伦码专区| 国产精品久久久久久久久免| 网址你懂的国产日韩在线| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产单亲对白刺激| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 成人午夜高清在线视频| 亚洲三级黄色毛片| 婷婷色综合大香蕉| 高清欧美精品videossex| 麻豆成人av视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 成人鲁丝片一二三区免费| 精品熟女少妇av免费看| 69人妻影院| 国产精品99久久久久久久久| 国产av国产精品国产| 亚洲最大成人中文| 丝袜美腿在线中文| av天堂中文字幕网| 午夜免费激情av| 高清午夜精品一区二区三区| 久久久久九九精品影院| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 日韩精品青青久久久久久| 免费黄色在线免费观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 久久精品夜色国产| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 国产成人精品久久久久久| 国产在视频线精品| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 午夜福利视频1000在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| av女优亚洲男人天堂| 欧美精品一区二区大全| 一级黄片播放器| 亚洲精品视频女| 少妇熟女欧美另类| 亚洲欧美精品专区久久| 成人鲁丝片一二三区免费| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产精品一二三区在线看| 街头女战士在线观看网站| 天堂俺去俺来也www色官网 | 三级毛片av免费| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 久久久精品免费免费高清| 一级a做视频免费观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 床上黄色一级片| 久久久a久久爽久久v久久| 国产精品人妻久久久影院| 中文字幕久久专区| or卡值多少钱| 久久鲁丝午夜福利片| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产精品一区二区在线观看99 | 少妇高潮的动态图| 成人无遮挡网站| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| av又黄又爽大尺度在线免费看| 99热这里只有是精品50| 国产黄a三级三级三级人| 啦啦啦韩国在线观看视频| 成人特级av手机在线观看| av在线亚洲专区| 日本免费a在线| 大香蕉久久网| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产午夜福利久久久久久| av女优亚洲男人天堂| 亚洲精品视频女| 干丝袜人妻中文字幕| 日韩伦理黄色片| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 色吧在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 三级经典国产精品| 一级二级三级毛片免费看| 国产探花在线观看一区二区| 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美3d第一页| 边亲边吃奶的免费视频| videossex国产| www.av在线官网国产| 淫秽高清视频在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 午夜免费激情av| 十八禁网站网址无遮挡 | 97热精品久久久久久| 久久久久国产网址| 插阴视频在线观看视频| 成年版毛片免费区| 免费看a级黄色片| 在现免费观看毛片| 成人亚洲精品一区在线观看 | 少妇的逼水好多| 亚洲av成人av| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲国产av新网站| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 欧美日韩精品成人综合77777| 久久久久性生活片| 男人舔奶头视频| 午夜爱爱视频在线播放| 国产午夜福利久久久久久| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 身体一侧抽搐| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 精华霜和精华液先用哪个| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲av福利一区| 亚洲精品一二三| 免费观看无遮挡的男女| 永久网站在线| 成年免费大片在线观看| www.色视频.com| 成人一区二区视频在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 国产成人精品福利久久| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产黄a三级三级三级人| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美zozozo另类| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲人与动物交配视频| 国产不卡一卡二| 国产成人精品一,二区| 国产亚洲91精品色在线| 亚洲精品一二三| 久久韩国三级中文字幕| 欧美精品一区二区大全| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 少妇人妻精品综合一区二区| 精品国产三级普通话版| 可以在线观看毛片的网站| 视频中文字幕在线观看| 日本免费在线观看一区| 秋霞在线观看毛片| 成人国产麻豆网| 欧美97在线视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 黄片wwwwww| 精品久久久噜噜| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲成色77777| 国产精品一区www在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看| 日日啪夜夜爽| 亚洲最大成人av| h日本视频在线播放| 国产精品一区www在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 联通29元200g的流量卡| 两个人视频免费观看高清| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 精品亚洲乱码少妇综合久久| 激情五月婷婷亚洲| 波野结衣二区三区在线| 免费黄色在线免费观看| 亚洲伊人久久精品综合| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 91久久精品国产一区二区成人| 国产成人精品久久久久久| 免费看av在线观看网站| 国产 亚洲一区二区三区 | 国产在线男女| 在线观看免费高清a一片| ponron亚洲| 精品久久久久久成人av| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 看十八女毛片水多多多| 久99久视频精品免费| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 91狼人影院| 午夜免费激情av| 亚洲乱码一区二区免费版| 天堂影院成人在线观看| av在线天堂中文字幕| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久久精品免费免费高清| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲精品日韩在线中文字幕| av黄色大香蕉| 一级毛片久久久久久久久女| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产精品久久久久久久久免| 一级片'在线观看视频| 日韩国内少妇激情av| 亚洲精品日本国产第一区| 黄片wwwwww| 日韩欧美一区视频在线观看 | 国产精品综合久久久久久久免费| 99热这里只有精品一区| 91久久精品国产一区二区三区| 一个人看的www免费观看视频| 免费黄色在线免费观看| 国产精品一及| 十八禁网站网址无遮挡 | 少妇丰满av| 国产激情偷乱视频一区二区| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲真实伦在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 一级毛片久久久久久久久女| av在线蜜桃| 99热这里只有精品一区| 国产视频首页在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 成人二区视频| 精品久久久久久久久av| 免费av不卡在线播放| 人妻系列 视频| 亚洲精品色激情综合| 亚洲在久久综合| 成人性生交大片免费视频hd| 精品久久久久久电影网| 国产伦一二天堂av在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产成人午夜福利电影在线观看| 婷婷色综合www| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产一区二区三区av在线| 青春草视频在线免费观看| av卡一久久| 国产黄频视频在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 欧美成人a在线观看| 国产黄频视频在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品久久视频播放| 免费看a级黄色片| 青春草视频在线免费观看| 大片免费播放器 马上看| 久久久午夜欧美精品| 在线观看人妻少妇| 久久6这里有精品| 亚洲精品亚洲一区二区| 又爽又黄a免费视频| 久久精品综合一区二区三区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 毛片女人毛片| 亚洲欧洲国产日韩| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 精品熟女少妇av免费看| 国产亚洲一区二区精品| 九色成人免费人妻av| av福利片在线观看| 超碰97精品在线观看| 久久久久久久午夜电影| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲精品乱码久久久v下载方式|