角蛋白17對大鼠胰腺纖維化模型的影響

曾曉龍，嚴(yán) 安，嚴(yán)妍妍，高 雅，王小明

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 肝膽外科,安徽 蕪湖 241001)

胰腺癌(pancreatic cancer，PAC)是惡性程度最高、預(yù)后最差，同時也是病死率最高的癌癥之一[1]。有研究報道，經(jīng)手術(shù)切除及放、化療等輔助治療后的PAC患者5年生存率仍低于10%[2]。胰腺纖維化在PAC中發(fā)揮重要作用[3]。

角蛋白屬于中間絲蛋白的超家族，可分為Ⅰ型酸性蛋白和Ⅱ型堿性蛋白[4]。角蛋白17(kevatin,KRT17)是Ⅰ型角蛋白，包含432個氨基酸，分子量為48 ku[5]。研究表明，KRT17被認(rèn)為是多種疾病尤其是PAC的診斷和預(yù)后標(biāo)志物[6]。已有研究探討KRT17在PAC中的作用及其潛在的功能機制，并證實抑制KRT17可能是PAC治療的新靶標(biāo)[7]。但KRT17在胰腺纖維化中的作用鮮有報道，本研究通過腹腔內(nèi)注射二乙基二硫代氨基甲酸鹽(Diethyldithiocarbamate，DDC)建立大鼠胰腺纖維化模型,采用注射不同次數(shù)DDC溶液的方法，觀察各組大鼠胰腺組織中Ⅰ型膠原含量的變化，探討KRT17在大鼠胰腺纖維化中的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇成年健康SD雄性大鼠20只，體質(zhì)量180～220 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲水和進食，自然晝夜節(jié)律光照。隨機分為對照組、模型組，其中模型組又分為4組，每組各4只。本研究方案已獲得弋磯山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 DDC購自上海麥克林生化科技有限公司，KRT17一抗、Ⅰ型膠原一抗購自Affinity公司，β-actin購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的小鼠抗兔IgG、二抗兔IgG SABC免疫組化染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 復(fù)制模型 大鼠胰腺纖維化模型參考宋敏敏、蘇麗婷等[8-9]采用的造模方法并進行改進，采用腹腔內(nèi)注射DDC溶液建立大鼠胰腺纖維化模型。實驗前大鼠禁食12 h，自由飲水。將DDC與生理鹽水配制成10%的DDC溶液，臨用前現(xiàn)配，隔日1次向腹腔內(nèi)注射DDC溶液，700 mg/kg，連續(xù)注射多次。每次給藥1 h后，大鼠自由飲水進食。對照組注射同等體積生理鹽水。模型各組分別于實驗第7、15、22、30天，腹腔內(nèi)注射麻藥并處死大鼠。

1.4 數(shù)據(jù)采集

1.4.1 標(biāo)本采集與制備 各組大鼠造模后均采用腹腔麻醉，頸動脈采血，室溫靜置后離心得到血清。取胰腺組織，一部分使用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)行8 μm切片，并對切片行免疫組化測定。另一部分胰腺組織放置于-80℃冰箱，后期進行Western blot測定。

1.4.2 免疫組化法測定胰腺組織中Ⅰ型膠原 將取出的胰腺組織固定在4%多聚甲醛中，常規(guī)石蠟包埋，采用輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機行8 μm切片。胰腺組織切片脫蠟后，用3%H2O2阻斷內(nèi)源過氧化物酶活性。在枸櫞酸緩沖液中微波修復(fù)抗原，滴加免疫染色強力通透液，暴露抗原作用靶點。用5%牛血清白蛋白封閉，加入Collagen Ⅰ抗體(1∶200稀釋)，4℃下孵育過夜。次日，滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體作為二抗、SABC作為三抗孵育，再用增強型HRP-DAB底物顯色試劑染色。光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺組織中Ⅰ型膠原的表達水平，采用Image-Pro Plus軟件分析平均光密度值計算IOD比值。選取部分切片用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，觀察細(xì)胞核數(shù)量變化。

1.4.3 Western blot法測定胰腺組織中KRT17的含量 取各組大鼠胰腺組織，剪碎放入2 mL EP管中，使用含1%PMSF的RIPA裂解緩沖液提取每個樣品的總蛋白，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白質(zhì)定量測定。用SDS-PAGE凝膠電泳法分離，濃縮膠80 V恒壓30 min，分離膠120 V恒壓電泳至溴酚藍剛到膠板底部。轉(zhuǎn)移至NC膜上，100 V恒壓轉(zhuǎn)印90 min，將膜溶于5%脫脂奶粉溶液室溫封閉60 min并與KRT17多克隆抗體(1∶1 000稀釋)在4℃孵育過夜。用TBST洗3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記小鼠抗兔IgG(H+L)抗體作為二抗，在4℃孵育90 min，然后使用ECL發(fā)光顯色。以β-actin作為內(nèi)參定量。使用Image J軟件對所得蛋白條帶進行灰度值分析，計算出KRT17蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 實驗過程中，大鼠體質(zhì)量有所變化，對照組增加最明顯，其次是模型第7、15、22天組，增加最少的為第30天組。實驗1周后，模型組大鼠飲食飲水量低于對照組，皮毛無光澤，活動情況不佳，精神萎靡。實驗2周后模型組部分大鼠出現(xiàn)大便稀溏、異味加重等情況。模型第22、30天組死亡大鼠各1只。死亡的大鼠體型消瘦，其中一只眼眶出血。

2.2 胰腺大體標(biāo)本的改變 對照組大鼠胰腺組織淡黃色偏白，質(zhì)地柔軟有光澤；模型組大鼠胰腺呈灰白色，組織結(jié)構(gòu)萎縮，見圖1。

圖1 各組大鼠胰腺大體標(biāo)本(箭頭所示)

2.3 病理結(jié)果、胰腺組織中Ⅰ型膠原表達水平 光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)對照組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，無明顯損傷；模型組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)呈萎縮狀，Ⅰ型膠原纖維生成增多，降解減少，并隨著模型組造模時間的延長胰腺纖維化程度逐漸加重，免疫組化圖片陽性面積增大，經(jīng)蘇木精復(fù)染，陽性區(qū)域細(xì)胞核減少，見圖2、3。通過測定胰腺組織免疫組化切片鏡下圖片的平均光密度值(IOD)(同等拍攝條件)，分析胰腺組織中I型膠原表達水平。第15、22、30天組胰腺組織中I型膠原表達水平均高于對照組(P<0.05)；第22、30天組胰腺組織中I型膠原表達水平均高于第7、15天組(P<0.05)，見表1。

圖2 各組大鼠胰腺組織DAB染色(×200)

圖3 各組大鼠胰腺組織DAB染色后蘇木精復(fù)染(×200)

表1 胰腺組織免疫組化切片鏡下圖片的IOD值

2.4 胰腺組織中白細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞絕對值、葡萄糖含量 第15、22、30天組胰腺組織中白細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞絕對值、葡萄糖含量均高于對照組(P<0.05);第22、30天組胰腺組織中白細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞絕對值、葡萄糖含量高于第7天組(P<0.05);第22天組胰腺組織中葡萄糖含量高于第15天組(P<0.05)；第30天組胰腺組織中白細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞絕對值、葡萄糖含量高于第15天組(P<0.05)，見表2。

表2 胰腺組織中白細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞絕對值、葡萄糖含量

2.5 胰腺組織中KRT17蛋白含量 第15、22、30天組/β-actin胰腺組織中KRT17蛋白含量均高于對照組/β-actin(P<0.05);且第22、30天組/β-actin高于第7、15天組/β-actin(P<0.05)，見圖4、表3。

圖4 各組大鼠胰腺組織中KRT17蛋白的表達水平

表3 胰腺組織中KRT17的相對表達量

3 討論

研究表明，KRT17的異常表達與細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)展有關(guān)，例如子宮頸癌[10]、胃癌[11]等。研究也證實，KRT17在PAC患者體內(nèi)異常表達。但是尚未有報道其在胰腺纖維化中的作用表達。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性胰腺炎的發(fā)生與胰腺纖維化關(guān)系密切。同時慢性胰腺炎又可持續(xù)進展為PAC[12]。

在本研究中，采用腹腔內(nèi)注射DDC溶液建立大鼠胰腺纖維化模型，本方法克服了之前的尾靜脈注射周期短、操作困難等不足并且降低了并發(fā)癥的發(fā)生率及大鼠的病死率。研究結(jié)果顯示，對照組胰腺組織未見明顯病理改變，模型組胰腺組織結(jié)構(gòu)萎縮，炎性細(xì)胞浸潤，I型膠原沉積，符合胰腺纖維化病理特征，由此可見本實驗胰腺纖維化模型制作成功。

除此之外，本項研究的開展，主要是為了更好地了解KRT17在胰腺纖維化中的作用，以便對此破壞性疾病進行干預(yù)治療。研究結(jié)果表明，胰腺纖維化程度越高，其組織中的KRT17表達水平越高，其表達水平與胰腺纖維化程度呈正相關(guān)，表明高水平的KRT17是導(dǎo)致胰腺纖維化的一個關(guān)鍵因子。

胰腺纖維化與胰腺細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積有關(guān)，這不僅會導(dǎo)致胰島素分泌減少，還會引起葡萄糖代謝紊亂[13]。本實驗結(jié)果表明，隨著胰腺纖維化程度的加重，葡萄糖含量亦逐漸升高。

對于慢性胰腺炎，其有著大量的浸潤性粒細(xì)胞，例如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，其中粒細(xì)胞浸潤在慢性胰腺炎的發(fā)病機制中至關(guān)重要[14]。本研究結(jié)果亦表明，隨著胰腺纖維化程度的增加，白細(xì)胞數(shù)亦逐漸增加。這也進一步證明了本實驗的正確性。

通過以往研究可知，慢性胰腺炎的病理生理學(xué)機制相當(dāng)復(fù)雜，且不完全清楚[15]。其是一種動態(tài)炎癥過程，特征為進行性纖維化，伴隨著疼痛或外分泌和內(nèi)分泌功能失調(diào)[16]。胰腺纖維化是早期慢性胰腺炎的主要可逆性病理變化[17]。慢性胰腺炎的持續(xù)發(fā)作又可引起PAC的發(fā)生[12]。而廣泛的纖維化也是PAC發(fā)展、生長、轉(zhuǎn)移和抗治療的基礎(chǔ)[18]。本研究提示胰腺纖維化加重程度與KRT17水平上升有關(guān)，證實了KRT17在胰腺纖維化形成過程中起著重要作用。我們可以通過進一步研究來抑制纖維化程度的發(fā)生、發(fā)展，從而推進PAC的治療進程。

本研究表明，在腹腔注射DDC溶液誘導(dǎo)的大鼠胰腺纖維化模型中，隨著胰腺組織纖維化程度的加深，KRT17表達水平升高。我們的研究結(jié)果顯示，KRT17與胰腺纖維化程度呈正相關(guān)關(guān)系，可能對胰腺疾病的臨床治療有幫助，并可能用于胰腺纖維化的治療新靶標(biāo)。

(本研究得到了皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院肝膽外科陳鵬老師悉心的全程指導(dǎo)，在此特別鳴謝。)