去氫延胡索素抗膀胱癌的作用機制

劉甜甜，張 澤，王 沖，黃后寶，李亞偉

(皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 泌尿外科，安徽 蕪湖 241001)

膀胱癌是一種常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,每年新發(fā)病例約57萬例[1]。雖然膀胱癌的手術(shù)方式和治療手段在近些年有了可喜的進展，然而對于膀胱癌預后的改善卻依然沒有令人滿意的成果[2-3]。外科手術(shù)和術(shù)后輔以化療是膀胱癌的主要治療方法，由于化療藥物的毒副作用和耐藥性的產(chǎn)生，使其臨床療效大大降低[4]。因此,尋找新型化療藥物對膀胱癌的治療和預后尤為重要。

天然產(chǎn)物是抗癌化合物的重要來源，如紫杉醇、喜樹堿、長春堿等[5-7]都是直接或間接從天然產(chǎn)物中提取出來的。在各種植物活性化合物中，生物堿的抗癌作用最為顯著。去氫延胡索素(Dehydrocorydaline,DHC)是從中藥延胡索中分離得到的一種生物堿，具有抗炎、抗癌等功效[8-9]。目前關(guān)于DHC的抗腫瘤效應已經(jīng)有相關(guān)報道,但其對膀胱癌細胞的具體生物學功能及其機制研究并不完善。本研究旨在探究DHC對膀胱癌細胞增殖，遷移，侵襲和凋亡能力的影響以及潛在的生物學機制,以探究其是否可作為潛在的抗膀胱癌候選藥物。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng) 人膀胱癌細胞系T24、EJ來自于富衡生物科技有限公司(上海)。T24和EJ細胞在RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco,美國)中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素雙抗的培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。

1.2 CCK-8實驗 采用CCK-8試劑盒(Yeason,上海)計算DHC的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。T24和EJ細胞(3×103細胞/孔)接種96孔板，細胞貼壁后,不同濃度的DHC(200、100、50、25、0 μmol/L,MCE，上海)添加到96孔板內(nèi)孵育24、48、72、96 h,然后每孔添加10 μL CCK-8試劑,37℃避光孵育2 h。最后在450 nm處測量光密度(OD)值，計算DHC不同濃度組的生長抑制率=(1-實驗孔平均OD值/對照孔平均OD值)×100%，然后用SPSS 26.0計算DHC的IC50值。

1.3 EdU實驗 將處理后的膀胱癌細胞(1×104細胞/孔)接種于96孔板。細胞在恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h，然后根據(jù)EdU試劑盒(銳博，中國)說明書，逐步添加相關(guān)試劑。細胞增殖率為EdU陽性細胞與hoechst染色細胞之比。

1.4 劃痕實驗 將處理后的膀胱癌細胞接種在6孔板中，待細胞長至80%～90%時，用200 μL的槍頭垂直劃線，PBS洗3次，并加入2%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,分別于0、24 h拍照。

1.5 Transwell小室遷移和基質(zhì)膠侵襲實驗 將處理后的膀胱癌細胞胰酶消化，無血清培養(yǎng)基重懸，然后每個小室加入2萬個細胞，下室加入600 μL完全培養(yǎng)基，24 h后取出小室，經(jīng)固定、染色后于倒置顯微鏡下拍照。侵襲實驗是在小室內(nèi)鋪一層基質(zhì)膠，然后加入4萬個細胞，后續(xù)步驟同遷移實驗。

1.6 Annexin V-FITC/PI雙染實驗 凋亡試劑盒購買于上海貝博生物科技有限公司。收集處理過的T24和EJ細胞，并重懸在1×Annexin V結(jié)合液中。經(jīng)Annexin V-FITC和PI處理后，立即用流式細胞儀(CytoFLEX LX)測定。

1.7 Western blot 用含有1%蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解液裂解處理細胞，提取的蛋白質(zhì)經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，孵育一抗和二抗后，最后用ECL顯影?？贵wBAX、BCL-2、β-actin和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體購自Cell Signaling Technology(CST,USA)。

2 結(jié)果

2.1 DHC抑制膀胱癌細胞增殖 CCK-8法檢測5種不同劑量的DHC處理膀胱癌細胞株48 h后的細胞活力，實驗結(jié)果顯示，與對照組0 μmol/L相比，25、50、100、200 μmol/L的T24和EJ細胞活性均降低(F=1 844.864、5 702.594，P<0.01)。根據(jù)DHC的不同藥物濃度及其對應的藥物生長抑制率計算出DHC對T24和EJ細胞的IC50值分別為129.323、150.274 μmol/L，見圖1A；后續(xù)實驗將DHC的IC50值設為140 μmol/L，用140 μmol/L的DHC處理T24和EJ細胞。結(jié)果表明，與對照組相比，隨著時間的延長，DHC均明顯抑制T24和EJ細胞的增殖(P<0.01),見圖1B；EdU染色法進一步表明，140 μmol/L的DHC處理細胞后，對膀胱癌細胞有明顯的抑制作用,與對照組相比，T24和EJ細胞的EdU陽性細胞比例均下降(t=33.586、44.042，P<0.01)，見圖1C。

A.CCK-8實驗檢測不同濃度DHC處理膀胱癌細胞48 h后的細胞活力；B.CCK-8實驗檢測140 μmol/L DHC處理膀胱癌細胞24、48、72、96 h后的細胞活力；C.EdU實驗表明DHC可抑制膀胱癌細胞的增殖。與0 μmol/L或?qū)φ战M(CTL)比較，**P<0.01。

2.2 DHC抑制膀胱癌細胞遷移和侵襲 采用劃痕實驗檢測細胞遷移能力，結(jié)果表明，與對照組相比，DHC處理的T24和EJ細胞均阻斷了細胞遷移速度(t=17.709、30.619，P<0.01)，見圖2A；Transwell遷移實驗進一步表明，與對照組相比，DHC處理的T24和EJ細胞均抑制了細胞遷移能力(t=22.079、21.400，P<0.01),見圖2B；同樣，Transwell侵襲實驗證實DHC處理降低了通過基質(zhì)膠涂層膜的T24和EJ細胞的數(shù)量(t=22.419、23.098,P<0.01)，見圖2B。表明DHC可以抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲。

A.劃痕實驗表明DHC可抑制膀胱癌細胞的遷移；B.Transwell遷移和侵襲實驗表明DHC可以抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲。與CTL比較，**P<0.01。

2.3 DHC誘導膀胱癌細胞凋亡 Annexin V-FITC/PI雙染實驗檢測細胞凋亡水平，實驗結(jié)果表明，與對照組比較，DHC處理后的T24和EJ細胞凋亡率均升高(t=-21.168、-36.406,P<0.01),見圖3A；用0、25、50、100、200 μmol/L DHC處理膀胱癌細胞48 h，通過Western blot檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白，與對照組0 μmol/L相比，25、50、100、200 μmol/L的T24和EJ細胞BAX蛋白表達均升高(F=194.941、909.611，P<0,01)，而BCL-2蛋白表達下降(F=107.573、454.587，P<0,01),見圖3B。表明DHC可以誘導膀胱癌細胞凋亡。

A.Annexin V-FITC/PI雙染實驗表明細胞經(jīng)DHC處理后，凋亡率增加；B.Western blot實驗用于評估凋亡蛋白的表達。與0 μmol/L或CTL比較，**P<0.01。

3 討論

目前膀胱癌的治療方法在延緩腫瘤進展和復發(fā)方面效果不甚理想。由于化療是影響膀胱癌預后的重要因素，在化療無應答的非肌層浸潤性膀胱癌患者中，約66%的患者會進展為肌層浸潤性膀胱癌[10]。因此，越來越多的研究者將研究方向轉(zhuǎn)為天然化合物，并且已經(jīng)成為目前研究的熱點。為改善膀胱癌患者預后和提高患者生存率，有必要尋找新的潛在藥物和治療策略。

據(jù)報道，DHC具有抗腫瘤作用，對腫瘤細胞的增殖，遷移和侵襲具有抑制作用，有望成為臨床上一種新的有效的治療藥物，Huang等通過小鼠體內(nèi)構(gòu)建移植瘤和體外細胞實驗證明DHC可以抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖[9]；Lee等報道了DHC通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達而抑制非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移[11]；Hu等報道了DHC通過抑制MEK1/2-ERK1/2級聯(lián)反應抑制黑色素瘤細胞增殖、遷移和侵襲[12]。然而，DHC在膀胱癌中的作用還沒有相關(guān)研究，因此，本研究將探討DHC在膀胱癌中的生物學作用。與上述提到的疾病相似，DHC在膀胱癌中也發(fā)揮著抗腫瘤的作用，首先用CCK-8實驗檢測DHC處理后的膀胱癌細胞的活力，本研究發(fā)現(xiàn)DHC對膀胱癌細胞的細胞毒性呈時間依賴性和劑量依賴性，EdU實驗進一步證實了DHC可以抑制膀胱癌細胞的增殖。其次通過劃痕實驗和Transwell遷移實驗證實了DHC可以抑制膀胱癌細胞的遷移；Transwell侵襲實驗證明了DHC可以抑制膀胱癌細胞的侵襲。多數(shù)抗腫瘤藥物是通過抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞程序性死亡發(fā)揮生物學作用[13]，Xu等[14]報道了DHC通過誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用；Huang等報道了乳腺癌細胞經(jīng)DHC處理后，其凋亡率顯著增加[9]。本研究通過Annexin V-FITC/PI雙染實驗證實DHC處理后，凋亡細胞比例增加。Western blot實驗進一步驗證了細胞經(jīng)DHC處理后，其促凋亡蛋白BAX蛋白水平增加，抗凋亡蛋白BCL-2蛋白水平下降。這些結(jié)果表明DHC可以抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導其凋亡。

DHC可以抑制多種疾病的進展，Huo等[15]發(fā)現(xiàn)DHC通過調(diào)節(jié)小神經(jīng)膠質(zhì)細胞的M1/M2極化減小骨腫瘤的疼痛；Hu等[12]發(fā)現(xiàn)DHC通過抑制MAPK通路的相關(guān)蛋白(MEK1/2、ERK1/2)的表達進而抑制腫瘤的增殖、遷移和侵襲。本次研究發(fā)現(xiàn)，DHC可以調(diào)節(jié)膀胱癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡，但是局限在于其具體機制仍未闡明，且沒有進行裸鼠皮下成瘤實驗(或原位癌模型)和構(gòu)建肺轉(zhuǎn)移模型。因此DHC在膀胱癌中是否有更為復雜的調(diào)控機制，以及能否在體內(nèi)抑制膀胱癌的生長和轉(zhuǎn)移需要進一步的研究。

綜上所述，DHC可以抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲，此外，DHC還通過上調(diào)BAX蛋白、下調(diào)BCL-2蛋白的表達，促進膀胱癌細胞凋亡。以上結(jié)果表明DHC有望成為一種有潛在應用價值的膀胱癌治療藥物。