張 妍,楊明珍
急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一種以造血干細胞異常生長和分化為特征的惡性疾病,具有增殖、存活和分化異常的特點[1],據(jù)最新統(tǒng)計,其死亡病例數(shù)占所有惡性腫瘤死亡病例的3.1%[2]。白血病常見的治療方法主要有化學治療、分子靶向治療及造血干細胞移植等治療手段。其死亡的主要原因仍然是化療耐藥導致的難治性或復發(fā)性疾病[3]?;钚匝?reactive oxygen species,ROS)是有氧呼吸的代謝副產物,維持細胞內氧化還原動態(tài)平衡。增高癌細胞ROS水平,會使其比正常細胞更易受到氧化應激誘導的細胞死亡[4]。去乙?;?(sirtuin 3,Sirt3)是主要位于線粒體中的去乙?;福軌蛘{節(jié)異檸檬酸脫氫酶2(isocitrate dehydrogenase 2,IDH2)、ROS的表達,可作為提高AML標準化療藥物療效的潛在治療靶點[5]。基于此,該研究探討AML患者SIRT3、IDH2與ROS的表達及其在臨床診斷和療效評價中的應用價值,以期為臨床治療提供參考。
1.1 病例資料收集2020年10月—2021年12月安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院收治的新診斷的AML(非APL)患者20例作為新診斷組,其中男9例,女11例;18.00~86.00歲,中位年齡57.00歲。2例未進行融合基因AML1-ETO檢測,16例檢測陰性;2例患者融合基因AML1-ETO陽性。治療后AML(非APL)患者40例作為經(jīng)治組,其中男22例,女18例;18.00~65.00歲,中位年齡51.50歲。7例未進行融合基因AML1-ETO檢測,25例檢測陰性;8例患者融合基因AML1-ETO陽性。其中完全緩解者20例,部分緩解者20例。完全緩解者20例中,根據(jù)不同患者治療療程,以中位數(shù)6個療程為界,其中少于等于6個治療療程11例,高于6個治療療程9例。均經(jīng)骨髓細胞形態(tài)學、免疫學、細胞遺傳學等檢測后確診為急性髓系白血病。20例正常人作為對照組。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核通過(批號:PJ2021-16-14),以及取得患者知情同意。
1.1.1對照組納入標準 ① 血常規(guī)、肝腎功能無異常,既往無腫瘤史、自身免疫性疾病病史;② 排除合并其他腫瘤性、血液性、傳染性、免疫性疾病。
1.2 主要實驗材料及試劑IDH2 ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所;SIRT3 ELISA試劑盒購自武漢基因美公司;酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司;倒置熒光顯微鏡購自德國蔡司公司。FBS胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、無水二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、Hank′s平衡鹽溶液(Hank′s balanced salt Solution,HBSS)、杜氏磷酸緩沖液(Dulbecco′s phosphate-buffered saline,D-PBS)、 2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酯(DCFH-DA)、線粒體綠色熒光探針(MITO-Tracker Green)均購自上海碧云天生物技術有限公司;人淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司。
1.3 分離骨髓單個核細胞常規(guī)骨髓穿刺,抽取新診斷組、經(jīng)治組患者及對照組骨髓液3 ml,加等量無菌PBS液用吸管反復吹打、充分混勻。加入等體積的分離液于無菌管中,將稀釋后的骨髓液緩慢平鋪到分離液上方,按照說明離心后小心吸取中間的白膜層,加入PBS液,用吸管反復吹打、混勻、離心,去上清液后將細胞收集。
1.4 測量骨髓單個核細胞內ROS的表達以1 ∶2 000的比例用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,至終濃度為5 μmol/L。收集細胞,重懸于稀釋的DCFH-DA中,吹打均勻后置入細胞培養(yǎng)箱中避光孵育20 min,用無血清培養(yǎng)基重懸細胞進行洗滌,以去除未進入細胞內的檢測試劑。收集各組細胞于倒置熒光顯微鏡下觀察,實時監(jiān)測各組平均熒光強度。并用Image J軟件分析。
1.5 測量骨髓單個核細胞線粒體內ROS表達Mito-Tracker Green用無水DMSO配制至終濃度為1 mmol/L,作為儲存液與HBSS按照比例配制成工作液。將各組已提取的骨髓單個核細胞加入適量Mito-Tracker Green工作液,吹打均勻后37 ℃避光孵育30 min,離心取上清液,無血清培養(yǎng)基重懸,全程避光,倒置熒光顯微鏡下觀察,監(jiān)測各組平均熒光濃度,并用Image J軟件分析。
1.6 ELISA方法檢測外周血血漿標本IDH2、SIRT3的表達抽取新診斷組、經(jīng)治組患者及對照組外周血3 ml置于含檸檬酸鈉管中,常溫下1 500 r/min離心10 min,收集上清液;按試劑盒說明測定外周血血漿IDH2、SIRT3的表達情況,并在平板閱讀器上于450 nm處立即測量吸光度。用二次多項式擬合曲線計算IDH2、SIRT3濃度。
1.7 觀察指標及評價標準分析比較AML(非APL)各亞組患者實驗室檢查、治療療效及不同治療療程中SIRT3的表達。
2.1 ROS在骨髓單個核細胞中的表達相比較對照組,新診斷組中ROS表達明顯上調,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。相較于新診斷組,經(jīng)治組ROS表達明顯下調,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。
圖1 三組骨髓單個核細胞ROS表達 ×200A:新診斷組;B:經(jīng)治組;C:對照組;D:三組骨髓單個核細胞平均熒光強度;與對照組比較:*P<0.05;與新診斷組比較:#P<0.05
2.2 ROS在骨髓單個核細胞線粒體中的表達相比較對照組,新診斷組ROS表達上調差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。相較于新診斷組,經(jīng)治組ROS表達表達明顯下調,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。
圖2 骨髓單個核細胞線粒體ROS的表達 ×200A:新診斷組;B:經(jīng)治組;C:對照組;D:三組骨髓單個核細胞線粒體平均熒光強度;與對照組比較:*P<0.05;與新診斷組比較:#P<0.05
2.3 各組間SIRT3、IDH2水平變化相較于對照組,新診斷組中IDH2的表達上調,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1);相較于新診斷組,經(jīng)治組中IDH2的表達下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);組間F=13.048,P<0.05。外周血標本稀釋5倍后,相較于對照組,新診斷組中SIRT3的表達下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1);相較于新診斷組,經(jīng)治組中SIRT3的表達上調,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);組間F=17.740,P<0.05。見圖3。
圖3 各組間人血漿IDH2、SIRT3表達與對照組比較:*P<0.05,**P<0.01,****P<0.000 1;與新診斷組比較:#P<0.05,##P<0.01
2.4 SIRT3表達水平與融合基因AML1-ETO的關系
2.4.1新診斷AML患者SIRT3表達水平與融合基因AML1-ETO的關系 20例新診斷AML患者中,2例未進行融合基因檢測,16例檢測陰性;2例患者融合基因陽性。融合基因檢測陽性組SIRT3表達為(626.73±11.89) ng/L,融合基因檢測陰性組SIRT3表達為(591.54±127.29) ng/L,比較融合基因陽性組和陰性組AML患者SIRT3表達水平,結果顯示,兩組間SIRT3表達水平差異無統(tǒng)計學意義(F=3.267,P>0.05)。
2.4.2經(jīng)治AML患者SIRT3表達水平與融合基因AML1-ETO的關系 40例經(jīng)治AML患者中,7例未進行融合基因檢測,25例檢測陰性;8例患者融合基因陽性。融合基因檢測陽性組SIRT3表達為(759.96±114.81) ng/L,融合基因檢測陰性組 SIRT3表達為(751.66±241.87) ng/L,比較融合基因陽性組和陰性組AML患者SIRT3表達水平,結果顯示,兩組間SIRT3表達水平差異無統(tǒng)計學意義(F=0.951,P>0.05)。
2.5 經(jīng)治患者SIRT3表達水平與治療療效之間的關系40例經(jīng)治AML患者中,其中完全緩解(CR)者20例,部分緩解(PR)者20例。完全緩解者,其SIRT3表達為(722.95±172.33) ng/L;部分緩解者,其SIRT3表達為(794.57±259.61) ng/L,完全緩解者與部分緩解者間SIRT3表達水平差異無統(tǒng)計學意義(F=0.156,P>0.05)。
2.6 經(jīng)治CR患者SIRT3表達水平與治療療程之間的關系40例經(jīng)治AML患者中,其中完全緩解者20例,根據(jù)不同患者治療療程,以中位數(shù)6個療程為界,其中少于等于6個治療療程11例,其SIRT3表達為(712.79±183.43) ng/L;高于6個治療療程9例,其SIRT3表達為(735.36±167.82) ng/L,兩組間SIRT3表達水平差異無統(tǒng)計學意義(F=0.190,P>0.05)。
SIRT3主要分布于線粒體,不僅具有去乙酰酶活性,并且能夠靶向多條代謝途徑,調節(jié)細胞的正常代謝和功能[6]。文獻報道,SIRT3的丟失,與高氧化應激和ROS的產生以及代謝重編程有關,且后者有助于癌癥的發(fā)生[7]。有研究[8]表明,外周血血清與腫瘤細胞中SIRT3的表達有一定的相關性,且其可能成為腫瘤無創(chuàng)性檢測的潛在生物標志物。本研究中,白血病患者外周血SIRT3含量均低于對照組,表明在急性髓系白血病的發(fā)生發(fā)展中,SIRT3可能參與調節(jié)細胞的氧化損傷,調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。而已確診為AML的患者中,其中新診斷組低于經(jīng)治組,在經(jīng)治組中,PR亞組SIRT3水平高于CR亞組,而在經(jīng)治組中經(jīng)治療獲得CR的患者中,治療療程較短的亞組,其SIRT3水平低于治療療程長的亞組,與文獻報道一致,提示SIRT3高表達可能參與原發(fā)耐藥。在后續(xù)實驗中可進一步擴大實驗樣本量以明確。IDH2是三羧酸循環(huán)中一種關鍵酶,SIRT3可通過去乙?;疘DH2,以提高細胞抗氧化能力。研究[9]證明,將穩(wěn)定表達SIRT3的細胞中的IDH2基因敲除,會導致氧化應激保護完全或幾乎完全喪失。本研究結果提示,急性髓系白血病患者IDH2表達均大于對照組,新診斷組表達大于經(jīng)治組,借此推斷白血病細胞氧化還原的動態(tài)平衡被打破,而不排除系SIRT3參與的協(xié)調作用。融合基因在疾病的診斷、預后及治療療效評估中起著重要的作用。本研究中,在新診斷及經(jīng)治患者中,SIRT3的表達與融合基因AML1-ETO陽性與否無明顯關聯(lián)。但是本研究中新診斷患者只有2例AML1-ETO基因陽性,病例數(shù)較少,無法得出統(tǒng)計學意義,不能明確說明SIRT3的表達并不受其影響,需后期增大樣本量進一步探究。
氧化應激通常被定義為ROS生成和抗氧化防御系統(tǒng)受損之間的失衡。且已有研究[10]證明它與癌癥的病理生理學有關。本研究結果提示,60例已確診為急性髓系白血病患者細胞內及線粒體內ROS水平均明顯高于對照組,與相關文獻[11]報道相似,表明白血病細胞氧化還原平衡被打破,產生大量ROS。有研究顯示,血紅素加氧酶-1(haem oxygenase-1,HO-1)可以調節(jié)細胞血紅素水平,增加抗氧化劑的生成。相較于健康對照組,AML患者的HO-1的表達下調,但針對AML的兩種常用化療藥物阿糖胞苷和柔紅霉素在誘導細胞凋亡過程中,可以增加HO-1的表達,與治療前對比有所恢復[12-13]。上述研究說明,化療后的白血病細胞抗氧化能力較前提高。本研究中,經(jīng)治組患者白血病細胞ROS表達低于新診斷組,表明治療后患者細胞具有較前增高的抗氧化能力。低表達ROS的腫瘤細胞通常會表現(xiàn)出更高的耐藥性,在本研究中,新診斷組ROS表達高于經(jīng)治組,表明在經(jīng)多次化學治療后,治療療效較前欠佳。骨髓單個核細胞中線粒體ROS表達也出現(xiàn)同骨髓單個核細胞一樣的表現(xiàn),表明結果穩(wěn)定可靠。ROS既能誘導腫瘤的發(fā)生,又具有抗腫瘤性及參與細胞耐藥,ROS在細胞內的水平可以通過SIRT3靶向多種底物以調節(jié)線粒體的代謝而調節(jié),那么可以通過調節(jié)SIRT3的水平而降低腫瘤細胞的耐藥性,使之可能成為潛在的治療靶點,改善疾病的預后及治療療效。
復發(fā)、耐藥是AML患者治療效果差的主要原因[14]。本研究顯示在不同疾病狀態(tài)的AML患者中,SIRT3、IDH2及ROS表達水平相應改變,解釋了AML患者耐藥的可能機制,但尚未明確SIRT3、IDH2及ROS之間的因果關系,后續(xù)可通過建立模型及進一步擴大樣本量驗證探明。
綜上所述,SIRT3在成人急性髓系白血病患者中表達下降,可通過調節(jié)氧化應激以增加細胞ROS的產生。SIRT3的異常表達可參與白血病細胞耐藥機制。研究SIRT3在急性髓系白血病細胞生長發(fā)育中的功能,可作為評估患者誘導治療及治療療效評估的指標。有助于研究出更多具有針對性、特異性的治療藥物,改善預后,降低復發(fā)率。