人參皂甙-Rb1 通過促進(jìn)神經(jīng)元線粒體自噬治療大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷的機(jī)制

鄒樹峰 姜碧霞 馮九庚 陳偉，2

1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 南昌 330008 2.同濟(jì)大學(xué)附屬上海東方醫(yī)院（上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院）

隨著社會經(jīng)濟(jì)水平的提高，建筑業(yè)和交通工具的高速發(fā)展，創(chuàng)傷性顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）患者數(shù)量持續(xù)升高。TBI急性期出現(xiàn)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷，是造成患者致殘的重要因素之一[1]。線粒體損傷是炎癥產(chǎn)生的重要原因之一，而人參皂甙中最主要的成分人參皂甙-Rb1（ginsenoside-Rb1，GS-Rb1）具有抑制損傷后炎癥的作用[2-3]。線粒體自噬是細(xì)胞特異性清除體內(nèi)受損線粒體，緩解凋亡通路激活的保護(hù)性反應(yīng)。前期研究顯示，GS-Rb1在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后具有抑制縫隙連接40（Connexin40，Cx40）蛋白，進(jìn)而拮抗氧化應(yīng)激的作用[4-5]；研究還發(fā)現(xiàn)，TBI后Cx40的代謝與自噬相關(guān)[6]。這些結(jié)果提示，GS-Rb1的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)很可能與線粒體自噬相關(guān)。本研究通過對線粒體自噬功能的調(diào)控，研究TBI后GS-Rb1神經(jīng)元保護(hù)的具體途徑，旨在探討GS-Rb1對TBI治療作用的具體機(jī)制，并為相關(guān)臨床治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量350～400 g，由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（贛）2020-0001]。實(shí)驗(yàn)期間以固體平衡飼料飼養(yǎng)，自由飲水，溫度（22±2）℃，濕度（50±5）%。本研究經(jīng)南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)研倫2019年第41號）。

1.2 試劑及儀器 GS-Rb1購于上海邦景實(shí)業(yè)公司（批號：41753-43-9）；細(xì)胞自噬阻斷劑6-氨基-3-甲基嘌呤（3-methyladenine，3-MA）購于南京沃博生物科技有限公司（批號：5142-23-4）；小鼠多克隆抗體神經(jīng)元自噬相關(guān)輕鏈蛋白3-Ⅱ/輕鏈蛋白3-Ⅰ（light chain 3-Ⅱ/light chain 3-Ⅰ，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）、自噬接頭蛋白（sequestosome-1，P62）、線粒體功能相關(guān)蛋白過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子-1 alpha（peroxisome proliferators-activated receptor γ coactivator-1 alpha，PGC-1α）、線粒體外膜轉(zhuǎn)位蛋白20（translocase of outer mitochondrial membrane 20，TOM20）及凋亡相關(guān)蛋白B細(xì)胞淋巴瘤-2基因相關(guān)X蛋白（B cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）、裂解的半胱天冬酶3（cleaved-cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved-caspase 3）均購于美國Abcam公司（批號：192890、207305、182733、32042、145641、214532）；辣根酶標(biāo)記二抗購于北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司（批號：KLB124154）；化學(xué)發(fā)光試劑盒購于北京中杉金橋生物科技有限公司（批號：3605071）；超氧物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒均購于北京索萊寶科技有限公司（批號：2190523、20211119、20180523）。PowerPacTMBasic型蛋白垂直電泳儀購于美國Bio-Rad公司；L8型UV762紫外光分光光度計(jì)為上海第三分析儀器廠產(chǎn)品。

1.3 動物模型制作 采用液壓打擊制作大鼠TBI模型。大鼠予異氟烷吸入持續(xù)麻醉，固定于立體實(shí)驗(yàn)臺，常規(guī)消毒鋪巾，于頭部正中分層切開皮膚和骨膜，暴露右側(cè)頂骨，于矢狀縫旁3 mm，冠狀縫后3.5 mm處，以開顱磨鉆鉆骨孔，暴露硬腦膜，于骨孔處放置與骨孔大小相同的小帽，固定液壓管后，施行3個大氣壓（重型顱腦損傷標(biāo)準(zhǔn)）的液壓擊打。

1.4 分組及藥物干預(yù) 80只SD大鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)組、TBI組、治療（TBI+GS-Rb1）組、自噬阻斷（TBI+GS-Rb1+3-MA）組。假手術(shù)組僅暴露硬腦膜而不進(jìn)行擊打，TBI組僅建模不予藥物處理，治療組和自噬阻斷組采用液壓擊打建立TBI模型[7-8]，按照前期實(shí)驗(yàn)方法，1 h后分別腹腔注射GS-Rb1（40 mg/kg）及GS-Rb1（40 mg/kg）+3-MA（30 mg/kg）[5-6]，GS-Rb1以0.9%氯化鈉溶液溶解。建模后48 h進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)檢測，每組取10只大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測，其余10只行其他檢測。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及前期實(shí)驗(yàn)顯示，為獲得P值在0.05水平，1-β在0.20水平，根據(jù)Effect-Size計(jì)算出所需的每組動物數(shù)量為8（G-Power3.0），本研究為防止大鼠意外死亡引起樣本量的不足，故各組樣本量確定為10只。

1.5 大鼠神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評分（neurological severity score，NSS）采用雙盲法，具體方法如下：a.提鼠尾離地面約30 cm，觀察前肢情況，正常大鼠兩前肢對稱地伸向地面，有左肩內(nèi)旋，左前肢內(nèi)收者，評為4分，否則評為0分。b.將動物置于平滑地板上，分別推左（或右）肩向?qū)?cè)移動，檢查抵抗運(yùn)動的阻力。正常大鼠兩側(cè)阻力明顯對稱，右肩向左側(cè)移動阻力下降時(shí)，根據(jù)下降程度的不同，評為0～3分。0分：雙側(cè)抵抗等同，正常；1分：左側(cè)抵抗輕度下降；2分：左側(cè)抵抗中度下降；3分：左側(cè)抵抗力消失。c.將動物兩前肢置于金屬網(wǎng)上，觀察兩前肢的張力，正常大鼠兩前肢張力明顯對稱，發(fā)現(xiàn)左前肢肌張力下降者，根據(jù)下降程度的輕重，評為0～3分。0分：正常；1分：肌力下降，但能抬離平面；2分：癱瘓，無法抬離平面，只能水平運(yùn)動；3分：無任何活動。根據(jù)以上評分，滿分10分，分?jǐn)?shù)越高，說明動物的行為障礙越嚴(yán)重[7-8]。

1.6 蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色觀察神經(jīng)元病理學(xué)改變 取損傷處海驅(qū)皮質(zhì)組織標(biāo)本，經(jīng)包埋、切片、脫蠟、水化，使用蘇木精染色5 min后以自來水沖洗，鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min后以伊紅染色2 min，梯度乙醇脫水，中性樹脂封片，光鏡下觀察并拍照。

1.7 免疫印跡法檢測神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)/功能相關(guān)蛋白表達(dá) 取損傷側(cè)海馬區(qū)皮質(zhì)組織，裂解后提取總蛋白并定量，根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量不同，選擇不同濃度的十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，常規(guī)方法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，封閉2 h后分別加入相應(yīng)一抗anti-LC3-B（稀釋比例：1∶1 000）、anti-P62（稀釋比例：1∶1 500）、anti-PGC-1α（稀釋比例：1∶1 000）、TOM20（稀釋比例：1∶1 000）、anti-cleaved caspase 3（稀釋比例：1∶1 000）、anti-Bax（稀釋比例：1∶1 000），以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，一抗anti-GAPDH（稀釋比例：1∶2 500）。4 ℃孵育過夜，洗滌后加入相應(yīng)辣根過氧化物標(biāo)記的二抗孵育，化學(xué)顯影，掃描蛋白條帶，采用Image J 1.36b軟件進(jìn)行分析。蛋白相對表達(dá)量以目標(biāo)蛋白吸光度值/GAPDH吸光度值表示，以假手術(shù)組目標(biāo)蛋白/GAPDH為100%，其余組與之進(jìn)行比較。

1.8 氧化應(yīng)激相關(guān)因子檢測 取大鼠損傷側(cè)海馬區(qū)皮質(zhì)組織，洗滌后充分勻漿，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液，分別采用黃嘌呤氧化酶法、硫酸代巴比妥法、二硫代硝基苯甲酸縮合法，分別檢測SOD活性、MDA及GSH水平，以假手術(shù)組為100%，其余組與之比較。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 22.0和Graph Prism統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的連續(xù)型變量以表示，多組間比較采用方差分析，其中任意兩組間比較采用最小顯著差異（least significant difference，LSD）-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠NSS評分比較 與假手術(shù)組比較，TBI組NSS升高；與TBI組比較，治療組的NSS明顯降低（P＜0.05）。當(dāng)采用自噬抑制劑3-MA后，可明顯阻斷GS-Rb1的神經(jīng)功能保護(hù)作用（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠NSS比較Fig.1 Comparison of NSS in each group

2.2 各組大鼠神經(jīng)元形態(tài)學(xué)比較 假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元形態(tài)正常，輪廓清晰，圓潤飽滿，細(xì)胞核位于中央。TBI組損傷處神經(jīng)元萎縮，輪廓不清，組織紋理紊亂。治療組的神經(jīng)元受損程度明顯緩解。采用自噬抑制劑3-MA后，可明顯阻斷GS-Rb1對神經(jīng)元形態(tài)保護(hù)作用。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)元病理病理形態(tài)學(xué)觀察（HE染色，200×）Fig.2 Pathological changes of hippocampal neuron in each group（HE staining，200×）

2.3 各組大鼠神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，TBI組自噬明顯受到抑制（P＜0.05）。與TBI組比較，其余兩組干預(yù)后自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例明顯升高，P62表達(dá)明顯降低（P＜0.05），證明GS-Rb1能夠增強(qiáng)自噬。自噬抑制劑3-MA則可明顯抑制自噬蛋白的表達(dá)及自噬反應(yīng)（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較Fig.3 Comparison of autophagy related protein expression in each group

2.4 各組大鼠神經(jīng)元線粒體形態(tài)/功能相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，TBI組神經(jīng)元線粒體相關(guān)蛋白PGC-1α及TOM20明顯下調(diào)（P＜0.05），而GS-Rb1可明顯上調(diào)損傷后神經(jīng)元PGC-1α及TOM20的表達(dá)（P＜0.05），自噬抑制劑3-MA可明顯抑制同時(shí)此種效應(yīng)（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠PGC-1α和TOM20蛋白表達(dá)比較Fig.4 Comparison of PGC-1α and TOM20 protein expression in each group

2.5 各組大鼠神經(jīng)元凋亡比較 與假手術(shù)組比較，TBI組凋亡相關(guān)蛋白Bax及cleaved-caspase 3表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。與TBI組比較，GS-Rb1可明顯降低促凋亡蛋白Bax及cleaved-caspase 3表達(dá)（P＜0.05）。當(dāng)給予自噬抑制劑3-MA后，則可明顯抑制此種效應(yīng)（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較Fig.5 Comparison of apoptosis related protein expression in each group

2.6 各組大鼠神經(jīng)元氧化應(yīng)激反應(yīng)比較 與假手術(shù)組比較，TBI組SOD活性及GSH水平降低，而MDA水平明顯升高（P＜0.05）。與TBI組比較，治療組MDA水平降低，GSH水平升高，SOD活性升高（P＜0.05）。自噬抑制劑3-MA可明顯阻斷GS-Rb1抑制氧化應(yīng)激的效應(yīng)（P＜0.05）。見圖6。

圖6 各組大鼠SOD、GSH及MDA表達(dá)比較Fig.6 Comparison of SOD，GSH and MDA expression in each group

3 討論

TBI的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前認(rèn)為氧化應(yīng)激因子的激活可能與腦損傷密切相關(guān)[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，TBI后Cx40蛋白的異常表達(dá)和氧化應(yīng)激因子的表達(dá)密切相關(guān)[4]，而氧化應(yīng)激的產(chǎn)生則與線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)功能紊亂相關(guān)。因此筆者推測，線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)功能保護(hù)可能在TBI的治療中具有重要的作用。

人參皂甙（ginsenoside，GS）是人參最主要的活性成分。研究證明，GS具有抗炎、抗氧化及降低脂質(zhì)代謝產(chǎn)物的作用[10]。Rb1作為GS中含量最多的成分，受到越來越多的重視。前期研究發(fā)現(xiàn)，GS-Rb1在腦缺血再灌注損傷后可抑制氧化應(yīng)激因子尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 1，NOX1）、NOX2、NOX4及炎癥因子白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的表達(dá)，并上調(diào)細(xì)胞骨架蛋白緊密連接蛋白-1（zonula occluden-1，ZO-1）、閉合蛋白（occludin）的表達(dá)，具有神經(jīng)功能保護(hù)作用[11]。研究顯示，GS-Rb1可能通過降低Cx40的表達(dá)，抑制TBI后的氧化應(yīng)激[4-5，12]，但尚未對其中具體機(jī)制進(jìn)行深入分析，仍需要進(jìn)一步明確GS-Rb1參與抑制氧化應(yīng)激的具體途徑。

自噬作為真核生物細(xì)胞的重要代謝途徑，能夠降解一些錯構(gòu)的蛋白質(zhì)以及受損的細(xì)胞器，對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)起著重要的作用。線粒體自噬是目前研究較多的一種自噬形式，是選擇性清除受損線粒體的過程。線粒體被稱為細(xì)胞的“Power house”，參與了細(xì)胞的各種生物過程，包括三磷酸腺苷產(chǎn)生、鈣穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞凋亡及活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生，因此線粒體損傷影響巨大，受損的線粒體可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)氧化應(yīng)激損傷[13]。研究顯示，自噬早于凋亡的出現(xiàn)，并可通過清除受損的線粒體而抑制凋亡[14]。近年來筆者團(tuán)隊(duì)的研究也證實(shí)，自噬可清除氧化應(yīng)激的促進(jìn)因子Cx40[6]。以上均提示，線粒體自噬可能通過抑制氧化應(yīng)激下游的炎性產(chǎn)物增多，從而起到細(xì)胞保護(hù)作用。本研究中，GS-Rb1可明顯上調(diào)神經(jīng)元LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例、下調(diào)P62的表達(dá)，說明整個自噬過程通暢，也證明GS-Rb1與自噬的誘導(dǎo)相關(guān)。進(jìn)一步觀察到，線粒體功能/結(jié)構(gòu)蛋白PGC-1α、TOM20表達(dá)均明顯上調(diào)，這提示線粒體的功能及數(shù)量得到明顯保護(hù)。繼續(xù)觀察下游凋亡途徑時(shí)發(fā)現(xiàn)，凋亡促進(jìn)因子Bax及cleaved-caspase 3表達(dá)也較TBI組明顯降低，使用自噬抑制劑時(shí)可明顯阻斷GS-Rb1的效應(yīng)。這均說明，GS-Rb1的神經(jīng)元保護(hù)效應(yīng)與線粒體自噬的激活直接相關(guān)。

氧化應(yīng)激可能與線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能損傷后ROS增多密切相關(guān)。本研究證實(shí)，GS-Rb1在增強(qiáng)自噬的基礎(chǔ)上，也可以明顯降低氧化應(yīng)激因子MDA水平，并可升高抗氧化應(yīng)激因子GSH的水平及SOD的活性。而使用自噬抑制劑后，可逆轉(zhuǎn)GS-Rb1抗氧化應(yīng)激損傷的作用。形態(tài)學(xué)觀察也證實(shí)，自噬抑制劑可明顯降低GS-Rb1對神經(jīng)功能及神經(jīng)元形態(tài)的保護(hù)作用。以上的研究結(jié)果均證實(shí)，GS-Rb1對受損神經(jīng)元功能及形態(tài)的保護(hù)作用與誘導(dǎo)線粒體自噬、緩解氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

綜上所述，本研究說明TBI后GS-Rb1對神經(jīng)元的保護(hù)效應(yīng)可能與線粒體自噬的激活、線粒體功能的保護(hù)，以及對凋亡及氧化應(yīng)激的抑制有關(guān)。在此基礎(chǔ)上，將進(jìn)一步研究GS-Rb1對自噬相關(guān)基因及信號傳導(dǎo)通路的影響，為了解GS-Rb1的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制及TBI的治療奠定基礎(chǔ)。