柴胡陷胸湯含藥血清對(duì)高脂血清致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制Δ

王建湘，廖 楊，易 瓊，陳新宇（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，長(zhǎng)沙 40007；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，長(zhǎng)沙 4008；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，長(zhǎng)沙 40007）

冠心病心絞痛是一種臨床常見疾病，由動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）和冠狀動(dòng)脈功能改變（痙攣）引起，其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人民生命健康[1-2]。柴胡陷胸湯由小柴胡湯和小陷胸湯二方加減而成，組方藥材包括柴胡、法半夏、黃芩、黃連、瓜蔞、木香、九香蟲、丹參、甘草。該方可減輕冠心病心絞痛患者疼痛發(fā)作次數(shù)、程度，并縮短疼痛持續(xù)時(shí)間[3]，但其作用機(jī)制尚不明確。

血管內(nèi)皮功能障礙與冠心病心絞痛的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，炎癥和血脂異常則是導(dǎo)致該疾病進(jìn)展的重要因素[4-5]。據(jù)報(bào)道，冠心病心絞痛患者存在明顯的血脂高、血管損傷和炎癥因子表達(dá)異常等癥狀[6-7]，且Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）通路被激活[8]；而抑制TLR4/NF-κB 炎癥通路的過(guò)度活化可減輕血管炎癥和AS，并改善血脂水平[9]。有研究指出，柴胡陷胸湯中的多種中藥及其主要成分均具有降血脂、抗炎、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，并可抑制TLR4/NF-κB 炎癥通路的活化[10-12]，但該方對(duì)冠心病心絞痛的保護(hù)作用是否與改善血管內(nèi)皮功能障礙、抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)尚未見報(bào)道。

中藥血清藥理研究方法是近年來(lái)倍受學(xué)界關(guān)注的中藥體外藥理實(shí)驗(yàn)研究方法，以含藥血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)可排除中藥復(fù)方及粗提物成分、電解性能、滲透壓、酸堿度等因素的影響，并與藥物在體內(nèi)發(fā)揮藥理學(xué)效應(yīng)的真實(shí)過(guò)程較為接近，故可準(zhǔn)確、真實(shí)地反映中藥的整體作用及潛在機(jī)制?；诖?，本研究擬采用高脂血清誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，探究柴胡陷胸湯含藥血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響，旨在為闡明其治療冠心病心絞痛的作用機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Modular P800 型全自動(dòng)生化分析儀（瑞士Roche公司），HERAcell 240i型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），iMark680型多功能酶標(biāo)儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置（電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽）、Quantity One-v 4.6.2型凝膠圖像分析軟件（美國(guó)Bio-Rad公司），ABI Prism?7300 型熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國(guó)ABI公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

柴胡、法半夏、黃芩、黃連、瓜蔞、木香、九香蟲、丹參、甘草藥材均購(gòu)自北京同仁堂制藥有限公司，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥品質(zhì)量控制小組鑒定均為真品。

MTT試劑盒（批號(hào)C0009S）購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；人腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、內(nèi)皮素1（endothelin-1，ET-1）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（批號(hào)分別為ml077385、ml028583、ml025095、ml063651、ml025101）均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Trizol 試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；兔源TLR4、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批號(hào)分別為ab13556、ab16502、ab76302、ab8227、ab205718）均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；兔源NF-κB 抑制因子α（nuclear factor κB inhibitor α，IκBα）、磷酸化IκBα（p-IκBα）抗體（批號(hào)分別為A19714、AP0614）均購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；細(xì)胞間黏附分子1（intercelluar adhesion molecule-1，ICAM-1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物均由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)、合成（引物序列與產(chǎn)物大小見表1）。其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

表1 ICAM-1等引物序列和產(chǎn)物大小

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

12 只SPF 級(jí)雄性新西蘭兔，6 月齡，體質(zhì)量3.0～3.2 kg，購(gòu)自山東艾萊克生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（魯）2019-0006；24 只雄性SD 大鼠，7～8 周齡，體質(zhì)量（210±10）g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅動(dòng)物繁育有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（魯）2019-0003。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)在（21±1）℃、每12 h 晝夜交替的動(dòng)物房?jī)?nèi)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)IACUC-G14002）。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304（貨號(hào)CC-Y1151）購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司。

2 方法

2.1 柴胡陷胸湯的制備

分別稱取組方藥材柴胡10 g、法半夏10 g、黃芩10 g、黃連4 g、瓜蔞10 g、木香6 g、九香蟲6 g、丹參15 g、甘草6 g，加8倍量的水充分浸泡30 min，煎煮1 h×2次，過(guò)濾，合并2 次提取液，煎煮濃縮得柴胡陷胸湯藥液（每1 mL相當(dāng)于生藥2.0 g）。

2.2 正常血清和高脂血清的制備

將12只新西蘭兔隨機(jī)分為正常組和高脂血癥組，每組6 只。參考相關(guān)文獻(xiàn)方法[13]，正常組兔給予普通飼料喂養(yǎng)，高脂血癥組兔給予1%高脂飼料（含膽固醇1 g、豬油5 g、蛋黃粉15 g，其余為普通飼料）喂養(yǎng)，每天約100 g，連續(xù)喂養(yǎng)12周。第13周，各組兔經(jīng)麻醉后，于腹主動(dòng)脈采血40 mL，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)其血清中三酰甘油（triacylglycerol，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）和高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）水平，若TC水平高于正常組3 倍則表示高脂血癥模型復(fù)制成功[14]。檢測(cè)結(jié)果顯示，正常組兔血清中TG、TC、LDL、HDL 水平 分 別 為（1.25±0.13）、（1.67±0.21）、（1.85±0.13）（1.34±0.15）mmol/L，高脂血癥組兔上述指標(biāo)分別為（2.48±0.19）、（7.14±0.28）、（5.93±0.16）、（0.65±0.11）mmol/L?？梢?，高脂血癥組兔血清TC 水平約為正常組的4.3 倍，表明高脂血癥模型復(fù)制成功。收集兔血清于-80 ℃冰箱中保存，備用。

2.3 柴胡陷胸湯含藥血清的制備

將24 只大鼠隨機(jī)分為空白組和柴胡陷胸湯低、中、高劑量組，每組6只。按照人（體質(zhì)量70 kg）與大鼠體表面積換算公式，以人等效劑量的6.3 倍換算得柴胡陷胸湯中劑量為6.94 g/kg（以生藥量計(jì)，下同），同時(shí)設(shè)置該方低、高劑量分別為3.47、13.88 g/kg。各組大鼠每天早、晚灌胃相應(yīng)劑量的藥液1次，空白組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)給藥7 d。末次給藥1 h后，大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，于腹主動(dòng)脈取血，分離血清，于56 ℃水浴滅活30 min，再于-80 ℃冰箱中保存，備用。

2.4 細(xì)胞分組與處理

將ECV304細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基中，分為對(duì)照組、模型組和柴胡陷胸湯低、中、高濃度組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)照組細(xì)胞用含20%正常兔血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余各組細(xì)胞用含20%高脂兔血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)；24 h 后，對(duì)照組和模型組細(xì)胞用含20%正常大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，柴胡陷胸湯低、中、高濃度組細(xì)胞用含20%含藥大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.5 細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)

采用MTT 法進(jìn)行檢測(cè)。將ECV304 細(xì)胞以5 000個(gè)/孔接種在96 孔板中，按照“2.3”項(xiàng)下方法分組、處理、培養(yǎng)。24 h 后，每孔加入5 mg/mL 的MTT 溶液10 μL，繼續(xù)孵育4 h；然后，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，使用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（optical density，OD）值。以培養(yǎng)基為空白孔，按下式計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率＝（實(shí)驗(yàn)組OD 值-空白孔OD值）/（對(duì)照組OD值-空白孔OD值）×100%。

2.6 細(xì)胞中炎癥因子和血管內(nèi)皮功能指標(biāo)的檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法進(jìn)行檢測(cè)。收集“2.5”項(xiàng)下各組細(xì)胞的上清液，按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書操作，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中炎癥因子（TNF-α、IL-6）和血管內(nèi)皮功能指標(biāo)（eNOS、NO、ET-1）水平。

2.7 細(xì)胞中ICAM-1、TGF-β1 mRNA表達(dá)的檢測(cè)

采用熒光定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)。收集“2.5”項(xiàng)下各組細(xì)胞，采用Trizol 試劑提取其總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系（20 μL）包含：SYBR Green Mix（10 μL）、無(wú)菌雙蒸水（7.4 μL）、上游引物（0.8 μL）、下游引物（0.8 μL）和cDNA 模板（1.0 μL）。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)mRNA 表達(dá)水平，以各組細(xì)胞中ICAM-1、TGF-β1mRNA 的表達(dá)水平與對(duì)照組的比值作為評(píng)價(jià)結(jié)果。

2.8 細(xì)胞中TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。收集“2.5”項(xiàng)下各組細(xì)胞，采用RIPA 裂解液提取其總蛋白，測(cè)定濃度后，加熱變性。取變性蛋白，經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入兔源TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα、β-actin一抗（除β-actin 的稀釋比例為1∶2 000 外，其余均為1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜；洗滌3 次后，加入二抗（稀釋比例為1∶5 000），室溫孵育1 h；洗滌后，使用化學(xué)發(fā)光試劑顯影，并采用Image J V1.8.0軟件分析各條帶的灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，并計(jì)算p-NF-κB p65/NF-κB p65比值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 各組細(xì)胞增殖能力

對(duì)照組、模型組和柴胡陷胸湯低、中、高濃度組細(xì)胞增殖率分別為100.00%、（234.25±13.63）%、（168.84±11.44）%、（153.83±10.57）%、（117.02±12.61）%（n＝3）。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞增殖率顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，柴胡陷胸湯低、中、高濃度組細(xì)胞增殖率均顯著降低（P＜0.05），且柴胡陷胸湯高濃度組細(xì)胞增殖率顯著低于柴胡陷胸湯低、中濃度組（P＜0.05）。

3.2 各組細(xì)胞上清液中炎癥因子水平

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，柴胡陷胸湯低、中、高濃度組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平均顯著降低（P＜0.05）；此外，柴胡陷胸湯高濃度組上述指標(biāo)均顯著低于柴胡陷胸湯低、中濃度組，且中劑量組IL-6顯著低于低劑量組（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6 水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3，pg/mL）

表2 各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6 水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3，pg/mL）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與柴胡陷胸湯低濃度組比較，P＜0.05；d：與柴胡陷胸湯中濃度組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組柴胡陷胸湯低濃度組柴胡陷胸湯中濃度組柴胡陷胸湯高濃度組TNF-α 0.52±0.08 1.97±0.16a 1.55±0.14b 1.27±0.15b 0.84±0.12bcd IL-6 0.66±0.11 2.42±0.17a 1.87±0.15b 1.35±0.12bc 0.98±0.10bcd

3.3 各組細(xì)胞上清液中血管內(nèi)皮功能指標(biāo)水平

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞上清液中ET-1水平顯著升高，eNOS、NO 水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，柴胡陷胸湯低、中、高濃度組細(xì)胞上清液中ET-1水平均顯著降低，eNOS、NO 水平均顯著升高（P＜0.05），且柴胡陷胸湯高濃度組上述指標(biāo)均顯著優(yōu)于柴胡陷胸湯低、中濃度組（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組細(xì)胞上清液中eNOS、NO、ET-1 水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

表3 各組細(xì)胞上清液中eNOS、NO、ET-1 水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與柴胡陷胸湯低濃度組比較，P＜0.05；d：與柴胡陷胸湯中濃度組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組柴胡陷胸湯低劑量組柴胡陷胸湯中劑量組柴胡陷胸湯高劑量組eNOS/（ng/mL）4.79±0.45 2.03±0.26a 2.96±0.27b 3.25±0.31b 4.17±0.34bcd NO/（μmol/L）57.29±3.84 21.78±2.31a 33.23±3.62b 38.15±5.64b 49.88±4.58bcd ET-1/（ng/L）8.74±1.15 25.56±2.26a 20.02±2.05b 18.47±1.78b 12.74±1.69bcd

3.4 各組細(xì)胞中ICAM-1、TGF-β1 mRNA表達(dá)

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中ICAM-1 mRNA 的表達(dá)水平顯著升高，TGF-β1mRNA 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，柴胡陷胸湯低、中、高濃度組細(xì)胞中ICAM-1 mRNA的表達(dá)水平均顯著降低，TGF-β1mRNA的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；此外，柴胡陷胸湯高濃度組上述指標(biāo)均顯著優(yōu)于柴胡陷胸湯低、中濃度組，且中劑量組TGF-β1顯著高于低劑量組（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表4 各組細(xì)胞中ICAM-1、TGF-β1 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

表4 各組細(xì)胞中ICAM-1、TGF-β1 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與柴胡陷胸湯低濃度組比較，P＜0.05；d：與柴胡陷胸湯中濃度組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組柴胡陷胸湯低濃度組柴胡陷胸湯中濃度組柴胡陷胸湯高濃度組ICAM-1 1.00 3.85±0.57a 2.62±0.31b 2.33±0.35b 1.37±0.21bcd TGF-β1 1.00 0.32±0.05a 0.50±0.06b 0.68±0.08bc 0.89±0.09bcd

3.5 各組細(xì)胞中TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中IκBα 蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，TLR4、p-IκBα 蛋白的相對(duì)表達(dá)量和p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，柴胡陷胸湯低、中、高濃度組細(xì)胞中IκBα蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，TLR4、p-IκBα蛋白的相對(duì)表達(dá)量和p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值均顯著降低（P＜0.05），且柴胡陷胸湯高濃度組上述指標(biāo)均顯著優(yōu)于柴胡陷胸湯低、中濃度組（P＜0.05）。結(jié)果見圖1、表5。

圖1 各組細(xì)胞中TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

表5 各組細(xì)胞中TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

表5 各組細(xì)胞中TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與柴胡陷胸湯低濃度組比較，P＜0.05；d：與柴胡陷胸湯中濃度組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組模型組柴胡陷胸湯低濃度組柴胡陷胸湯中濃度組柴胡陷胸湯高濃度組TLR4 0.43±0.07 1.28±0.08a 0.92±0.09b 0.76±0.08b 0.54±0.06bcd p-NF-κB p65/NF-κB p65 0.66±0.06 1.32±0.09a 1.07±0.08b 0.93±0.05b 0.73±0.07bcd IκBα 0.85±0.07 0.40±0.06a 0.58±0.06b 0.62±0.05b 0.79±0.07bcd p-IκBα 0.10±0.01 0.83±0.09a 0.47±0.06b 0.35±0.05b 0.20±0.03bcd

4 討論

冠心病心絞痛屬于中醫(yī)“胸痹”“心悸”范疇，基本病機(jī)為氣滯、血瘀、痰濁。雖病位在心，但與肝密切相關(guān)。肝主疏泄，肝氣郁結(jié)可導(dǎo)致氣滯，繼而引發(fā)血瘀和痰濁，阻滯心脈，最終誘發(fā)胸痹心痛。因此，冠心病心絞痛的治療應(yīng)以疏肝理氣化痰為主[3]。柴胡陷胸湯中柴胡疏肝解郁、調(diào)達(dá)肝氣，法半夏辛開散結(jié)、化痰消痞，共為君藥；丹參活血祛瘀、除煩安神，為臣藥；黃芩、黃連清瀉肝郁之火，瓜蔞清熱化痰、寬胸散結(jié)，木香、九香蟲均為行氣止痛之要藥，并能疏解肝氣之郁滯，共為佐藥；甘草補(bǔ)益心氣，調(diào)和諸藥，作為使藥入方。諸藥合用，共奏疏肝理氣化痰、寬胸活血止痛之功。藥理研究顯示，柴胡皂苷可降低高脂血癥大鼠血液中TG、TC、LDL 水平[10]；在高脂血癥大鼠中，半夏與黃連配伍具有降血脂、下調(diào)NF-κB 表達(dá)的作用[11]；黃連素可抑制NF-κB 通路，降低血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平，增加NO 水平，保護(hù)冠心病模型大鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞[12]。以上研究表明，柴胡陷胸湯對(duì)冠心病心絞痛的改善作用可能與降血脂、抗炎、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞有關(guān)。

據(jù)報(bào)道，冠心病患者的血清可促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，這可能是由于血清中含有與促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的蛋白組分，可促進(jìn)血管側(cè)支循環(huán)的建立，并恢復(fù)組織血流[15]。本研究結(jié)果顯示，柴胡陷胸湯含藥血清可抑制高脂血清誘導(dǎo)的ECV304 細(xì)胞的增殖，與上述研究的結(jié)果并不一致。筆者推測(cè)造成這種現(xiàn)象的原因是柴胡陷胸湯為中藥復(fù)方，所含成分多樣，其中部分成分可能具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，至于具體原因和柴胡陷胸湯對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用是否與其防治冠心病心絞痛的機(jī)制有關(guān)尚有待進(jìn)一步研究。

內(nèi)皮功能障礙是AS形成和冠心病心絞痛發(fā)病的第一步[16]。在冠狀動(dòng)脈血栓形成時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)分泌大量ET-1，后者可加重心肌缺血損傷[17]。NO 主要是由內(nèi)皮源性eNOS催化合成的血管舒張活性因子。當(dāng)血管受到損傷時(shí)，eNOS 表達(dá)減少，從而導(dǎo)致NO 合成減少[18]。ICAM-1的過(guò)量表達(dá)會(huì)使白細(xì)胞與內(nèi)皮黏附，促進(jìn)AS的進(jìn)展[19]。TGF-β 是血管修復(fù)過(guò)程中的主要協(xié)調(diào)者，對(duì)穩(wěn)定頸動(dòng)脈易損斑塊和延緩AS起到積極作用[20]。在本研究中，筆者使用高脂血清誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，結(jié)果顯示，內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS、NO、TGF-β1分泌減少，ET-1 和ICAM-1分泌增加，說(shuō)明內(nèi)皮細(xì)胞功能出現(xiàn)異常；給予柴胡陷胸湯干預(yù)后，上述指標(biāo)的改變被顯著逆轉(zhuǎn)，提示柴胡陷胸湯可改善內(nèi)皮細(xì)胞功能異常。

在冠心病的形成、發(fā)展過(guò)程中始終都有各種炎癥細(xì)胞和炎癥因子的參與[7]。異常的內(nèi)皮功能可增加炎癥因子TNF-α、IL-6 的釋放。TLR4 可促使NF-κB/IκBα 復(fù)合物的解離，使IκBα磷酸化并降解，促進(jìn)NF-κB進(jìn)入胞核活化，調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。在本研究中，柴胡陷胸湯可降低高脂血清誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中TNF-α、IL-6水平和TLR4 表達(dá)，抑制IκBα 磷酸化降解和NF-κB p65活化，提示柴胡陷胸湯對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與降低炎癥因子水平和抑制TLR4/NF-κB通路有關(guān)。綜上所述，柴胡陷胸湯可改善高脂血清誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與降低炎癥因子水平、抑制TRL4/NF-κB通路活化有關(guān)。本研究為冠心病心絞痛的治療及柴胡陷胸湯的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但由于體內(nèi)外環(huán)境存在差異，該方能否在體內(nèi)發(fā)揮同樣的作用，還有待進(jìn)一步研究。