潛陽育陰顆粒UPLC指紋圖譜和多成分定量方法的建立Δ

韓 洋，曹 園（1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院藥學部，南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學藥學院，南京 210023）

高血壓疾病的防控工作對遏制心血管疾病的流行十分重要。中醫(yī)藥因其辨證論治及整體性的特點，在我國高血壓疾病的診療領域發(fā)揮了重要作用[1]。潛陽育陰顆粒是南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院的特色醫(yī)院制劑，對高血壓腎損害的療效確切[2-3]。該制劑由鬼針草、制首烏、酒萸肉、玄參、川牛膝、澤瀉6味中藥配伍而成，含有環(huán)烯醚萜苷、黃酮、二苯乙烯苷等多類成分[4]。

不同批次產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性是中藥復方制劑發(fā)揮臨床療效的重要前提[5]。由于中藥復方制劑成分復雜，單一指標成分的定量分析難以全面表征制劑的整體質(zhì)量[6]。中藥指紋圖譜能反映中藥多成分作用特點，在中藥復方制劑的質(zhì)量控制領域得到了廣泛應用[7-8]。化學模式識別可對中藥指紋圖譜的色譜信息進行深入挖掘，以篩選差異標志物，對中藥及其復方制劑的質(zhì)量控制與評價具有重要意義[9-10]。

本課題組前期已對潛陽育陰顆粒的化學成分進行了鑒定并預測了潛在質(zhì)量標志物[4]。鑒于該藥現(xiàn)行質(zhì)量標準僅以二苯乙烯苷為指標成分，難以有效控制其整體質(zhì)量，故本研究擬建立潛陽育陰顆粒的指紋圖譜，進行化學模式識別分析并篩選差異性成分；同時，考慮到哈巴苷和阿魏酸具有抗高血壓、抗炎、抗氧化、保護心臟等功效[11-12]，因此將這2 個化合物與川牛膝指標成分杯莧甾酮[13]一并納入定量檢測，以期為全面評價潛陽育陰顆粒的質(zhì)量和提高其質(zhì)量控制水平奠定基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

H-CLASS 型超高效液相色譜（UPLC）儀購自美國Waters 公司；AUW220D 型電子分析天平購自日本Shimadzu公司；WB200UCX型液晶超聲清洗器購自上海望標儀器有限公司。

1.2 藥材與試劑

潛陽育陰顆粒（批號分別為2101001、2101003、2012033、2103009、2103013、2104015、2104017、2104018、2105019、2105020、2106023、2107027、2107028、2108030、2109032，依次編號S1～S15）由南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院提供。各對照品的來源信息見表1；各單味藥材均購自安徽省萬生中藥飲片有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院藥學部曹園研究員鑒定均為真品。甲醇、乙腈和磷酸均為色譜純，水為超純水。

表1 潛陽育陰顆粒各對照品的來源信息

2 方法與結果

2.1 UPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）；流動相A 為乙腈，流動相B 為水（含0.1%磷酸），采用梯度洗脫方法（0～5.0 min，3%A→8%A；5.0～11.0 min，8%A→30%A；11.0～20.0 min，30%A→80%A；20.0～21.0 min，80%A→95%A；21.0～23.0 min，95%A；23.0～23.5 min，95%A→3%A；23.5～30.0 min，3%A）；檢測波長為250 nm；流速為0.3 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣量為1 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備 將潛陽育陰顆粒粉碎，取粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，搖勻后超聲（功率100 W，頻率40 kHz）提取20 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用相同溶劑補足減失的質(zhì)量，搖勻后靜置，取上清液過0.22 μm 濾膜，即得全方供試品溶液。按潛陽育陰顆粒處方比例分別稱取鬼針草22.5 g、制首烏5.0 g、玄參5.0 g、酒萸肉3.0 g、川牛膝7.5 g、澤瀉5.0 g，按上述方法制備單味藥供試品溶液。

2.1.3 對照品溶液的制備 精密稱取杯莧甾酮、莫諾苷、金絲桃苷、馬錢苷、哈巴俄苷、阿魏酸、大黃素、二苯乙烯苷、肉桂酸對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.267 0、0.105 0、0.092 0、0.361 0、0.221 0、0.249 0、0.040 0、0.228 0、0.339 0 mg/mL 的單一對照品溶液（哈巴苷在250 nm波長下無吸收，故未考慮）。取各對照品溶液適量于10 mL量瓶中混勻，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.001 9、0.010 5、0.000 7、0.007 2、0.001 5、0.000 7、0.001 0、0.041 4、0.002 4 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.4 精密度試驗 取潛陽育陰顆粒樣品（編號S1），按照“2.1.2”項下方法制備全方供試品溶液，再按照“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)測定6次，以馬錢苷峰（分離度好、峰形穩(wěn)定）為參照，計算得各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.50%（n＝6），相對峰面積的RSD 均小于4.60%（n＝6），表明該方法精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取潛陽育陰顆粒樣品（編號S1），按照“2.1.2”項下方法制備全方供試品溶液，然后在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以馬錢苷峰為參照，計算得各共有峰相對峰面積的RSD均小于4.70%（n＝6），相對保留時間的RSD均小于2.90%（n＝6），表明該溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 重復性試驗 取潛陽育陰顆粒樣品（編號S1）6份，按照“2.1.2”項下方法制備全方供試品溶液，再按照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以馬錢苷峰為參照，計算得各共有峰相對峰面積的RSD均小于1.90%（n＝6），相對保留時間的RSD均小于0.09%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.1.7 指紋圖譜建立與相似度評價 取15 批潛陽育陰顆粒樣品，按照“2.1.2”項下方法制備全方供試品溶液，再按照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）》，隨機選擇S15樣品圖譜為參照，設置時間窗寬度為0.2 min，以中位數(shù)法建立對照指紋圖譜（R）和疊加指紋圖譜（圖1）。由圖1可知，疊加指紋圖譜有共有峰18個。以對照指紋圖譜為參照，計算得S1～S15 樣品的相似度為0.966～0.997，提示各批樣品的相似度較高。

圖1 15批潛陽育陰顆粒樣品的UPLC對照指紋圖譜和疊加指紋圖譜

2.1.8 共有峰歸屬與指認 取“2.1.2”項下全方及單味藥供試品溶液、“2.1.3”項下混合對照品溶液適量，按照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定并記錄色譜圖。結合光電二極管檢測器掃描，最終判定峰1、15來源于澤瀉，峰2來源于酒萸肉，峰3～8、10主要來源于酒萸肉，峰9、11主要來源于鬼針草，峰12 來源于制首烏，峰13、14 來源于川牛膝，峰16、17來源于玄參，峰18來源于制首烏、澤瀉。結果見圖2。

圖2 潛陽育陰顆粒全方供試品溶液及單味藥供試品溶液的UPLC圖

經(jīng)與混合對照品溶液色譜圖比較，共指認出9 個化學成分：峰6 莫諾苷、峰7 馬錢苷、峰11 金絲桃苷、峰12二苯乙烯苷、峰13阿魏酸、峰14杯莧甾酮、峰16哈巴俄苷、峰17肉桂酸、峰18大黃素。結果見圖3。

圖3 潛陽育陰顆?；旌蠈φ掌啡芤旱腢PLC圖

2.2 化學模式識別分析

2.2.1 聚類分析 使用SPSS 22.0 軟件，以18 個共有峰峰面積為變量，采用組間連接法以平方歐氏距離為測度進行聚類分析（cluster analysis，CA）。結果（圖4）顯示，當距離為10 時，15 批潛陽育陰顆粒可聚為6 類：S1、S2、S4～S6 為一類，S3 為一類，S7、S8 為一類，S9、S10 為一類，S11～S14為一類，S15為一類。

圖4 15批潛陽育陰顆粒的CA樹狀圖

2.2.2 主成分分析 使用SIMCA 14.1 軟件，以18 個共有峰峰面積為變量進行主成分分析（principal components analysis，PCA）。由PCA 得分圖（圖5A）可知，S1、S2、S4～S6為一類，S3為一類，S7、S8為一類，S9、S10為一類，S11～S14為一類，S15為一類。由PCA載荷圖（圖5B）可知，峰2～7、9、10、12、14、17 距離原點較遠，表明其對應成分對潛陽育陰顆粒的質(zhì)量影響較大[14]。

2.2.3 偏最小二乘法-判別分析 為更好地分析不同批次潛陽育陰顆粒樣品間的差異，本研究利用SIMCA 14.1軟件，以18 個共有峰峰面積為變量進行偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA），并篩選變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值＞1.0的成分作為質(zhì)量差異性成分[15]。PLS-DA得分圖（圖6A）顯示，15批潛陽育陰顆?？煞譃? 類，S1、S4、S6 為一類，S2、S3、S5 為一類，S7～S10 為一類，S11 為一類，S12～S14 為一類，S15 為一類。VIP 圖（圖6B）顯示，峰3、9、6（莫諾苷）、7（馬錢苷）、15、12（二苯乙烯苷）、16（哈巴俄苷）的VIP 值分別為1.77、1.51、1.38、1.34、1.12、1.09、1.05，提示莫諾苷、馬錢苷、二苯乙烯苷、哈巴俄苷等成分可能是影響潛陽育陰顆粒樣品質(zhì)量的差異性成分。

2.3 潛陽育陰顆粒多成分含量的測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）；流動相A 為乙腈，流動相B 為水（含0.1%磷酸），采用梯度洗脫方法（0～15 min，5%A→15%A；15～30 min，15%A→30%A；30～40 min，30%A→80%A；40～42 min，80%A→95%A）；檢測波長分別為320 nm（阿魏酸、二苯乙烯苷）、250 nm（莫諾苷、杯莧甾酮、馬錢苷）、202 nm（哈巴苷、哈巴俄苷）；流速為0.3 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣量為2 μL。

2.3.2 供試品溶液的制備 按照“2.1.2”項下方法制備全方供試品溶液，并于進樣前稀釋5倍。

2.3.3 對照品溶液的制備 精密稱取哈巴苷、哈巴俄苷、莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸、杯莧甾酮對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.019 4、0.011 4、0.017 4、0.013 4、0.000 5、0.005 2 mg/mL 的混合對照品溶液；另精密稱取二苯乙烯苷對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.273 0 mg/mL的對照品溶液。

2.3.4 專屬性考察 取“2.3”項下供試品溶液、對照品溶液（混合對照品與二苯乙烯苷對照品溶液各取適量混合）和空白溶液（70%甲醇）適量，按照“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，各色譜峰分離度均大于1.5，空白溶液對各成分的檢測無干擾。結果見圖7（空白圖略）。

圖7 潛陽育陰顆粒專屬性考察的UPLC圖

2.3.5 標準曲線及線性范圍考察 取“2.3.3”項下混合對照品溶液，分別用甲醇稀釋0、2、5、10、20倍；取“2.3.3”項下二苯乙烯苷對照品溶液，分別用甲醇稀釋0、1.5、3、7.5、15倍。取上述溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件分別進樣，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度為橫坐標（X）、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，結果見表2。

2.3.6 精密度試驗 取“2.3.3”項下混合對照品溶液和二苯乙烯苷對照品溶液適量，混合后按照“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，哈巴苷、哈巴俄苷、莫諾苷、馬錢苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、杯莧甾酮峰面積的RSD 分別為3.88%、3.71%、3.36%、3.67%、2.85%、3.05%、3.22%（n＝6），表明儀器精密度良好。

表2 哈巴苷等待測成分的回歸方程、相關系數(shù)及線性范圍

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 按照“2.3.2”項下方法制備潛陽育陰顆粒（編號S1）供試品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 時按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，哈巴苷、哈巴俄苷、莫諾苷、馬錢苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、杯莧甾酮峰面積的RSD 分別為2.59%、1.71%、0.28%、3.30%、1.22%、1.87%、2.32%（n＝6），表明該溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 重復性試驗 取同一批次潛陽育陰顆粒樣品（編號S1）6份，按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按照“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算含量。結果顯示，哈巴苷、哈巴俄苷、莫諾苷、馬錢苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、杯莧甾酮含量的RSD分 別 為3.59%、4.71%、3.66%、4.07%、4.89%、4.70%、3.96%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 取已知含量的同一批次潛陽育陰顆粒樣品（編號S1）6 份，精密加入哈巴苷、哈巴俄苷、莫諾苷、馬錢苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、杯莧甾酮單一對照品溶液（以甲醇為溶劑配制，對應加入量分別為0.125 0、0.066 7、0.210 0、0.132 0、0.173 8、0.005 8、0.057 0 mg），按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按照“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結果顯示，各待測成分的平均加樣回收率分別為105.55%、95.00%、101.32%、101.43%、97.79%、105.17%、102.28%，RSD分別為2.90%、2.53%、2.47%、4.11%、4.83%、2.07%、4.13%（n＝6），表明方法準確度良好。

2.3.10 含量測定 取15 批潛陽育陰顆粒樣品，按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按照“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算含量，結果見表3。

表3 15批潛陽育陰顆粒樣品中7種待測成分的含量測定結果（mg/g）

3 討論

3.1 提取方法的優(yōu)化

本課題組前期以潛陽育陰顆粒色譜圖中色譜峰數(shù)量、分離效果及哈巴苷、哈巴俄苷、莫諾苷、馬錢苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、杯莧甾酮總提取率為指標，對不同提取溶劑（甲醇、70%甲醇、50%甲醇）、溶劑用量（20、30、40倍量）、提取方式（超聲、回流提?。⑻崛r間（10、20、30 min）進行了考察，結果顯示，以20倍量的70%甲醇超聲提取20 min 的效果最優(yōu)，故采用上述方法制備供試品溶液。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

本課題組前期通過二極管陣列檢測器在190～400 nm 波長范圍內(nèi)掃描發(fā)現(xiàn)，在250 nm 波長處所得色譜峰較多且分離度較好，所以UPLC指紋圖譜的檢測波長設為250 nm。同時，本課題組綜合2020 年版《中國藥典》（一部）和文獻相關內(nèi)容[13，16]，最終確定定量分析中哈巴苷、哈巴俄苷的檢測波長為202 min，莫諾苷、杯莧甾酮、馬錢苷的檢測波長為250 nm，阿魏酸和二苯乙烯苷的檢測波長為320 nm。

本課題組進一步考察了甲醇-水（含0.1%磷酸）、乙腈-水（含0.1%磷酸）、乙腈-水（含0.2%磷酸）等不同流動相體系及不同柱溫（30、35、40 ℃）對色譜峰分離的影響，最終選擇流動相為乙腈-水（含0.1%磷酸），柱溫為35 ℃。方法學考察結果顯示，在“2.1.1”“2.3.1”項下色譜條件下，所得色譜峰峰形及分離度均良好。

3.3 結果分析

本研究建立了潛陽育陰顆粒的UPLC 指紋圖譜，該法操作簡便、結果準確；15 批潛陽育陰顆粒指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.96，表明15批制劑所含成分的相似度較高，質(zhì)量均一、穩(wěn)定?；瘜W模式識別分析結果表明，不同批次的潛陽育陰顆粒樣品具有一定的差異。其中，CA 與PCA 的分類結果基本一致，15 批潛陽育陰顆粒樣品可被分為6 類，即S1、S2、S4～S6 為一類，S3 為一類，S7、S8 為一類，S9、S10 為一類，S11～S14為一類，S15為一類；PLS-DA結果則將S1、S4、S6分為一類，S2、S3、S5 分為一類，S7～S10 分為一類，S11 分為一類，S12～S14 分為一類，S15 分為一類，這可能與CA、PCA 和PLS-DA 建模方式的不同有關。PCA 載荷圖與VIP 值篩選結果均提示莫諾苷（峰6）、馬錢苷（峰7）、二苯乙烯苷（峰12）和哈巴俄苷（峰16）對潛陽育陰顆粒的質(zhì)量影響較大，因此擬對這4種成分進行定量分析。此外，哈巴苷為玄參的指標成分，具有抗炎、抗氧化、保護神經(jīng)、保護心肌等作用[11]；阿魏酸具有抗高血壓、抗炎、保護心臟等作用[12]；杯莧甾酮為2020 年版《中國藥典》（一部）“川牛膝”項下規(guī)定的指標成分[13]，因此本研究最終選擇哈巴苷、哈巴俄苷、莫諾苷、馬錢苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、杯莧甾酮進行定量分析。結果顯示，15 批潛陽育陰顆粒樣品中各目標成分的含量有所不同，這可能與原藥材本身的質(zhì)量差異有關。

綜上所述，本研究建立了潛陽育陰顆粒的指紋圖譜及7種成分的含量測定方法，可用于提高和完善該制劑的質(zhì)量控制標準；莫諾苷、馬錢苷、二苯乙烯苷、哈巴俄苷等成分可能是影響該制劑質(zhì)量的差異性成分。