一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定木瓜中5種五環(huán)三萜類成分的含量Δ

張亭亭，胡浩寧，李平媛，黃永梅，汪鋆植#，唐海明，尹永紅（1.三峽大學(xué)健康醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌4400；.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 4400；.湖北恒安芙林藥業(yè)股份有限公司，湖北宜昌4410）

木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai 的干燥近成熟果實(shí)，又名皺皮木瓜、鐵腳梨，具有舒筋活絡(luò)、和胃化濕之功效，可用于治療濕痹拘攣、腰膝關(guān)節(jié)酸重疼痛、暑濕吐瀉、轉(zhuǎn)筋攣痛、腳氣水腫，有“杏一益，梨二益，木瓜百益”之說(shuō)[1]。木瓜主要含有黃酮類、有機(jī)酸類、三萜類、皂苷類、糖類、鞣質(zhì)等成分，其中五環(huán)三萜類成分為其活性成分，包括齊墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、3-O-乙酰熊果酸等成分，具有抗炎、保肝、抗腫瘤、抗病毒、抑菌、保護(hù)胃黏膜和降血脂等作用[2-3]。木瓜現(xiàn)收載于2020 年版《中國(guó)藥典》（一部），僅以齊墩果酸和熊果酸為指標(biāo)成分進(jìn)行質(zhì)量控制[4]。

一測(cè)多評(píng)（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）法是一種利用中藥有效成分的內(nèi)在函數(shù)及比例關(guān)系來(lái)實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)質(zhì)量控制的含量測(cè)定方法[5]，已被廣泛用于中藥材及其復(fù)方制劑的質(zhì)量控制領(lǐng)域[6-7]。雖然已有學(xué)者采用QAMS 法，以齊墩果酸為內(nèi)參物，但僅同時(shí)測(cè)定了木瓜中齊墩果酸、熊果酸的含量[8]。由于木瓜中五環(huán)三萜類成分復(fù)雜，僅對(duì)少數(shù)幾個(gè)成分進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)法充分反映藥材的整體質(zhì)量，且其中一些五環(huán)三萜類成分的對(duì)照品難以獲得、價(jià)格昂貴，因此本研究擬采用QAMS 法同時(shí)測(cè)定木瓜中3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸5種五環(huán)三萜類成分的含量，旨在為木瓜藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有DIONEX Ultimate 3000 型高效液相色譜（HPLC）儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、GZX-9240MBE 型鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、FA2004 型十萬(wàn)分之一分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）、KQ-400DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）等。

1.2 藥品與試劑

齊墩果酸對(duì)照品（批號(hào)B20954）、熊果酸對(duì)照品（批號(hào)B21403）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，純度均不低于98%；白樺脂酸對(duì)照品（批號(hào)Wkq18030810）、3-O-乙酰熊果酸對(duì)照品（批號(hào)Wkq17112306）均購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司，純度均不低于98%；3-O-乙酰坡模醇酸對(duì)照品由三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備，經(jīng)HPLC面積歸一化法檢測(cè)其純度≥98%；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

木瓜藥材采自湖北長(zhǎng)陽(yáng)、浙江淳安、安徽宣城、重慶黔江4個(gè)產(chǎn)地，經(jīng)三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院陳發(fā)菊教授鑒定為薔薇科木瓜屬植物貼梗海棠C.speciosa（Sweet）Nakai 的干燥近成熟果實(shí)。將同一產(chǎn)地樣品分為兩部分，一部分用鮮切工藝進(jìn)行炮制（將木瓜對(duì)半縱剖，然后切薄片，于80 ℃烘干）；另一部分用傳統(tǒng)工藝進(jìn)行炮制（將木瓜對(duì)半縱剖，曬干，經(jīng)潤(rùn)透或蒸透后切薄片，于80 ℃烘干），共得到8 批木瓜樣品，其具體來(lái)源信息見(jiàn)表1。

表1 木瓜藥材樣品的來(lái)源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以COSMOSIL 5 C18-MS-Ⅱ（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈-0.005 mol/L 磷酸氫二銨溶液（用磷酸調(diào)pH 至6.5）（70∶30，V/V）為流動(dòng)相；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別取3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸對(duì)照品約8、4、19、16、8 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得混合對(duì)照品貯備液；精密量取該貯備液1 mL，加甲醇適量，制得上述各成分質(zhì)量濃度分別為81.2、42.4、192.3、155.4、84.1 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取藥材樣品粉末約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液（編號(hào)S1）、空白對(duì)照溶液（甲醇），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖1（空白對(duì)照溶液圖略）。由圖1可知，3-O-乙酰坡模醇酸等5 種成分的分離效果較好，分離度均大于1.5，空白對(duì)照溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 3-O-乙酰坡模醇酸等成分混合對(duì)照品溶液、供試品溶液的HPLC圖

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，分別用甲醇稀釋1、5、10、15、20倍，得系列線性溶液。取上述各線性溶液及混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3-O-乙酰坡模醇酸等成分的回歸方程和線性范圍

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸峰面積的RSD 分別為2.65%、2.90%、1.00%、1.85%、0.49%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h 時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸峰面積的RSD分別為0.35%、2.71%、1.66%、0.90%、1.09%（n＝8），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取木瓜藥材樣品（編號(hào)S1）粉末1.0 g，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸含量的RSD 分別為1.97%、2.86%、2.19%、0.94%、2.14%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的木瓜藥材樣品（編號(hào)S1）粉末50 mg，共6 份，分別加入一定量的混合對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸的平均加樣回收率分別為100.47%、100.16%、98.29%、101.38%、98.40%，RSD 分別為0.90%、2.07%、0.41%、1.67%、1.56%（n＝6）。

2.9 QAMS法相對(duì)校正因子的確定

2.9.1 相對(duì)校正因子的計(jì)算 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣1、2、5、10、20 μL，以齊墩果酸（含量較高且對(duì)照品易得）為內(nèi)參物，按下式計(jì)算齊墩果酸相對(duì)于其他成分的相對(duì)校正因子（fsi）：fsi＝（As/Cs）/（Ai/Ci）（式中，As為內(nèi)參物峰面積，Cs為內(nèi)參物質(zhì)量濃度，Ai為待測(cè)成分色譜峰峰面積，Ci為待測(cè)成分質(zhì)量濃度[5]）。結(jié)果顯示，3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸的平均相對(duì)校正因子分別為1.281、1.641、1.261、1.408，RSD 分 別 為2.090%、2.280%、1.250%、1.040%（n＝5），表明各成分相對(duì)校正因子的準(zhǔn)確性較好。

2.9.2 耐用性考察 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，考察不同色譜儀（DIONEX Ultimate 3000 型HPLC 儀、島津LC-20A 型HPLC儀）、色譜柱[Ultimate XB Cl8、Cosmosil C18-MS-Ⅱ、SPOLAR C18（規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5 μm）]對(duì)相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果顯示，3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸的平均相對(duì)校正因子分別1.286、1.630、1.252、1.413，RSD 均小于3%（n＝5）,表明不同色譜儀及色譜柱對(duì)3-O-乙酰坡模醇酸等4種成分的相對(duì)校正因子無(wú)明顯影響，該方法耐用性良好。

2.9.3 相對(duì)校正因子的確定 根據(jù)“2.9.2”項(xiàng)下結(jié)果，最終確定3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸的相對(duì)校正因子分別為1.286、1.630、1.252、1.413。

2.9.4 色譜峰的定位 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別考察不同色譜儀（DIONEX Ultimate 3000 型HPLC 儀、島津LC-20A 型HPLC儀）、色譜柱[Ultimate XB Cl8、Cosmosil C18-MS-Ⅱ、SPOLAR C18（規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5 μm）]對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響。結(jié)果顯示，3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均小于5%（n＝5），表明相對(duì)保留時(shí)間法可用于3-O-乙酰坡模醇酸等成分的初步定位。

2.10 樣品含量測(cè)定

取8 批木瓜藥材樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，分別按外標(biāo)法、QAMS法（以齊墩果酸為內(nèi)參物）計(jì)算樣品含量，采用相對(duì)偏差[相對(duì)偏差＝（QAMS法含量-外標(biāo)法含量）/外標(biāo)法含量×100%]考察2 種方法所得結(jié)果的差異。每樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 木瓜中3-O-乙酰坡模醇酸等成分的含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）

由表3 可知，2 種方法所得含量測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差均小于8%。同時(shí)，采用SPSS 22.0 軟件對(duì)2 種方法所得含量結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，2 種方法所得結(jié)果組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明采用QAMS法同時(shí)測(cè)定木瓜中多種三萜類成分是可行的。

此外，本研究采用外標(biāo)法比較了不同產(chǎn)地鮮切和傳統(tǒng)工藝加工木瓜中齊墩果酸與熊果酸的總含量及5種成分的總含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同產(chǎn)地鮮切和傳統(tǒng)工藝加工木瓜中部分成分的含量比較（±s，n＝3，%）

表4 不同產(chǎn)地鮮切和傳統(tǒng)工藝加工木瓜中部分成分的含量比較（±s，n＝3，%）

a：與重慶黔江產(chǎn)木瓜比較，P＜0.05

產(chǎn)地湖北長(zhǎng)陽(yáng)浙江淳安安徽宣城重慶黔江齊墩果酸與熊果酸的總含量鮮切工藝0.680 5±0.013 9 0.583 5±0.006 6 0.639 5±0.005 9 0.528 0±0.008 3傳統(tǒng)工藝0.636 5±0.012 4 0.537 5±0.015 9 0.609 5±0.005 9 0.518 5±0.005 9 5種成分的總含量鮮切工藝0.916 0±0.006 3a 1.061 0±0.047 9a 0.818 0±0.006 8a 1.306 5±0.035 5傳統(tǒng)工藝0.829 0±0.007 5a 0.817 5±0.026 5a 0.770 5±0.021 0a 1.283 5±0.041 7

由表4 可知，不同木瓜樣品中齊墩果酸與熊果酸的總含量均不低于0.5%，符合2020 年版《中國(guó)藥典》（一部）的要求[4]。不同產(chǎn)地、不同炮制工藝木瓜樣品中5種成分的總含量存在差異；而在同一產(chǎn)地的鮮切工藝加工木瓜中，2 種成分的總含量和5 種成分的總含量均高于傳統(tǒng)工藝加工木瓜，平均升高5.62%、10.83%，其中重慶黔江產(chǎn)木瓜中5 種成分的總含量顯著高于其他產(chǎn)地（P＜0.05）。

3 討論

木瓜中的五環(huán)三萜類成分是其主要的活性成分[9-10]。本課題組前期比對(duì)了相關(guān)文獻(xiàn)[11-12]，并在HPLC分析的基礎(chǔ)上，最終選擇了3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸作為木瓜藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)。

本課題組前期曾采用2020 年版《中國(guó)藥典》（一部）“木瓜”項(xiàng)下齊墩果酸和熊果酸的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，但實(shí)踐結(jié)果顯示，各成分的分離度欠佳；隨后，參照相關(guān)文獻(xiàn)[13-14]，對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定了“2.1”項(xiàng)下色譜條件。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果顯示，各成分分離良好，此法可用于木瓜中多種五環(huán)三萜類成分的定量分析。

含量測(cè)定結(jié)果顯示，QAMS法與外標(biāo)法所得3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸含量的相對(duì)偏差均小于8%，表明2種方法所得含量結(jié)果無(wú)明顯差異。不同產(chǎn)地鮮切和傳統(tǒng)工藝加工木瓜中齊墩果酸與熊果酸的總含量均不低于0.5%，5種成分的總含量均不低于0.7%；在同一產(chǎn)地的鮮切工藝加工木瓜中，無(wú)論是齊墩果酸與熊果酸的總含量還是5種成分的總含量均高于傳統(tǒng)工藝加工木瓜，其中齊墩果酸和熊果酸的總含量平均升高5.62%，5種成分的總含量平均升高10.83%。這表明不同產(chǎn)地、不同炮制工藝木瓜中5種成分含量存在差異，以多成分為指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量分析較單一指標(biāo)更為科學(xué)、合理。此外，木瓜鮮切片采用產(chǎn)地加工炮制一體化工藝，集中采收鮮果，一次性加工，中間環(huán)節(jié)明顯減少且操作規(guī)范，有利于提高木瓜藥材的質(zhì)量。

綜上所述，本研究建立了同時(shí)測(cè)定木瓜中3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸含量的QAMS法，該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確。重慶黔江產(chǎn)木瓜中5種成分的總含量較高，且同一產(chǎn)地鮮切工藝加工木瓜總含量高于傳統(tǒng)工藝加工木瓜。