西瓜分子標記輔助育種研究與應用進展

張金鵬，金 鑫，趙艷菲，陳 瑩，惠長敏

（吉林省蔬菜花卉科學研究院 長春 130033）

西瓜（）是世界十大水果之一，我國是世界第一大西瓜生產國和消費國，西瓜的栽培面積和產量居世界首位。優(yōu)良的西瓜品種是保障高效、優(yōu)質生產的基礎。近年來，我國的西瓜科研和育種工作取得了較大進展，完成了高質量的西瓜基因組序列圖譜，通過大規(guī)?；蚪M重測序揭示了西瓜果實品質與抗性的選擇馴化歷程，并解析了糖分積累、糖酸代謝、瓤色進化、風味形成等重要代謝途徑的分子機制，對西瓜果實品質、植株形態(tài)、抗病抗逆等重要農藝性狀進行了基因定位，開發(fā)了大量與目標性狀緊密連鎖的分子標記。為分子標記輔助西瓜育種奠定了堅實的基礎，極大地促進了分子標記輔助選擇在西瓜品種改良和新品種選育中的應用和發(fā)展，并利用該技術育成早熟、抗病、優(yōu)質、豐產的京欣系列西瓜品種和系列優(yōu)質、抗逆（抗病、耐濕、耐鹽等）、綜合性狀優(yōu)良的無籽西瓜新品種。劉文革對西瓜重要農藝性狀功能基因遺傳和定位信息進行了總結，綜述了西瓜遺傳育種研究進展并對前景進行展望，具有重要參考意義。利用分子標記輔助選擇能夠容易、快捷、精確選擇具有目標基因或性狀的西瓜育種材料，實現對目的基因的跟蹤；同時不受環(huán)境因素和生長時期的影響，避免表型選擇不準確和受時間限制；減少了田間工作量，提高了育種效率，加快了西瓜育種進程，具有重要研究意義和應用價值?，F就分子標記技術輔助西瓜育種研究與應用總結如下。

1 抗病蟲育種

1.1 抗枯萎病

西瓜枯萎病是導致西瓜生產中產量和品質下降、甚至絕收的真菌土傳病害，西瓜抗枯萎病相關分子標記研究相對較早，已經開發(fā)出多個與枯萎病抗性緊密連鎖的分子標記，并廣泛應用于西瓜抗枯萎病種質篩選和新品種選育之中。張屹等研究表明，栽培西瓜對枯萎病生理小種1 的抗性受顯性單基因控制，開發(fā)了3 個抗西瓜枯萎病菌生理小種1的 CAPS/dCAPS 標 記 7716_fon、7419_fon 和4451_fon，在164 份優(yōu)良西瓜育種材料中進行了驗證，3 個標記與田間抗病表型性狀的符合率分別為98.7%、96.9%、80.4%，可以有效區(qū)分栽培西瓜對枯萎病菌生理小種1 的抗病、感病性，為西瓜栽培品種枯萎病抗性改良建立了有效的技術手段。REN等開發(fā)了用于檢測西瓜枯萎病生理小種1 抗性基因-的SNP 標記Chr1SNP_502124，在231 株F種群中進行了測試，小種fon 1 接種后第21 天，229 株植物的表型與基于該SNP 標記預測的基因型一致。李娜等對西瓜枯萎病生理小種1 抗性進行了QTL 精細定位，將fon 1 的置信區(qū)間鎖定在1號染色體的459 624～704 880 bp，縮減至246 kb 的物理距離，開發(fā)了InDel 標記，并在130 份西瓜資源中分析驗證，與田間抗病表型性狀的符合率達到70.8%，同時該標記簡便實用、高效低耗。焦荻等使用SNP 標記對各世代群體進行分子標記輔助選擇及苗期抗病性接種鑒定，在構建的673 株BCF代自交群體中檢測到29 株純合基因型（AAAA）抗病單株，占總檢測株數的4.31%，與苗期抗病性接種鑒定結果符合度達到100%。利用西瓜枯萎病分子標記輔助育種體系，焦定量等選育了2 個高抗枯萎病西瓜品種科優(yōu)102 和津早30；范敏等選育了3 個抗性達中抗以上的西瓜新品種紅和平、天成和豐華21；羊杏平和徐錦華等選育了早抗京欣和蘇蜜5 號等系列抗病品種。

1.2 抗白粉病

西瓜白粉病主要危害西瓜葉片、葉柄和莖，限制葉片的光合作用，影響西瓜品質和產量。KIM等發(fā)現了與西瓜白粉病抗性緊密連鎖的標記物OP-483，并轉化為SNP 標記MCA-A/G，研究認為，西瓜抗白粉病性狀受不完全顯性單基因控制，候選基因位于2 號染色體（Chr02）上，檢測到的pmr2.1，解釋了80.0%的表型變異。MANDAL 等通過對西瓜-白粉病互作過程中的抗性信號解析發(fā)現，抗性基因座是顯性基因，抗性基因被鑒定為，在20 個測試品系中與具有白粉病抗性個體中的抗性基因座共分離，基因可用于西瓜抗白粉病分子標記輔助育種，具有重要價值。姬萬麗等以198 份不同種質資源類型的西瓜為試驗材料，運用CAPS 標記技術分別對這些種質資源進行抗白粉病、枯萎病基因型分析，其中35 份表現為抗白粉病基因型，還發(fā)現了23 份兼抗枯萎病和白粉病的材料。

1.3 抗炭疽病

西瓜炭疽病在西瓜整個生長周期均可發(fā)生，葉片、莖蔓、果實均能感病，嚴重危害西瓜生產。JANG 等研究表明，西瓜炭疽病抗性由單個顯性等位基因決定，發(fā)現炭疽病抗性的表型變異可通過位于的外顯子上CL14-27-9 SNP 的基因型來驗證。張敬敬等使用已開發(fā)的西瓜抗炭疽病、抗枯萎病、抗白粉病分子標記，利用高通量分型KASP 技術對130 份西瓜種質相關的基因進行了檢測，19 份材料含抗炭疽病基因，5 份材料同時含抗炭疽病基因和抗枯萎病基因，1 份材料同時含抗炭疽病基因和抗白粉病基因，1 份材料同時含有3 種抗病基因。易麗聰等利用已報道的西瓜抗枯萎病、炭疽病和白粉病分子標記對230 份西瓜種質資源進行抗病性鑒定，分別篩選出相應的抗性種質60份、20 份和35 份，其中，兼抗炭疽病和枯萎病的資源6 份，兼抗炭疽病和白粉病的資源6 份。武彥榮等利用高通量抗多種病害分子標記輔助選擇與常規(guī)育種技術相結合的高效育種技術體系，創(chuàng)制出枯萎病、白粉病、炭疽病單抗或多抗西瓜骨干自交系18 份，其中JB-3 同時抗3 種病害；培育出4 個設施多抗優(yōu)質豐產耐貯運西瓜新品種華欣2 號、美勝、星研七號、美佳。

1.4 抗蔓枯病

蔓枯病是西瓜的主要病害之一，主要危害瓜蔓、葉片和果實。關于西瓜蔓枯病抗性的分子機制研究相對較少，有研究表明，西瓜蔓枯病抗性可能與多個基因座有關。HASSAN 等確定了6 個可能參與西瓜對致病菌感染的反應候選基因，包括Chr8 上的、和以及Chr1、Chr2 和Chr5 上的、和，為進一步開展功能研究和開發(fā)抗蔓枯病西瓜分子標記提供了基礎。LEE 等研究表明，8 號染色體上的qLL8.1 和qSB8.1 兩個QTL 被確定為主要QTL，6 號染色體上的qSB6.1 被確定為次要QTL，同時為了驗證qLL8.1 和qSB8.1 的QTL效 應，將 2 個 側 翼 標 記（chr8_WGRS240 和chr8_WGRS(3)185）轉化為KASP 標記，并在9 個西瓜種質和13 個商業(yè)栽培品種中進行驗證，6 個種質對蔓枯病具有高抗性并具有抗性基因型。GIMODE 等確定了3 個與蔓枯病抗性相關的QTL（ClGSB3.1、ClGSB5.1 和ClGSB7.1），解 釋了6.4%～21.1%的表型變異，針對ClGSB5.1 和ClGSB7.1 開發(fā)標記用于西瓜分子標記輔助育種，并提出作為西瓜蔓枯病抗性的候選基因。

1.5 抗細菌性果斑病

細菌性果斑病由西瓜嗜酸菌引起，在西瓜各個生長期間均能發(fā)生，是一種毀滅性病害。栽培西瓜的細菌性果斑病抗性大多數來源于其近緣種飼用西瓜，且由于受環(huán)境影響強烈、低遺傳力和顯著的基因型與環(huán)境的相互作用而變得復雜，尚未發(fā)現具有免疫性的種質。BRANHAM 等利用抗細菌性果斑?。║SVL246-FR2）和易感細菌性果斑?。║SVL114）品系之間雜交建立的重組自交系群體，研究葉片對西瓜細菌性果斑病菌的抗性，確定了6 個與葉片細菌性果斑病抗性顯著相關的QTL，每個QTL解釋了種群中細菌性果斑病抗性變異的5%～15%，其中，3 個QTL（qAc-1.1、qAc-2.1 和qAc-8.1，分別位于1、2 和8 號染色體）解釋了最高比例的變異。WU 等在飼用西瓜和黏籽西瓜第10 號染色體上鑒定了2 個QTL 可用于分子標記的開發(fā)，構建抗性基因，以提高栽培西瓜對細菌性果斑病的抗性。

1.6 抗病毒病和蚜蟲

西瓜病毒病主要通過種子帶菌和蚜蟲汁液傳播。劉潔對西瓜抗黃瓜綠斑駁花葉病毒病進行遺傳分析與抗性基因定位研究，結果表明，西瓜病毒病抗性由多對隱性基因控制，初步定位了西瓜抗黃瓜綠斑駁花葉病毒的候選基因位于4號染色體20.95～21.96 Mb 的關聯區(qū)域，關聯區(qū)域內共注釋到56 個基因。高寧寧等利用SRAP 分子標記對51份西瓜抗、感病毒病種質資源遺傳多樣性分析，為加速西瓜抗病毒病新品種的選育進程提供理論參考，發(fā)現抗病毒型與感病毒型西瓜種質的親緣關系較近，遺傳多樣性豐富度不高。馬少芹等研究了西瓜抗小西葫蘆黃花葉病毒基因的連鎖分子標記，成功轉化的SCAR 標記SCAK13-644 在小西葫蘆黃花葉病毒中國株系抗性轉育后代自交系上得到了驗證，表明該標記可以作為西瓜抗病毒病輔助選擇的分子標記。徐雪蓮研究發(fā)現，西瓜抗蚜性由單顯性核基因控制，且能穩(wěn)定遺傳，并從89 個隨機引物中篩選得到1 個與西瓜抗蚜性基因連鎖的分子標記W04530，并轉化為SCAR 標記W04-S，在F群體和供試抗、感品種中進行了驗證，為今后西瓜抗蚜種質資源的篩選與鑒定、抗蚜性分子輔助育種的選擇奠定了基礎。

2 品質改良育種

品質性狀是西瓜新品種選育過程中最重要的目標之一，隨著人們對美好生活的向往，高品質、多樣化、獨具特色的西瓜越來越受到市場歡迎，而且經濟效益更高。高效的分子標記輔助選擇更能加快優(yōu)質特色西瓜新品種的選育速度，有效促進西瓜新品種品質改良。近年來，西瓜果實糖度、果肉硬度、果實pH、耐裂性、果實苦味等品質性狀是研究和應用的熱點。許勇團隊全面系統(tǒng)解析了西瓜果實“甜蜜”基因4 個重要節(jié)點進化的分子機制，建立了高效轉育高糖、高品質的西瓜分子標記輔助育種技術體系，結合常規(guī)育種技術，從野生材料引入了抗病、硬脆果肉、抗裂、耐貯運等優(yōu)異基因，培育了京美系列西瓜品種。高磊等利用SSR 標記對西瓜果肉硬度性狀的連鎖分析發(fā)現，位于第6 染色體上的標記BVWS00954 與控制西瓜果肉硬度的基因連鎖。SUN 等通過西瓜果肉硬度的連鎖圖譜和轉錄組分析，將控制西瓜果肉硬度的主要基因定位于2 號染色體和8 號染色體，為控制西瓜果肉硬度基因的精細定位、圖位克隆及分子標記輔助選擇育種奠定了基礎。ANEES 等研究發(fā)現，參與細胞壁生物合成和乙烯途徑的8 個基因為果實硬度基因調控模塊中的樞紐基因，分別是、、、、、、、。

糖和有機酸含量對西瓜果實風味形成起重要作用，果實糖度和硬度一直是育種的重要目標性狀，被育種家所重視，西瓜的酸味、苦味、耐裂等風味或性狀也逐漸引起育種家的興趣。高磊對西瓜果實酸味性狀的主效基因進行了精細定位，發(fā)現僅有和這2 個基因在不同果實酸味的材料中差異表達，可能對西瓜果實中有機酸的積累起決定作用。JAWAD 等挖掘到了38 個與西瓜果實糖酸合成與轉運相關的關鍵基因，為提高西瓜果實品質和風味分子標記輔助育種奠定了重要基礎。江海坤對西瓜裂果機制及其分子標記進行了研究，篩選出的引物me8-em1 可能是與裂果相關的SRAP 標記。李兵兵和GONG 等發(fā)現，西瓜苦味是顯性性狀，結合遺傳圖譜和精細定位推測基因為控制西瓜果實苦味的候選基因，并獲得與目標性狀緊密連鎖的分子標記，可用于西瓜分子標記輔助育種。以上研究涵蓋了鮮食西瓜重要的品質性狀，可以作為西瓜新品種品質改良重要、高效的輔助手段。在不同西瓜育種群體中應用時應事先驗證標記的有效性，從而準確、快速篩選育種目標基因。劉文革團隊通過西瓜分子標記技術、離體細胞染色體加倍技術與傳統(tǒng)的雜交育種技術有機結合，選育出高番茄紅素、瓜氨酸含量的高品質西瓜新品種綠野無籽、金蘭無籽等，利用SSR 分子標記篩選具有酸味的西瓜株系并篩選出了酸甜風味西瓜株系SW。

3 其他農藝性狀改良育種

3.1 果實性狀

果實性狀在西瓜新品種選育過程中能夠最直觀地顯示品種特色，不同的果肉顏色、果皮顏色、果皮覆紋和果實形狀極大豐富了西瓜果實類型的多樣化，也是新品種選育的重要目標性狀。關于西瓜果肉顏色、果實形狀、果皮顏色、果皮覆紋、果粉等性狀緊密連鎖的分子標記也被相繼開發(fā)和利用。ZHANG 等研究明確了西瓜紅瓤基因功能，并揭示了轉錄后翻譯及蛋白水平調控是果肉細胞類胡蘿卜素代謝的有效途徑，豐富了果實類胡蘿卜素代謝途徑調控理論，并為高品質西瓜育種提供了理論依據。LI 等確定了一個調控西瓜的鮮紅色果肉顏色的顯性基因Y，將其定位到6 號染色體上的一小段區(qū)域內，開發(fā)了2 個Indel 標記用于深紅色果肉西瓜的輔助選擇。WANG 等研究表明，紅肉顏色是由隱性基因控制的，精細定位到第4 號染色體上2 個候選基因和，開發(fā)了能夠區(qū)分西瓜紅色和黃色果肉的CAPS 標記，并在81 個西瓜種質中檢測驗證。SUBBURAJ 等開發(fā)了與不同的果肉類型有共分離的CAPS 標記，可用于區(qū)分紅色、黃色和橙色的果肉顏色類型。

豆峻嶺發(fā)現西瓜果形長、圓受單基因控制，表現不完全顯性遺傳，控制西瓜果實長、圓的候選基因為，開發(fā)出了一個InDel 標記，并在F群體以及105 份自然群體中進行了驗證。李娜等利用不同類型的西瓜核心種質實現了西瓜果形的分子精準鑒定，還挖掘到2 個西瓜果形的功能變異并開發(fā)標記，為西瓜果形的分子精準鑒定提供技術支撐。PARK 等定位了西瓜3 個果皮表型的基因位點（S 位點果皮條紋有或無，D 位點果皮顏色墨綠或淺綠，Dgo 位點果皮顏色綠或黃色），這3 個基因座位于不同的染色體上，通過分子遺傳分析驗證了西瓜果皮表型的三基因座模型，提出了一種快速實用的分子標記開發(fā)策略。白晶研究表明，西瓜果皮綠色深淺是受多個基因調控的數量性狀，并且果皮深綠色對淺綠色為不完全顯性。LI 等對控制西瓜果皮顏色（墨綠色淺綠色）的候選基因精細定位到8 號染色體142.7～154.7 cM 范圍內，并獲得了可能的候選基因，同時設計了1個CAPS 標記并在103 份西瓜種質資源中進行驗證，結果表明，該標記與西瓜果皮顏色表型緊密連鎖。豆峻嶺研究表明，西瓜果皮黃色為單基因控制，黃皮對綠皮為顯性，將黃色果皮候選基因定位到4號染色體59.8 kb 的區(qū)域內，并開發(fā)出了1 個和西瓜果皮黃色緊密連鎖的SNP 標記，并且在20個自然群體中進行了驗證，該標記可用于果皮黃色的苗期鑒定以及分子標記輔助育種。KIM 等開發(fā)了用于選擇Jubilee 型條紋圖案的分子標記wsbin6-11。欒非時等對西瓜果皮蠟粉相關基因的研究表明，西瓜果皮蠟粉性狀受1 對顯性基因控制，在第8 號染色體定位到1 個距離為2.78 cM 控制西瓜果皮蠟粉的位點和2 個與該位點緊密連鎖的CAPS 標記，分別為w8-6149 和w8-0794，利用100份西瓜自然群體材料分析2 個與西瓜果皮有蠟粉緊密連鎖標記的有效性，分子數據與田間數據吻合率分別為79.0%和72.0%。

3.2 植株性狀

西瓜植株性狀比較豐富，像短蔓、少側蔓等性狀有利于西瓜的簡約化栽培，培育栽培上省工省力、適合精簡化生產的西瓜品種也是西瓜育種的一個重要方向。西瓜植株性狀的分子標記輔助選擇研究和應用主要在節(jié)間長度（短蔓、矮化）、無側蔓、無卷須、裂刻葉、葉片顏色、強健根系等方面，促進了西瓜植株多樣化的育種。WEI 等和GEBREMESKEL 等對西瓜節(jié)間長度和矮化性狀進行了研究，開發(fā)了與短蔓性狀緊密連鎖的分子標記，為西瓜短蔓性狀的分子標記輔助選擇奠定了基礎。ZHU 等將-基因精細定位在9 號染色體上107.00 kb 的候選區(qū)域，預測有6 個基因位于候選區(qū)域，其中的表達水平在矮株系WM102 中測試的所有組織中均顯著降低。HAILESLASSIE研究表明西瓜短蔓為單基因控制的隱性性狀，并將候選區(qū)間定位于9 號染色體，發(fā)現可能是控制西瓜節(jié)間長度的候選基因；同時發(fā)現西瓜葉色后綠性狀受單個隱性基因（）控制，并精細定位到3 號染色體一個53.54 kb的區(qū)域內，表明可能是控制西瓜葉色后綠的候選基因。DOU 等鑒定了一個由單個隱性基因控制的側向無枝性狀，將無側枝基因定位在西瓜4 號染色體上，候選基因為，開發(fā)的dCAPS 標記在BC和F群體中的無分枝表型共分離，并在152 個西瓜種質中驗證。WEI 等定位了控制西瓜裂刻葉的基因，陳鑫兒對西瓜裂刻葉基因進行了精細定位，確認為候選基因，以助力西瓜分子標記輔助選擇育種。

3.3 種子性狀

西瓜種子像西瓜果實和植株一樣，豐富多彩，多樣化性狀明顯。鮮食西瓜無籽或種子越小越好，有利于提升吃瓜的方便性和愉悅感；籽用西瓜的種子越大越好，這樣能提供更加豐富的油類和蛋白質等營養(yǎng)物質。同時西瓜種子還具有不同的顏色，有的種子上還會有覆紋或種臍斑。關于西瓜種子性狀也有一定的研究進展，已經報道關于西瓜種子大小、種皮顏色、種臍斑性狀、黏籽等性狀的分子標記開發(fā)和利用。LI 等發(fā)現了西瓜種子大小的候選基因并精細定位，確定了qSS4 和qSS6 為種子大小的2 個多效性QTL；qSS6 分別解釋了千粒重、種子長度和種子寬度表型變異的93.00%、94.11%和95.26%，被定義為主要QTL；并開發(fā)了相關分子標記用于西瓜種子大小的輔助篩選。LI 等研究表明，單個顯性基因控制西瓜黑色種皮，將西瓜黑色種皮的候選基因定位到3 號染色體上70.2 kb 的區(qū)間內，區(qū)間內命名為1 的能夠編碼多酚氧化酶，該酶參與黑色素生物合成的氧化步驟，是西瓜黑色種皮顏色的候選基因。PAUDEL等開發(fā)了KASP 檢測和與4 個基因座相關的SNP 標記UGA3_5820134、UGA5_4591722、UGA6_7076766 和UGA8_22729513，以促進西瓜種皮顏色的標記輔助選擇。張曉雨確定了為西瓜種臍斑性狀的候選基因，利用開發(fā)dCAPS 分子標記Zshpr101 在71 份材料的種質資源群體中驗證，基因型與表型符合率為69%。

4 展 望

除上述西瓜性狀分子標記之外，還有西瓜雌性系基因、細胞核雄性不育、重要抗逆基因等緊密連鎖的分子標記被挖掘和應用。SSR、CAPS、Indel、SNP-KASP 分子標記相繼在西瓜育種中研究和應用，分子標記輔助選擇已成為高效的育種手段應用于西瓜抗病抗逆抗蟲育種、品質改良和多樣化育種、適宜精簡化栽培品種的選育。但是開發(fā)的分子標記在不同育種群體中的適用性有待進一步確認和研究，且大部分集中在西瓜的質量性狀，對受微效多基因控制的數量性狀標記的研究仍具有一定的局限性。

隨著分子生物學和生物信息學的發(fā)展，分子標記輔助西瓜育種將會更加精準、實用、高效。通過分子標記輔助選擇和常規(guī)育種相結合，開展西瓜育種材料鑒定、回交改良、基因聚合、輪回選擇和全基因組選擇是重要的研究、應用和發(fā)展方向。利用分子標記對西瓜種質資源或子代材料性狀進行提前鑒定，快速高效完成西瓜育種必要的前期工作；對分子標記輔助進行前景選擇和背景選擇，快速滲入性狀基因、改良西瓜親本材料；對西瓜多個抗病基因或優(yōu)質、有利性狀基因等標記選擇，輔助輪回選擇聚合有利基因或多基因聚合育種；隨著西瓜分子標記的增加和對全基因組的覆蓋，全基因組選擇育種將會大幅度提升西瓜育種的準確性和效率。加之現代育種技術的發(fā)展和應用，西瓜分子標記輔助育種也將融入基因編輯、合成生物、分子設計這個綜合育種體系之內，助力西瓜現代育種，攻克卡脖子技術，從而優(yōu)質、精確、簡單、高效地進行育種工作。