江蘇省麥田豬殃殃對(duì)苯磺隆的抗性水平及靶標(biāo)抗性機(jī)理研究

王紅春 陳俊敏 谷 濤 王 可 陶 園 婁遠(yuǎn)來(lái)

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇 南京 210014)

豬殃殃為一年生或越年生茜草科雜草，是江蘇、河南、山東、河北等地麥田主要的闊葉雜草[1-2]?；酋ｋ孱?lèi)乙酰乳酸合酶(acetyllactate synthase，ALS)抑制劑型除草劑苯磺隆是麥田防除闊葉雜草的主導(dǎo)除草劑品種，在我國(guó)已連續(xù)使用苯磺隆30年以上[3-5]。目前，我國(guó)河南[6-9]、山東[6]、江蘇[6-7,10]、安徽[6-7]等地均已發(fā)現(xiàn)抗苯磺隆的豬殃殃種群。2008年，彭學(xué)崗等[6]發(fā)現(xiàn)采自江蘇徐州的豬殃殃種群對(duì)苯磺隆存在一定的抗藥性。2016年，崔海蘭等[7]發(fā)現(xiàn)苯磺隆或雙氟磺草胺防效差的7個(gè)豬殃殃江蘇種群均對(duì)苯磺隆產(chǎn)生了抗藥性。2017年，王紅春等[10]發(fā)現(xiàn)采自江蘇省的20個(gè)豬殃殃種群中有12個(gè)種群對(duì)苯磺隆產(chǎn)生了明顯的抗藥性，10個(gè)種群對(duì)芐嘧磺隆有交互抗性，4個(gè)種群對(duì)二甲四氯鈉敏感性明顯下降，所有種群對(duì)氯氟吡氧乙酸和唑草酮敏感。近年來(lái)，豬殃殃在江蘇省麥田蔓延危害逐年加重的趨勢(shì)明顯，蔓延危害加重與其對(duì)主導(dǎo)除草劑的敏感性下降相關(guān)性及其具體原因仍有待系統(tǒng)研究，且缺乏針對(duì)性的豬殃殃治理措施。為此，本試驗(yàn)測(cè)定2020年采集于江蘇省不同地區(qū)小麥田的豬殃殃種群對(duì)苯磺隆、芐嘧磺隆及氯氟吡氧乙酸、2甲4氯鈉、唑草酮的敏感性，分析代表性種群ALS酶離體活性及其基因序列，旨在為制定江蘇省麥田豬殃殃精準(zhǔn)區(qū)域防控策略提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

2020年5月，于江蘇省不同地區(qū)小麥田隨機(jī)采集自然成熟的豬殃殃種子。田間采集時(shí)標(biāo)記采集地點(diǎn)，裝入牛皮紙袋，帶回江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所農(nóng)田草害防控實(shí)驗(yàn)室，自然晾干后置于種子儲(chǔ)存柜室溫儲(chǔ)藏。種群編號(hào)、采集地點(diǎn)等信息見(jiàn)表1。供試除草劑及其生產(chǎn)廠(chǎng)家如表2所示。

表1 豬殃殃種群采集地點(diǎn)信息Table 1 The collecting sites of Galium aparine seeds

表2 供試除草劑及其生產(chǎn)廠(chǎng)家Table 2 The herbicides and its production factories

苯磺隆劑量設(shè)計(jì)為11.25、22.5、45、90、180 g a.i.·hm-2。 其余除草劑處理劑量為其田間推薦有效成分用量的上限，即芐嘧磺隆75 g a.i.·hm-2、2甲4氯鈉 1 147.5 g a.i.·hm-2、 氯氟吡氧乙酸210 g a.i.·hm-2、唑草酮36 g a.i.·hm-2。2甲4氯鈉用蒸餾水溶解、稀釋?zhuān)虿萃眉妆饺芙猓交锹?、芐嘧磺隆和氯氟吡氧乙酸用丙酮溶解，用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的吐溫80水溶液稀釋。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)材料培養(yǎng) 供試土壤為馬肝土，pH值6.7，有機(jī)質(zhì)含量1.6%，風(fēng)干過(guò)篩后備用。將長(zhǎng)寬均為7 cm、高9 cm的白色塑料盆缽(底部具孔)裝約3/4的風(fēng)干細(xì)土，置于塑料周轉(zhuǎn)箱內(nèi)，底部加水使土壤水分飽和。分別播種經(jīng)4℃低溫蒸餾水浸泡7 d解除休眠的豬殃殃種子，每缽播種16粒種子，覆蓋約0.5 cm厚度的細(xì)土，置于日光溫室中培養(yǎng)(溫度：白天20±5℃/晚上15±5℃，光照周期約12 h/12 h)。待雜草出苗整齊后，定苗至10株/缽。

1.2.2 豬殃殃種群對(duì)苯磺隆及其他除草劑的敏感性水平測(cè)定 于雜草2～3輪葉期，按照藥劑設(shè)計(jì)劑量進(jìn)行噴霧處理。噴霧采用3WPSH-500 D型生測(cè)噴霧塔(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南京農(nóng)業(yè)機(jī)械化研究所)，圓盤(pán)直徑50 cm，主軸轉(zhuǎn)動(dòng)速度6 r·min-1，噴頭孔徑0.3 mm，噴霧壓力0.3 MPa，霧滴直徑100 μm，噴頭流量90 mL·min-1。 每個(gè)種群均設(shè)置不用藥的空白對(duì)照，每處理4次重復(fù)。用水量為450 L·hm-2。處理后21 d，測(cè)定豬殃殃植株地上部分鮮重，計(jì)算鮮重抑制率，DPS統(tǒng)計(jì)分析軟件通過(guò)線(xiàn)性回歸方程(y=a+bx)計(jì)算豬殃殃植株地上部分鮮重被抑制50%時(shí)的除草劑劑量(GR50值)。式中，y為概率單位，a為截距，b為回歸系數(shù)，x為以10為底的除草劑劑量對(duì)數(shù)值。相對(duì)抗性倍數(shù)(relative resistance index，RI)=抗性種群GR50/敏感種群GR50。

1.2.3 豬殃殃種群ALS離體活性測(cè)定 參考Ray[11]和鄧維[12]的方法，剪取2～3輪葉期的豬殃殃地上部分5 g，經(jīng)提取、純化、脫鹽后制備酶液，每處理重復(fù)3次。在1.5 mL離心管中加入不同濃度的苯磺隆溶液100 μL、酶液100 μL，渦旋混勻在37℃水浴鍋中暗反應(yīng)30 min后，加入20 μL 3 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)，并將離心管轉(zhuǎn)移到60℃水浴鍋中保溫15 min進(jìn)行脫羧，再依次加入190 μL 0.5%肌酸和190 μL 5% 1-萘酚，60℃水浴保溫15 min顯色，4 000 r·min-1離心3 min，取200 μL上清液加至96孔酶標(biāo)板中，測(cè)定530 nm處的吸光值。純化的乙偶姻經(jīng)梯度稀釋后，制作以乙偶姻各稀釋濃度為橫坐標(biāo)，OD530值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將最終測(cè)得的反應(yīng)液OD530值代入方程求出反應(yīng)液中乙偶姻含量。乙酰乳酸合酶對(duì)苯磺隆敏感性通過(guò)Sigmaplot 12.0軟件非線(xiàn)性回歸方程y=C+(D-C)/[1+(x/I50)b]計(jì)算ALS活性被抑制50%時(shí)的苯磺隆濃度(I50值)。式中，x表示除草劑的濃度，y表示每個(gè)處理的乙酰乳酸合酶催化活性，C代表最低值，D代表最大值，b表示在I50處的斜率。相對(duì)抗性系數(shù)(relative resistance index，RI)=抗性種群I50/敏感種群I50。

1.2.4 豬殃殃種群ALS基因突變分析 根據(jù)豬殃殃ALS基因序列(GU377313)設(shè)計(jì)引物(表3)，擴(kuò)增片段包含目前已報(bào)道所有抗性相關(guān)位點(diǎn)。參照1.2.1的方法和1.2.2的結(jié)果，剪取供試豬殃殃植株的單株葉片，利用TRIzol試劑[貨號(hào)10296010，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]提取總RNA，具體提取方法參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)；采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒[RR047A，寶生物工程 (大連) 有限公司生產(chǎn)]反轉(zhuǎn)錄cDNA，反轉(zhuǎn)錄方法參照試劑盒相關(guān)流程進(jìn)行。每種群各10株提取樣本，每個(gè)樣本挑取8個(gè)經(jīng)過(guò)PCR法確認(rèn)的陽(yáng)性克隆，交由上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序獲得的序列與擬南芥敏感生物型的ALS基因序列用DNAMAN軟件比對(duì)分析。

表3 引物序列Table 3 Primers and sequences for PCR amplification

2 結(jié)果與分析

2.1 豬殃殃種群對(duì)苯磺隆的抗性水平

28個(gè)豬殃殃種群中，23個(gè)種群對(duì)苯磺隆產(chǎn)生了2.18～17.10倍的相對(duì)抗性(表4)。將江蘇省的長(zhǎng)江以南地區(qū)定為蘇南地區(qū)，長(zhǎng)江至蘇北灌溉總渠地區(qū)為蘇中地區(qū)，蘇北灌溉總渠以北為蘇北地區(qū)。江蘇省不同地理種群的抗性分布結(jié)果表明，蘇南地區(qū)10個(gè)豬殃殃種群中有8個(gè)種群對(duì)豬殃殃產(chǎn)生了5.84～14.96倍抗性，抗性種群比例為80%；蘇中地區(qū)11個(gè)種群中有9個(gè)種群對(duì)苯磺隆產(chǎn)生了2.18～17.10倍抗性，抗性種群比例為82%；蘇北地區(qū)7個(gè)種群中有6個(gè)種群對(duì)苯磺隆產(chǎn)生了抗性，相對(duì)抗性倍數(shù)為2.48～7.10倍，抗性種群比例為86%。

表4 不同地區(qū)豬殃殃種群對(duì)苯磺隆的敏感性Table 4 The sensitivity of different populations of G. aparine to tribenuron-methyl

2.2 豬殃殃抗性種群的交互抗性和多抗性

經(jīng)磺酰脲類(lèi)ALS抑制劑型除草劑芐嘧磺隆 75 g a.i.·hm-2處理，WJQ-3、LYM-1、TXS-1、YC-1、YC-2、HA-5、DHX-1、DHX-2種群地上部分鮮重抑制率均在96%以上，JYS-1、JYS-2、JYS-3等18個(gè)種群的鮮重抑制率均低于80%(表5)。經(jīng)芐嘧磺隆75 g a.i.·hm-2處理，豬殃殃鮮重抑制率低于50%的13個(gè)種群中，蘇北地區(qū)種群有4個(gè)(占蘇北種群總數(shù)的57%)，蘇中地區(qū)有5個(gè)(占蘇中種群總數(shù)的45%)，蘇南地區(qū)有4個(gè)(占蘇南種群總數(shù)的40%)。

表5 不同除草劑處理后豬殃殃種群的地上部分鮮重抑制率Table 5 The fresh weight inhibition of different populations of G. aparine by different herbicides treatment /%

經(jīng)苯氧乙酸類(lèi)激素型除草劑2甲4氯鈉1 147.5 g a.i.·hm-2、 吡啶氧羧酸類(lèi)激素型除草劑氯氟吡氧乙酸210 g a.i.·hm-2、三唑啉酮類(lèi)原卟啉原氧化酶抑制劑類(lèi)除草劑唑草酮36 g a.i.·hm-2處理，采自江蘇省的28個(gè)豬殃殃種群的鮮重抑制率均高于97%。

2.3 豬殃殃抗性種群的ALS酶活性和基因突變分析

選取LHQ-2(相對(duì)抗性系數(shù)17.10)、JYS-1(相對(duì)抗性系數(shù)14.96)、WJQ-2(相對(duì)抗性系數(shù)10.39)、RGS-1(相對(duì)抗性系數(shù)8.82)、RGS-3(相對(duì)抗性系數(shù)5.00)、DHX-2(相對(duì)敏感種群，相對(duì)抗性系數(shù)1.00)為代表性種群，測(cè)定其ALS酶對(duì)苯磺隆的離體活性。苯磺隆對(duì)敏感種群DHX-2 ALS酶的I50值為0.033 3 μmol·L-1，相對(duì)抗性種群LHQ-2、JYS-1、WJQ-2、RGS-1、RGS-3的I50值分別為9.034 0、8.457 1、1.380 3、0.508 5、0.051 7 μmol·L-1。其中，LHQ-2、JYS-1的相對(duì)抗性倍數(shù)均高于250倍(表6)。

表6 不同豬殃殃種群ALS活性及苯磺隆的I50值Table 6 Determination of the ALS activity and I50 values inhibited by tribenuron-methyl of different populations of G. aparine

對(duì)比擬南芥基因序列及敏感豬殃殃種群的ALS基因序列，LHQ-2和JYS-1種群在第197位由脯氨酸(CCC)突變?yōu)樘K氨酸(ACC)，WJQ-2種群在第376位由天冬氨酸(GAT)突變?yōu)楦拾彼?GAA)，RGS-1種群在第574位由色氨酸(TGG)突變?yōu)榱涟彼?TTG)，而RGS-3、DHX-2種群未發(fā)現(xiàn)基因突變(表7)。

表7 不同豬殃殃種群ALS基因突變位點(diǎn)情況Table 7 The mutation sites of ALS gene in different populations of G. aparine

3 討論

近年來(lái)，我國(guó)多地麥田豬殃殃種群對(duì)ALS抑制劑類(lèi)除草劑苯磺隆產(chǎn)生了明顯的抗藥性。自2008年彭學(xué)崗等[6]發(fā)現(xiàn)采自江蘇徐州的豬殃殃種群對(duì)苯磺隆產(chǎn)生抗藥性以來(lái)，河南、安徽、山東、江蘇等省陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了抗苯磺隆的豬殃殃種群[7-9]。2016年采集于江蘇省的20個(gè)豬殃殃種群中有12個(gè)種群對(duì)苯磺隆具有抗藥性，10個(gè)種群對(duì)芐嘧磺隆有明顯的交互抗性，4個(gè)高抗種群對(duì)2甲4氯鈉敏感性下降，所有種群對(duì)氯氟吡氧乙酸和唑草酮敏感[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，2020年的28個(gè)豬殃殃種群中，23個(gè)種群對(duì)苯磺隆產(chǎn)生了2.18～17.10倍的抗性，18個(gè)種群對(duì)芐嘧磺隆的敏感性明顯下降，所有種群對(duì)2甲4氯鈉、氯氟吡氧乙酸、唑草酮均敏感。2016年江蘇省抗苯磺隆的豬殃殃比例為60%[10]，2020年抗性豬殃殃種群比例提高至85%，抗性比例增加了25個(gè)百分點(diǎn)，這可能與磺酰脲類(lèi)除草劑在麥田中持續(xù)高強(qiáng)度使用有關(guān)?？贡交锹〉呢i殃殃種群比例呈現(xiàn)從蘇南到蘇北逐漸增加的趨勢(shì)，可能由于蘇北地區(qū)使用苯磺隆和芐嘧磺隆的頻度高，而蘇南地區(qū)使用的頻度低有關(guān)，該趨勢(shì)與2016年的研究結(jié)果相似。

高新菊等[9]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)苯磺隆具有53.92倍及以上抗性倍數(shù)的河南省麥田豬殃殃種群ALS基因氨基酸發(fā)生了突變。本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)抗性倍數(shù)達(dá)到8倍以上的LHQ-2、JYS-1、WJQ-2和RGS-1豬殃殃種群的ALS氨基酸也發(fā)生了突變。其中，LHQ-2和JYS-1種群在第197位由脯氨酸突變?yōu)樘K氨酸，該突變與抗雙氟磺草胺的播娘蒿ALS突變情況相同[13-14]，而抗苯磺隆的牛繁縷、新疆白芥第197位由脯氨酸突變?yōu)楸彼醄4,15]、抗苯磺隆的播娘蒿和抗芐嘧磺隆的丁香蓼和異型莎草第197位由脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸[5,16-17]；WJQ-2種群在第376位由天冬氨酸(GAT)突變?yōu)楦拾彼?GAA)，與抗苯磺隆的新疆白芥和抗ALS抑制劑的野慈姑突變情況相同[15,18]。第574位色氨酸突變?yōu)榱涟彼釋?dǎo)致RGS-1種群產(chǎn)生了抗藥性，該突變與抗苯磺隆的光果豬殃殃希臘北部種群的突變情況相同[19]，且與抗雙氟磺草胺、苯磺隆的播娘蒿[5,13-14]及抗ALS抑制劑的麥家公[20]和蘿卜[21]、抗芐嘧磺隆的異型莎草[17]ALS突變情況也相同，而孫健等[22]發(fā)現(xiàn)山東濟(jì)寧市的豬殃殃種群第574位色氨酸突變?yōu)楦拾彼帷１狙芯堪l(fā)現(xiàn)，江蘇省麥田豬殃殃抗性種群ALS氨基酸有3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了突變，該發(fā)現(xiàn)與抗ALS抑制劑的新疆白芥[15]、播娘蒿[23]、長(zhǎng)芒莧[24]、皺果薺[25]、Persicariapensylvanica(L.) M. Gomez[26]相似，均在一種雜草中發(fā)現(xiàn)了多種抗性突變類(lèi)型。江蘇省發(fā)現(xiàn)ALS基因不同位點(diǎn)氨基酸發(fā)生突變的豬殃殃種群，給抗性豬殃殃的治理和預(yù)防提出了新的挑戰(zhàn)。

靶標(biāo)酶基因突變是雜草抗藥性產(chǎn)生的關(guān)鍵因素。交替使用作用機(jī)理不同的除草劑品種是延緩和治理雜草抗藥性的主要方法[27-30]。本研究發(fā)現(xiàn)江蘇省多地豬殃殃種群對(duì)磺酰脲類(lèi)ALS抑制劑型除草劑苯磺隆和芐嘧磺隆產(chǎn)生了明顯抗性，但所有種群對(duì)苯氧乙酸類(lèi)激素型除草劑2甲4氯鈉、吡啶氧羧酸類(lèi)激素型除草劑氯氟吡氧乙酸和三唑啉酮類(lèi)原卟啉原氧化酶抑制劑類(lèi)除草劑唑草酮敏感?；诒狙芯拷Y(jié)果，在防除江蘇省麥田豬殃殃時(shí)，應(yīng)盡量不用或少用苯磺隆和芐嘧磺隆，合理輪換使用2甲4氯鈉、氯氟吡氧乙酸或唑草酮，以便控制抗性豬殃殃種群的產(chǎn)生和蔓延。

4 結(jié)論

采集于江蘇省的28個(gè)豬殃殃種群中，23個(gè)種群對(duì)苯磺隆產(chǎn)生了2.18～17.10倍的抗性，18個(gè)種群對(duì)芐嘧磺隆的敏感性明顯下降，所有種群對(duì)2甲4氯鈉、氯氟吡氧乙酸、唑草酮敏感。LHQ-2、JYS-1、WJQ-2、RGS-1種群對(duì)苯磺隆的相對(duì)抗性達(dá)8倍以上，其ALS酶離體活性是敏感種群DHX-2的15倍以上，LHQ-2、JYS-1種群ALS酶第197位由脯氨酸突變?yōu)樘K氨酸，WJQ-2種群的ALS酶第376位由天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼?，RGS-1種群的ALS酶第574位由色氨酸突變?yōu)榱涟彼?。靶?biāo)酶活性提升和基因突變介導(dǎo)的靶標(biāo)抗性是豬殃殃抗苯磺隆的關(guān)鍵因素。