恩施大蒜根腐病病原菌尖孢鐮刀菌的生物學(xué)特性及室內(nèi)藥效試驗(yàn)

周潔，齊傳東，吳金平，符家平，肖穎，郭鳳領(lǐng)

1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，湖北 武漢 430064 2.蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064

大蒜(AlliumsativumL.)又名胡蒜、蒜頭，為百合科蔥屬植物，其鱗莖富含多糖、蛋白質(zhì)和維生素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及具獨(dú)特風(fēng)味的含硫化合物，具有抗菌、抗氧化、抗癌等多種功效[1]，被譽(yù)為“天然抗生素”。目前，我國(guó)是世界大蒜栽培面積最大和產(chǎn)量最高的國(guó)家之一[2]，是世界上的大蒜生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，同時(shí)大蒜也是我國(guó)重要的出口創(chuàng)匯蔬菜[3]。隨著大蒜產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，生產(chǎn)上各種病害的發(fā)生也日益顯現(xiàn)。汪甜等[4]研究發(fā)現(xiàn)山東大蒜主產(chǎn)區(qū)的根腐病致病菌主要類群為鐮刀屬和莖點(diǎn)霉屬；由白腐小核菌引起的大蒜白腐病在云南大理州大蒜種植區(qū)發(fā)生較為普遍[5]；鐘文文等[6]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌可導(dǎo)致山東蒼山大蒜貯藏期腐爛病害的發(fā)生；而茄匐柄霉則可引起湖北當(dāng)陽(yáng)大蒜白斑病的發(fā)生[7]。各種病害的發(fā)生嚴(yán)重影響了大蒜的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約了大蒜產(chǎn)業(yè)的綠色健康發(fā)展。

近年來(lái)，大蒜根腐病在我國(guó)頻繁發(fā)生，導(dǎo)致平均每年20%～30%的減產(chǎn)，逐漸成為大蒜主要病害之一?，F(xiàn)有研究表明，根腐病致病菌種類多樣，腐霉、鐮刀菌、細(xì)菌等均可導(dǎo)致大蒜根腐病的發(fā)生[8-10]。湖北恩施地區(qū)的大蒜根腐病病原菌經(jīng)鑒定為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)[11]，但至今未見該致病菌生物學(xué)特性及室內(nèi)藥效等相關(guān)方面的報(bào)道。為此，本研究對(duì)導(dǎo)致大蒜(AlliumsativumL.)根腐病的尖孢鐮刀菌進(jìn)行生物學(xué)特性測(cè)定及室內(nèi)藥劑篩選，以期為進(jìn)一步防控該病害提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大蒜根腐病病原菌尖孢鐮刀菌GRR-1(Fusariumoxysporum)(MW660368)由蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，于2021年6月取出活化。12種供試藥劑采購(gòu)于市場(chǎng)，詳情見表1。

表1 供試藥劑及使用濃度Table 1 Test drugs and use concentration

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌致死溫度的測(cè)定

參考郭強(qiáng)等[12]的方法略有改動(dòng)。用5mm打孔器于生長(zhǎng)3d的病原菌菌落邊緣打取菌塊放置于2mL離心管中，在不同溫度下水浴10min，轉(zhuǎn)接于PDA平板，連續(xù)3d觀察菌絲生長(zhǎng)情況。水浴溫度分別為35、40、45、50、55、60、65、70℃，每個(gè)處理重復(fù)3次。初步得到致死溫度范圍后以1℃溫差設(shè)置溫度梯度，確定菌絲致死溫度。

1.2.2 pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

用稀鹽酸和氫氧化鈉將PDA培養(yǎng)基pH分別調(diào)至5、6、7、8、9、10和11等7個(gè)梯度，用5mm打孔器于生長(zhǎng)3d的病原菌菌落邊緣打取菌塊放置于不同pH的PDA平板正中央，23℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，利用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，測(cè)量數(shù)據(jù)減去菌塊直徑即為菌絲生長(zhǎng)直徑。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3 氮源和碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

參照張凱東等[13]方法略有改動(dòng)。以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以0.2%的添加量分別添加甘氨酸、酵母、蛋白胨、磷酸氫二銨、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀、L-谷氨酸鈉等，配制8種不同氮源培養(yǎng)基；以3%的添加量分別添加D-果糖、α-乳糖、可溶性淀粉、甘露醇、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖等，配制7種不同碳源培養(yǎng)基。用5mm打孔器于生長(zhǎng)3d的病原菌菌落邊緣打取菌塊放置于不同培養(yǎng)基正中央，23℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，利用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，測(cè)量數(shù)據(jù)減去菌塊直徑即為菌絲生長(zhǎng)直徑。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.4 殺菌劑對(duì)病原菌抑制作用的測(cè)定

利用菌絲生長(zhǎng)速率法[14]測(cè)定供試藥劑對(duì)病原菌的抑制效果。試驗(yàn)所用藥劑及使用終濃度如表1所示。先按需配制各藥劑母液，按照各藥劑說(shuō)明書推薦濃度以一定比例加入55℃左右的PDA培養(yǎng)基中，使不同含藥培養(yǎng)基中藥劑終濃度達(dá)到推薦濃度，充分混勻后倒平板，制備成不同的含藥培養(yǎng)基。以不含藥的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。用5mm打孔器于生長(zhǎng)3d的病原菌菌落邊緣打取菌塊放置于不同培養(yǎng)基正中央，23℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，利用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，測(cè)量數(shù)據(jù)減去菌塊直徑即為菌絲生長(zhǎng)直徑。每個(gè)處理重復(fù)3次。各藥劑的抑菌率計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[14]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPPS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用單因素方差分析比較差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的致死溫度

將大蒜尖孢鐮刀菌菌塊在不同溫度下水浴10min后，觀察菌絲生長(zhǎng)情況。當(dāng)在溫度達(dá)到55℃時(shí)，菌塊恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度減慢；當(dāng)溫度達(dá)到60℃，菌塊仍可緩慢恢復(fù)生長(zhǎng)，但后期長(zhǎng)出的菌絲較為稀疏；當(dāng)溫度達(dá)到或高于65℃時(shí)，菌塊死亡，無(wú)新菌絲長(zhǎng)出，不能恢復(fù)生長(zhǎng)。隨后以60℃為起點(diǎn)溫度，1℃為溫差依次進(jìn)行61、62、63、64、65℃的處理，結(jié)果顯示3d后，經(jīng)63℃處理的菌塊菌絲已無(wú)法生長(zhǎng)。由此可見，大蒜根腐病病原菌的致死溫度為63℃。

2.2 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

不同pH培養(yǎng)基下病原菌菌絲的生長(zhǎng)情況如圖1所示，病原菌在pH為5～9時(shí)均生長(zhǎng)良好，其中pH為7時(shí)生長(zhǎng)速度最快。當(dāng)pH超過(guò)9時(shí)，病原菌生長(zhǎng)隨著pH的升高而顯著減緩。

注： 不同小寫字母表示在0.01水平差異顯著，圖2～3同。 圖1 不同pH PDA培養(yǎng)基下大蒜根腐病病原菌的菌落直徑 Fig.1 Colony diameter of pathogen of garlic rootrot under different pH PDA media

2.3 氮源和碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

不同氮源培養(yǎng)基下病原菌菌絲的生長(zhǎng)情況如圖2所示，可見病原菌在8種不同氮源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。其中以硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最慢，菌落平均直徑僅為1.42cm；以酵母和蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最快，菌落平均直徑均超過(guò)6cm，極顯著高于其他氮源培養(yǎng)基。病原菌對(duì)不同氮源的利用率由高到低的順序?yàn)榈鞍纂?、酵母、L-谷氨酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二銨、甘氨酸、硫酸銨、硝酸銨，其中對(duì)甘氨酸、磷酸氫二銨和硫酸銨的利用率差異不顯著。

圖2 不同氮源培養(yǎng)基下大蒜根腐病病原菌的菌落直徑 圖3 不同碳源培養(yǎng)基下大蒜根腐病病原菌的菌落直徑Fig.2 Colony diameter of pathogen of garlic root rot under different nitrogen source media Fig.3 Colony diameter of pathogen of garlic root rot under different carbon source media

不同碳源培養(yǎng)基下病原菌菌絲的生長(zhǎng)情況如圖3所示，可見病原菌在7種不同碳源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。其中以D-果糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最慢，菌落平均直徑僅為0.58cm；以乳糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最快，菌落平均直徑為2.60cm，極顯著高于其他含碳培養(yǎng)基。病原菌對(duì)不同碳源的利用率存在一定差異，由高到低的順序?yàn)槿樘?、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、葡萄糖、甘露醇、D-果糖，其中對(duì)葡萄糖和甘露醇的利用率差異不顯著。

2.4 不同殺菌劑對(duì)病原菌的抑制作用

不同殺菌劑對(duì)大蒜根腐病病原菌的抑制效果如表2所示，稀釋5000倍的75%肟菌戊唑醇水分散粒劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌效果最佳，抑菌率達(dá)到81.09%；稀釋1000倍的250g/L吡唑醚菌酯乳油、25%三唑酮可濕性粉劑和2億個(gè)/g木霉菌水分散粒劑對(duì)病原菌的抑制率均超過(guò)50%；其他供試藥劑對(duì)該病原菌的抑制效果較差，其中推薦濃度下的80%乙蒜素乳油、80%多菌靈可濕性粉劑、80%代森錳鋅可濕性粉劑和10%多抗霉素可濕性粉劑對(duì)該病原菌的抑菌率均不到10%，防治效果較差。

表2 不同殺菌劑對(duì)大蒜根腐病病原菌的抑制效果Table 2 Inhibitory effects of different fungicides on pathogen of garlic root rot

3 討論與結(jié)論

大蒜作為藥食同源食物之一，是餐桌菜肴中常見之物，因其具有廣譜殺菌作用，被稱為天然抗生素，此外還具有抗氧化、抗腫瘤、延緩衰老等多種功能，開發(fā)利用前景廣闊[15]。隨著大蒜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和經(jīng)濟(jì)效益的顯著提升，大蒜種植面積日益擴(kuò)大，種質(zhì)退化、連作和病害的發(fā)生已嚴(yán)重制約了大蒜產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

前人研究表明大蒜根腐病病原包括真菌性和細(xì)菌性病原菌，高園園等[16]研究發(fā)現(xiàn)山東省大蒜根腐病病原菌包括尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、芳香鐮刀菌和木賊鐮刀菌，其中尖孢鐮刀菌為其主要致病菌。本研究中恩施大蒜根腐病經(jīng)前期鑒定由尖孢鐮刀菌侵染所致，通過(guò)生物學(xué)測(cè)定發(fā)現(xiàn)該病原菌的致死溫度為63℃，最適生長(zhǎng)pH為7.0，最佳碳源為乳糖，供試碳源中對(duì)D-果糖的利用率最低，最佳氮源為酵母和蛋白胨。而煙草根腐病致病菌尖孢鐮刀菌的最適生長(zhǎng)pH為6.0～8.0，與本研究結(jié)果相似，但最適碳氮源分別為蔗糖和硝酸鉀[17]，與本研究結(jié)果存在一定差異；甘草根腐病致病菌的最適pH為7.0，最佳碳氮源分別為木糖醇和蛋白胨[18]，與本研究基本相似，僅碳源利用率存在差異。由此可見，不同寄主上的尖孢鐮刀菌的生物學(xué)特征存在一定差異，可能與尖孢鐮刀菌存在多種轉(zhuǎn)化型有關(guān)。此外，多種作物如豇豆[19]、黨參[20]和番茄[21]等的根腐病均由多種病原菌復(fù)合侵染所致，其中尖孢鐮刀菌為優(yōu)勢(shì)致病菌，后期可多點(diǎn)采集湖北地區(qū)大蒜根腐病樣進(jìn)一步分析鑒定，以明確是否存在復(fù)合侵染的情況。此外，12種供試藥劑中，75%肟菌戊唑醇對(duì)尖孢鐮刀菌的室內(nèi)防治效果達(dá)到81.09%，而多菌靈和代森錳鋅的防治效果較差，一方面可能與田間的用藥習(xí)慣有關(guān)，另一方面肟菌戊唑醇為三唑類和甲氧基丙烯酸酯類復(fù)配藥劑，而多菌靈和代森錳鋅分別為苯并咪唑類和硫代氨基甲酸酯類單一類型藥劑，長(zhǎng)期使用易導(dǎo)致病原菌抗藥性的產(chǎn)生。因此，建議在生產(chǎn)上使用不同類型的復(fù)配藥劑或者不同類型藥劑交替使用。

本研究探討了大蒜根腐病致病菌尖孢鐮刀菌的生物學(xué)特性，并比較了12種常用藥劑對(duì)該病原菌的室內(nèi)防治效果，接下來(lái)可結(jié)合前人相關(guān)研究結(jié)果，對(duì)湖北地區(qū)的大蒜根腐病病原進(jìn)一步分析鑒定，同時(shí)對(duì)潛力藥劑進(jìn)行田間防效測(cè)定，以期為大蒜根腐病的防控提供科學(xué)依據(jù)。