青稞酒糟中蛋白質(zhì)的提取工藝

樊世萌，劉浩，歐陽敬禹，2，劉戀，尤祥宇，2，蘇江濤，2，肖紅衛(wèi)

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，武漢 430068；2.襄陽湖北工業(yè)大學(xué)產(chǎn)業(yè)研究院，湖北 襄陽 441100；3.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物胚胎工程與分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072）

青稞是一種禾本科大麥屬的禾谷類作物，廣泛種植于中國青藏高原地區(qū)。青稞具有很高的淀粉含量，適用于釀酒，因此每年都會(huì)產(chǎn)生大量青稞酒糟。青稞酒糟中含蛋白質(zhì)、氨基酸等大量營養(yǎng)成分，可加以利用，避免資源浪費(fèi)［1］。目前對(duì)酒糟的利用主要是用作動(dòng)物飼料［2］、作物肥料［3-5］、提取有效成分［6］、栽培食用菌［7］等方面。青稞酒糟中的蛋白質(zhì)以醇溶蛋白所占比例最高。醇溶蛋白是谷物中的一種貯藏蛋白［8］，具有很好的耐水性、耐熱性，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、精細(xì)飼料等［9-11］領(lǐng)域。對(duì)青稞酒糟中蛋白質(zhì)的提取，有利于拓展青稞酒糟的應(yīng)用，提高其附加值。

目前，提取醇溶蛋白最有效的方法是醇?jí)A法，但是除了選取適合的溶劑外，浸提液醇?jí)A比、固液比、浸提時(shí)間和浸提溫度都會(huì)顯著影響提取效率。雖然關(guān)于酒糟中蛋白質(zhì)的提取已有報(bào)道，但是關(guān)于青稞酒糟中蛋白質(zhì)的提取工藝報(bào)道很少。近年來青稞酒糟的產(chǎn)量越來越大，因此探究青稞酒糟蛋白質(zhì)的最佳提取工藝，對(duì)綜合利用青稞酒糟具有十分重要的意義。本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取了浸提液醇?jí)A比、固液比、浸提時(shí)間和浸提溫度為影響因子，采用4因素3水平的正交試驗(yàn)，以蛋白質(zhì)提取率作為指標(biāo)，確定了青稞酒糟蛋白質(zhì)的最佳提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

材料與試劑：青稞酒糟，來源于湖北工業(yè)大學(xué)釀酒基地；氫氧化鈉、鹽酸、95%乙醇等均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水均為實(shí)驗(yàn)室自制去離子水配制。

儀器：FE20型pH計(jì)，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；H1850R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DYZ-20型低溫恒溫?fù)u床，常州市金壇博科實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；SKD-1000型全自動(dòng)凱氏定氮儀，上海沛歐分析儀器有限公司；101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；UPT-I-10T型超純水儀，四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理新鮮青稞酒糟在電熱鼓風(fēng)干燥箱中90℃烘干，粉碎，過40目篩，得到試驗(yàn)原料。

1.2.2 青稞酒糟中蛋白提取工藝步驟試驗(yàn)原料→95%乙醇和0.5 mol/L氫氧化鈉混合提取劑→攪拌浸提→7 000 r/min、4℃離心10 min→上清液→酸沉→冷凍離心→沉淀→干燥→粉碎→青稞酒糟蛋白粉。

1.2.3 青稞酒糟中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用凱式定氮法測(cè)定青稞酒糟中的蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 青稞酒糟中蛋白質(zhì)沉淀最適pH的測(cè)定利用蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)下溶液中溶解度最低的特點(diǎn)，測(cè)定青稞酒糟中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)即為青稞酒糟沉淀蛋白質(zhì)的最適pH。

稱取1 g試驗(yàn)原料，加入28 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉溶液和14 mL 95%乙醇，30℃下浸提90 min，控溫?fù)u床轉(zhuǎn)速設(shè)置為30 r/min，浸提結(jié)束后，離心分離取上清液備用，上清液平均分成10份（每份40 mL），分別用鹽酸調(diào)節(jié)浸提液pH至5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6，調(diào)酸后浸提液體積均略有增加，各取40 mL，7 000 r/min、4℃離心10 min后棄去上清液，將沉淀物置于90℃烘箱內(nèi)干燥4 h，稱重干燥物。按照上述條件重復(fù)3次，將干燥物重量與沉降pH關(guān)系繪制成曲線圖，干燥物重量最大時(shí)的沉降pH即為青稞酒糟沉淀蛋白質(zhì)的最適pH。

1.2.5 青稞酒糟中蛋白質(zhì)提取工藝優(yōu)化首先利用單因素試驗(yàn)對(duì)影響青稞酒糟蛋白質(zhì)提取率的固液比、浸提液醇?jí)A比、浸提時(shí)間、浸提溫度4個(gè)主要因素進(jìn)行考察分析，再進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.6 青稞酒糟蛋白質(zhì)提取率的計(jì)算蛋白質(zhì)純度指凱式定氮法測(cè)得的干燥物中蛋白質(zhì)含量占干燥物的百分比，蛋白質(zhì)提取率指凱式定氮法測(cè)得的干燥物中蛋白質(zhì)含量占投料的試驗(yàn)原料中蛋白質(zhì)理論含量的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 沉淀青稞酒糟蛋白質(zhì)的最適pH

經(jīng)過凱式定氮法測(cè)定，干燥的青稞酒糟中蛋白質(zhì)含量占比19.1%，蛋白質(zhì)含量比例很高，說明青稞酒糟具有很大的利用潛力。通過查閱文獻(xiàn)了解到，沉降酒糟蛋白質(zhì)的最適pH大多數(shù)在4.5?5.5，因此本試驗(yàn)設(shè)置pH梯度為4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5。圖1為在不同沉降pH下得到干燥物的量，由圖1可知，青稞酒糟沉淀蛋白質(zhì)pH為4.9時(shí)，干燥物質(zhì)量最大。因此，在后續(xù)的單因素試驗(yàn)中，沉淀青稞酒糟蛋白質(zhì)的pH設(shè)置為4.9。

圖1 青稞酒糟蛋白質(zhì)最佳沉淀pH的確定

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 固液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響稱取青稞酒糟原料7份，每份1 g，置于標(biāo)號(hào)1—7的錐形燒杯中，分 別 按 照 固 液 比1∶20、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶60，加入浸提液（95%乙醇∶0.5 mol/L氫氧化鈉溶液=1∶2），在30℃下浸提90 min，探討固液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。由圖2可知，青稞酒糟蛋白質(zhì)提取量隨著浸提液體積的增大而增加，當(dāng)固液比為1∶45時(shí)，蛋白質(zhì)提取率最高，為46.93%；但是當(dāng)繼續(xù)增加浸提液體積，蛋白質(zhì)提取率不升反降。說明過量的浸提液反而會(huì)影響后續(xù)蛋白質(zhì)的沉淀，導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率下降。因此使用醇?jí)A法提取青稞酒糟蛋白時(shí)，最佳固液比為1∶45。

圖2 固液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.2.2 浸提液醇?jí)A比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響將浸提液醇?jí)A比（95%乙醇∶0.5 mol/L氫氧化鈉溶液）分別設(shè)置為1∶1、2∶3、1∶2、1∶3、1∶4；稱取青稞酒糟原料5份，每份1 g，置于標(biāo)號(hào)1—5的錐形燒杯中，各加入45 mL上述浸提液，30℃下浸提90 min，探討浸提液醇?jí)A比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。由圖3可知，青稞酒糟蛋白質(zhì)提取率隨著浸提液中堿液比例的增加而增加，當(dāng)醇?jí)A比為1∶3時(shí)，蛋白質(zhì)提取率最大，為49.82%；但是當(dāng)繼續(xù)增加浸提液中堿液比例，蛋白質(zhì)提取率降低?？赡艿脑蚴牵m然進(jìn)一步增加浸提液中堿液比例，可使析出物增加，但是析出物顏色加深，說明析出物中不僅含有蛋白質(zhì)，還可能含有纖維素等成分，對(duì)蛋白質(zhì)的純度產(chǎn)生了影響，降低了蛋白質(zhì)的提取率。因此使用醇?jí)A法提取青稞酒糟蛋白質(zhì)時(shí)，提取液最佳醇?jí)A比為1∶3。

圖3 浸提液醇?jí)A比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.2.3 浸提溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響稱取青稞酒糟原料4份，每份1 g，置于標(biāo)號(hào)1—4的錐形燒杯中，在固液比1∶45，醇?jí)A比1∶2，浸提時(shí)間90 min的條件下，浸提溫度分別設(shè)置為4、30、37、45℃，探討浸提溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。由圖4可知，浸提溫度為30℃時(shí)的蛋白質(zhì)提取率顯著高于浸提溫度為4℃時(shí)的蛋白質(zhì)提取率；而當(dāng)浸提溫度超過30℃，蛋白質(zhì)提取率并沒有顯著的增加。分析原因可能是，隨著溫度的提升，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，更容易從試驗(yàn)原料中析出；但是溫度過高也可能導(dǎo)致其他雜質(zhì)的析出增加，還可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，影響蛋白質(zhì)的純度；同時(shí)過高的溫度會(huì)增加能耗成本。因此在提取工藝中，最佳的浸提溫度為30℃。

圖4 浸提溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.2.4 浸提時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響稱取青稞酒糟原料5份，每份1 g，置于標(biāo)號(hào)1—5的錐形燒杯中，在料液比1∶45，醇?jí)A比1∶2，浸提溫度30℃的條件下，浸提時(shí)間分別設(shè)置為30、60、90、120、180 min，探討浸提時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。由圖5可知，隨著浸提時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)提取率逐步提高，當(dāng)浸提時(shí)間為90 min時(shí)，提取率最大，為46.85%；但是進(jìn)一步延長浸提時(shí)間，提取率下降。分析其原因可能是，浸提時(shí)間過短，蛋白質(zhì)析出不充分；而浸提時(shí)間過長可使部分蛋白質(zhì)發(fā)生變性后的絮凝作用，導(dǎo)致提取率下降。因此，在提取工藝中，最佳浸提時(shí)間為90 min。

圖5 浸提時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.3 正交試驗(yàn)

在4個(gè)單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，具體的正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 青稞酒糟蛋白質(zhì)提取的正交試驗(yàn)因素與水平

由表2可知，各因素對(duì)青稞酒糟蛋白質(zhì)提取率的影響強(qiáng)弱為固液比＞醇?jí)A比＞浸提溫度＞浸提時(shí)間。以青稞酒糟蛋白質(zhì)的提取率為主要的參考指標(biāo)進(jìn)行極差分析后，確定理論最優(yōu)組合為A2B1C3D2，但考慮到實(shí)際生產(chǎn)條件與經(jīng)濟(jì)成本，確定實(shí)際最優(yōu)組合為A2B1C2D3。因此，青稞酒糟的最佳提取條件為固液比1∶45，醇?jí)A比1∶3，浸提溫度30℃，浸提時(shí)間90 min，青稞酒糟蛋白質(zhì)提取率為50.24%，干燥物中蛋白質(zhì)純度為29.4%。

表2 青稞酒糟蛋白質(zhì)提取的正交試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)

本試驗(yàn)采用醇?jí)A溶解、酸沉的提取工藝對(duì)青稞酒糟蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，所得到的青稞酒糟干燥物磨成粉后，顏色為淺黃色，粉末顆粒均勻，影響青稞酒糟蛋白質(zhì)提取率的因素順序?yàn)楣桃罕龋敬級(jí)A比＞浸提溫度＞浸提時(shí)間，最佳提取條件為固液比1∶45，醇?jí)A比1∶3，浸提溫度30℃，浸提時(shí)間90 min，所得青稞酒糟蛋白質(zhì)提取率為50.24%，干燥物中蛋白質(zhì)純度為29.4%。本試驗(yàn)驗(yàn)證了使用醇?jí)A法提取青稞酒糟蛋白質(zhì)的可行性，蛋白質(zhì)提取率較高，雖純度有待進(jìn)一步提升，但提取條件溫和、簡(jiǎn)易，為在工業(yè)上大規(guī)模提取青稞酒糟的蛋白質(zhì)提供了參考，對(duì)青稞酒糟的綜合利用具有一定參考意義。