蘋果短鏈脫氫酶基因MdSDR響應(yīng)腐爛病菌侵染的功能研究

王帥樂 肖珂雨 王維東 黃麗麗

(西北農(nóng)林科技大學旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室/植物保護學院, 陜西 楊凌 712100)

短鏈脫氫/還原酶(short-chain dehydrogenases/reductase, SDR)是一類NAD(P)(H)依賴的氧化還原酶，負責催化生物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)[1-3]。SDR在高等植物中分布廣泛[4]，主要參與生物堿、萜類、酚類物質(zhì)和激素等多種次級代謝途徑，增強了植物對細菌、真菌、病毒、動物和昆蟲等生物脅迫以及非生物脅迫的適應(yīng)能力，并且在植物傳粉、種子傳播和種間競爭中發(fā)揮重要作用[1,5-8]。同時，SDR也參與多種初級代謝，維持植物正常的生長發(fā)育。例如，在葉綠素的合成途徑中，SDR家族的原葉綠體氧化還原酶(protochloropyllide oxidoreductase, POR)能將原葉綠素轉(zhuǎn)化為葉綠素[9-10]；在脂肪酸合成途徑中，SDR家族的β-酮脂酰-ACP還原酶(β-ketoacyl-ACP reductase, KAR)和烯脂酰-ACP還原酶(enoyl-ACP reductase, ENR)能催化還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)依賴的兩個還原步驟，是植物脂肪酸生物合成的兩種關(guān)鍵酶[11-12]。

脂肪酸是細胞膜、栓質(zhì)和角質(zhì)蠟的關(guān)鍵成分，為植物抵御環(huán)境脅迫提供了物理屏障[13-14]。植物能通過改變不飽和脂肪酸的含量來調(diào)節(jié)膜的流動性，從而維持適合關(guān)鍵整合蛋白(integral protein)發(fā)揮功能的環(huán)境[15-16]。例如，在高溫脅迫環(huán)境下，野生型煙草葉綠體中的光合蛋白出現(xiàn)熱變性和光合效率下降。而三元脂肪酸(trienoic fatty acids，TAs)表達被抑制的轉(zhuǎn)基因植株中，未檢測到光合蛋白熱變性，其光合效率降幅較小[17]。另外，脂肪酸也參與病原脅迫響應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，游離亞麻酸既是一種脅迫信號分子，也是植物氧化脂質(zhì)(如茉莉酸)生物合成的前體[18-19]。許多研究也證明，葉綠體油酸(oleic acid, OA)和壬二酸(azelaic acid, AZA)水平對擬南芥的生物脅迫響應(yīng)至關(guān)重要，可以引發(fā)細胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)和激發(fā)系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)[20-21]。另外，植物葉片中脂肪酸的積累能刺激植物脂滴(lipid droplets，LDs)的產(chǎn)生。而脂滴在植物脅迫應(yīng)答、激素信號途徑和植物生長發(fā)育中起重要作用[22-23]。例如，脂滴表面的油體鈣蛋白caleosin和油體固醇蛋白steroleosin等蛋白具有酶活性，其中caleosin具有過氧化酶活性，可以將α-亞麻酸衍生物轉(zhuǎn)化為各種氧化脂類植保素；steroleosin是一種甾醇脫氫酶，可以將甾醇底物轉(zhuǎn)化為油菜素類固醇(brassinosteroids，BRs)，從而調(diào)控生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)[24-25]。上述研究結(jié)果均表明，脂肪酸在植物抵抗生物脅迫中發(fā)揮著重要的作用。

在蘋果(Malusdomestica)中，目前關(guān)于SDR基因功能的研究仍鮮有報道。西北農(nóng)林科技大學果樹病害病原生物學及綜合防治團隊前期以富士蘋果cDNA為模板克隆獲得MdSDR基因編碼區(qū)(coding sequence，CDS)全長序列，并通過預測發(fā)現(xiàn)其可能與脂肪酸的合成有關(guān)[26]。為了驗證MdSDR蛋白是否參與脂肪酸的合成和調(diào)控植物免疫，本研究通過農(nóng)桿菌介導的瞬時表達技術(shù)及實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)技術(shù)探究蘋果MdSDR對脂肪酸合成中關(guān)鍵基因表達的影響，揭示MdSDR在脂肪酸合成中的重要作用，并利用蘋果瞬時表達技術(shù)探究MdSDR對蘋果樹腐爛病菌侵染的影響，初步研究其抗逆功能和作用機理，旨在為蘋果抗性品種的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

嘎啦蘋果組培苗(Malusdomesticcv.Royal gala)由西北農(nóng)林科技大學園藝學院李明軍教授實驗室惠贈。組織培養(yǎng)植株生長于MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為：4.43 g·L-1MS+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂+0.3 mg·L-16-芐氨基嘌呤+0.2 mg·L-1吲哚-3-乙酸，pH值為5.8；組培苗置于人工智能氣候箱(RXZ-500-D-PED，寧波江南儀器廠)內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度 25℃，光照16 h/黑暗8 h，光照度6 400 Lx，相對濕度60%。每15 d更換一次培養(yǎng)基。

1.2 菌株和質(zhì)粒載體

大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV3101及載體pCAMBIA1302均購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；蘋果腐爛病菌03-8(Valsamali)保存于西北農(nóng)林科技大學。

1.3 植物表達載體的構(gòu)建

以富士蘋果mRNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，利用特異性引物MdSDR-F、MdSDR-R對MdSDR基因進行PCR擴增，采用快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒II(DP1722，Bioteke，北京)對目的基因條帶進行回收。將回收產(chǎn)物與線性化載體pCAMBIA1302連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAMBIA1302-MdSDR。熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，進行卡那霉素抗性篩選及菌落PCR驗證后提取質(zhì)粒送至上海生工生物工程股份有限公司測序。將測序重組質(zhì)粒及空載體(對照)分別電擊轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101，卡那霉素抗性篩選及菌落PCR驗證后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 農(nóng)桿菌介導的蘋果組培苗瞬時轉(zhuǎn)化

用含50 μg·mL-1卡那霉素及50 μg·mL-1利福平的YEP培養(yǎng)基，以28℃、200 r·min-1的條件培養(yǎng)含有pCAMBIA1302-MdSDR和pCAMBIA1302表達載體的農(nóng)桿菌16 h，6 000 r·min-1離心10 min收集菌體，用0.01 mol·L-1的MgCl2溶液清洗2次，最終用含100 μmol·L-1乙酰丁香酮及10 μmol·L-12-嗎啉乙磺酸(4-morpholineethanesulfonic acid，MES)的MgCl2溶液重懸菌體，使其OD600值為1。挑選健康、長勢相近的4周齡組培苗若干，使用真空滲透的方法[26]對其進行瞬時轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的組培苗培養(yǎng)條件與1.1中的組培條件相同。

1.5 蘋果總RNA提取及cDNA的合成

組培苗瞬時表達48 h后隨機選取葉片樣品進行蘋果總RNA的提取，提取方法參照快速通用植物RNA提取試劑盒說明書(0416-50gk，北京華越洋生物有限公司)，提取完成后對其濃度進行測定，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。cDNA的合成參照High Capacity cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(4368813，Thermo Fisher scientific，美國)進行，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 實時熒光定量PCR分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中找到MdβCT、MdACCase、MdKAR、MdKASⅠ、MdKASⅡ、MdHAD、MdENR等與蘋果脂肪酸合成相關(guān)的基因序列以及與植物脂滴調(diào)控相關(guān)基因MdSEIPIN[27-28]，并以MdEF-1α為內(nèi)參基因[29]。使用Primier 5軟件對上述基因進行引物設(shè)計(表1)。

表1 引物序列

利用PCR技術(shù)檢測上述引物的特異性，PCR反應(yīng)體系為20 μL：10 μL 2×Taq MasterMix、上下游引物各0.5 μL、1 μL cDNA、8 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)。

基因相對表達水平測定：按照2×SYBR?Green PCR Master Mix(A311-10，北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司)說明書配制qRT-PCR反應(yīng)體系，每個樣品設(shè)3個重復。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL：10 μL 2×RealStar Green Power Mixture、10 μmol·L-1正反向引物各0.5 μL、1.5 μL cDNA、7.5 μL ddH2O。使用羅氏LightCycler96實時熒光定量PCR儀，反應(yīng)程序：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，45個循環(huán)；熔解反應(yīng)程序為：95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s。

1.7 真菌活化與侵染試驗

將蘋果腐爛病菌(V.mali)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基上活化，于25℃條件下培養(yǎng)3 d。組培苗瞬時轉(zhuǎn)化48 h后取葉片刺傷接種V.mali。將葉柄插入水瓊脂中保濕，25℃共培養(yǎng)36 h左右，拍照并用Image J軟件計算病斑直徑，重復3次。使用GraphPad Prism 9作圖并用SPSS 26.0進行t測驗分析。為了減少試驗誤差，每次重復使用至少30個葉片，取自長勢相似的組培苗。

1.8 蘋果葉片脂肪酸含量的測定

組培苗瞬時表達48 h后取葉片樣品，液氮速凍后用干冰保存運輸，送至西安邁維代謝生物科技有限公司進行脂肪酸含量及種類的測定。處理組與對照組各做3次重復，使用GraphPad Prism 9作圖并用SPSS 26.0進行t測驗分析。

1.9 蘋果葉片中脂滴的染色觀察

尼羅紅(HY-D0718，MedChemExpress, 美國)在緩沖液中稀釋至200 mmol·L-1，pH值為7。將組培苗瞬時表達48 h后取葉片樣品，在尼羅紅染液中37℃避光孵育5～10 min，洗去染色液后制片。用FV3000激光共聚焦掃描顯微鏡(奧林巴斯，日本)觀察，由488 nm激發(fā)，在500～540 nm光譜下收集信號。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果葉片抗病性檢測

為了探究MdSDR蛋白在植物抗生物脅迫中的作用，在蘋果組培苗葉片中瞬時表達MdSDR基因后接種V.mali，檢測病斑變化情況。結(jié)果顯示，過表達MdSDR的蘋果葉片的病斑明顯小于對照(圖1-A)。平均病斑直徑統(tǒng)計結(jié)果顯示，過表達MdSDR的蘋果葉片的病斑直徑顯著小于(P<0.001)對照(約14.46%)(圖1-B)，表明過表達MdSDR提高了蘋果葉片對V.mali的抗病性。

注：A：V. mail.侵染蘋果葉片36 h后的葉片表型；B：V. mail.侵染蘋果葉片36 h后的平均病斑直徑。***表示在P<0.001水平差異顯著。

2.2 脂肪酸合成相關(guān)關(guān)鍵基因的表達水平檢測

為了探究MdSDR對植物脂肪酸合成的影響，對脂肪酸合成通路關(guān)鍵酶編碼基因的表達水平進行了檢測。與對照相比，瞬時過表達MdSDR蘋果葉片中脂肪酸從頭合成通路中的相關(guān)基因全部顯著上調(diào)表達，其中MdACCase、MdKAR和MdENR上調(diào)幅度較大，MdACCase上調(diào)48.41倍，MdKAR上調(diào)129.79倍，MdENR上調(diào)168.20倍。MdβCT、MdKASⅠ、MdKASⅡ和MdHAD均呈現(xiàn)出上調(diào)表達的趨勢，其中MdβCT、MdKASⅠ和MdKASⅡ均上調(diào)約5倍，MdHAD上調(diào)8.67倍(圖2)。上述結(jié)果表明，MdSDR蛋白參與調(diào)控脂肪酸的生物合成。

注：***表示在P<0.001水平差異顯著；****表示在P<0.000 1水平差異顯著。

2.3 蘋果葉片脂肪酸含量測定

為了探究過表達MdSDR對植物葉片中脂肪酸積累水平的影響，對蘋果葉片中的脂肪酸含量進行了測定。通過對試驗組與對照組數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，發(fā)現(xiàn)過表達MdSDR的蘋果葉片中各種脂肪酸含量未發(fā)生顯著變化(P>0.05)(圖3)。

圖3 脂肪酸相對含量

2.4 脂滴合成關(guān)鍵基因的表達水平檢測

為了驗證上述推測，過表達MdSDR后檢測了調(diào)控脂滴形成的關(guān)鍵基因MdSEIPIN的表達水平變化。結(jié)果顯示，瞬時表達MdSDR后，蘋果葉片中MdSEIPIN基因的表達水平顯著提高(圖4-A)(P<0.05)，表明瞬時表達MdSDR促進了脂滴的生物合成。Western Blot結(jié)果顯示，在瞬時表達MdSDR基因的蘋果組培苗葉片中檢測到MdSDR蛋白(圖4-B)，表明通過農(nóng)桿菌介導瞬時表達技術(shù)，MdSDR蛋白在蘋果組培苗葉片中成功表達。

注：A：MdSEIPIN相對表達水平；B：MdSDR蛋白表達檢測。*表示在P<0.05水平差異顯著。

2.5 蘋果葉片中脂滴的染色觀察

本研究采用尼羅紅染色[30]觀察瞬時表達MdSDR的蘋果葉片樣品，結(jié)果顯示，瞬時表達MdSDR后的蘋果葉片出現(xiàn)大量的點狀綠色熒光(圖5-A)，而在對照中并未發(fā)現(xiàn)有大量的點狀綠色熒光(圖5-B)。本試驗過表達的MdSDR蛋白上融合有GFP標簽，因此為了排除GFP熒光給試驗帶來的干擾，單獨表達了MdSDR-GFP和GFP，觀察并未發(fā)現(xiàn)點狀綠色熒光(圖5-C、D)。綜上所述，瞬時表達MdSDR促進了脂滴的形成。

注：脂滴被尼羅紅染色后激發(fā)出的熒光呈點分布。A：瞬時表達MdSDR-GFP后用尼羅紅染色的蘋果葉片；B：瞬時表達GFP后用尼羅紅染色的蘋果葉片；C：瞬時表達MdSDR-GFP后未染色的蘋 果葉片；D：瞬時表達GFP后未染色的蘋果葉片。

3 討論

短鏈脫氫/還原酶不僅可以參與調(diào)控植物初級代謝，如脂肪酸生物合成、葉綠素生物合成或降解，還可以參與調(diào)控植物的次級代謝，如萜類、類固醇、酚類和生物堿的生物合成[31]。在脂肪酸生物合成的過程中，乙酰CoA的羧化反應(yīng)是脂肪酸合成通路的限速步驟，故乙酰CoA羧化酶(acetyl CoA carboxylase, ACCase)活性控制著脂肪酸的合成速度；在脂肪酸鏈延伸階段中，β-酮脂酰-ACP合酶(β-ketoacyl-ACP synthaseⅡ, KAS)能催化第一步的縮合反應(yīng)；同時，β-酮脂酰-ACP還原酶(β-ketoacyl-ACP reductase, KAR)和烯脂酰-ACP還原酶(enoyl-ACP reductase, ENR)負責催化其中兩步還原反應(yīng)，即在還原型輔酶II NADPH的協(xié)助下，KAR催化β-酮丁?；摩?位羰基還原為羥基，ENR催化△2-烯丁?；摩?雙鍵還原為單鍵；而β-羥脂酰-ACP脫水酶(β-hydrdoxyacyl-ACP dehydrase, HAD)則負責催化β-羥丁?；?、β-碳原子間的脫水反應(yīng)[32]。本研究發(fā)現(xiàn)瞬時過表達MdSDR后，蘋果中乙酰CoA羧化酶(MdACCase)基因、β-酮脂酰-ACP合酶(MdKAS)基因、β-酮脂酰-ACP還原酶(MdKAR)基因、烯脂酰-ACP還原酶(MdENR)基因的表達水平顯著上調(diào)(圖2)。上述結(jié)果表明，MdSDR能參與調(diào)控植物脂肪酸的生物合成過程，這與本實驗室前期預測的結(jié)果[26]一致。

已有研究表明脂肪酸能參與調(diào)控植物的免疫反應(yīng)[1,21]。例如茄子中棕櫚油酸的積累提高了植物對白粉病菌的抗病性[33]；番茄中棕櫚油酸的積累增加了植物對黃萎病菌的抗病性[34]；亞油酸和亞麻酸的積累會顯著提升鱷梨對炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)和番茄對丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的抗病性[35-36]；根際微生物誘導植物對灰霉病菌(Botrytiscinerea)的抗病性同樣與植物中亞油酸和亞麻酸積累水平密切相關(guān)[37]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達MdSDR能夠提高蘋果對腐爛病菌的抗性(圖1)，然而蘋果葉片中脂肪酸含量無顯著變化(圖3)(P>0.05)。因此推測MdSDR參與調(diào)控脂肪酸的生物合成，但并未通過增加脂肪酸含量來提高蘋果抗性。

脂肪酸作為初級代謝產(chǎn)物，是生物體內(nèi)多種中性脂質(zhì)生物合成的前體。然而過高水平的脂肪酸會對細胞造成損傷[38]。因此生物體會通過多種途徑將脂肪酸轉(zhuǎn)化成中性脂質(zhì)，例如脂肪酸能夠通過多步反應(yīng)，最終在SEIPIN蛋白調(diào)控下形成了成熟的脂滴[28,30]，保持了細胞內(nèi)的脂肪酸水平的穩(wěn)態(tài)[22,39]。

脂滴是由富含膜蛋白的單層磷脂分子層包裹中性脂類物質(zhì)組成的細胞器[40]。脂滴一般存在于種子等植物的營養(yǎng)儲存器官中，為植物提供能量和參與植物生長發(fā)育調(diào)控。葉片等光合組織中脂滴的數(shù)量通常遠小于種子和花，但葉片脂滴能參與調(diào)控植物的非生物和生物脅迫響應(yīng)[23,39]。例如，脂滴相關(guān)蛋白(LD-associated protein，LDAP)能調(diào)控植物脂滴的產(chǎn)生。對擬南芥ldap1/ldap3雙敲除突變體的研究發(fā)現(xiàn)，突變體植物比野生型更容易受到干旱脅迫的影響[41]。而過表達ldap基因的擬南芥顯著提高了對干旱脅迫的抗性，這說明脂滴參與調(diào)控植物的干旱脅迫響應(yīng)；另外兩種脂滴表面的雙加氧酶(dioxygenase)和caleosin能將α-亞麻酸轉(zhuǎn)化為氧化脂類(oxylipin)植保素，從而作為一種信號分子觸發(fā)植物的超敏反應(yīng)(hypersensitive response, HR)[21，25]。這些研究均表明脂滴參與植物的非生物和生物脅迫響應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)過表達MdSDR促進了脂滴的產(chǎn)生(圖4、5)，同時也提高了蘋果對病原菌的抗性(圖1)。因此推測MdSDR蛋白通過調(diào)控脂肪酸的生物合成間接提高了脂滴的積累水平，從而提高了蘋果對腐爛病菌的抗性，但脂滴提高蘋果抗病性的具體調(diào)控機制還有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究利用農(nóng)桿菌介導的瞬時轉(zhuǎn)化體系在蘋果組培苗中過表達MdSDR，檢測到蘋果葉片中脂滴數(shù)量增加，并且對V.mali的抗性顯著提高。初步證明MdSDR可以通過促進脂肪酸的生物合成，間接提高葉片脂滴的水平，從而增加植物的抗病性。該研究為理解植物抵抗病原脅迫的途徑提供了新思路。