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    亞甲藍(lán)對兔心臟驟停后腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用研究

    2022-10-28 06:09:12蘇成洋任亮亮梁志娟司江華
    關(guān)鍵詞:小劑量存活率腦缺血

    蘇成洋,任亮亮,梁志娟,司江華,于 澄

    蘭州市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,甘肅 蘭州 730050

    心臟驟停引起大腦缺血缺氧性損傷。自主循環(huán)恢復(fù)(return of spontaneous circulation,+ROSC)過程中,血流和氧供的恢復(fù)引起大腦再灌注損傷。因此,心臟驟停后,腦損傷本質(zhì)為缺血再灌注損傷。目前,心臟驟停后腦保護(hù)公認(rèn)的有效治療方法有目標(biāo)溫度管理與高壓氧,但并未顯著改善+ROSC 患者存活率和預(yù)后[1-2]。有研究報道,亞甲藍(lán)(methylene blue,MB)在許多神經(jīng)疾病中表現(xiàn)出治療潛力,其神經(jīng)保護(hù)作用已經(jīng)在阿爾茨海默病、帕金森病、中風(fēng)以及視神經(jīng)病變的體內(nèi)模型中得到證實[3-6]。低劑量MB具有較好的安全性,且具有抗氧化性,可迅速穿過血腦屏障,對腦部神經(jīng)元細(xì)胞有一定保護(hù)作用[7-8]。目前,MB 對心臟驟停后全腦缺血再灌注損傷作用的相關(guān)研究較少。本研究旨在探討MB 對心臟驟停后兔腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,以期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)?,F(xiàn)報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 健康清潔級家兔50 只,雌雄不限,體質(zhì)量(2.5±0.5)kg(由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供),按隨機(jī)數(shù)字表法將家兔在麻醉置管前分為5 組,假手術(shù)組、空白對照組、小劑量MB 組(1.0 mg/kg)、中劑量MB 組(5.0 mg/kg)及高劑量MB 組(10.0 mg/kg),每組10 只。

    1.2 藥物與儀器 MB 注射液(濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司,批號:1711012);鹽酸腎上腺素注射液、肝素注射液及鹽酸利多卡因(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)Ⅰ科提供);25%烏拉坦(蘭州大學(xué)中心實驗室提供);4%多聚甲醛溶液(雷根生物技術(shù)有限公司,批號:DF0135);兔神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、S-100β蛋白、半胱天冬酶-3(Caspase-3)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司);醫(yī)用分子篩制氧機(jī)(ZH-A31W,江蘇江航醫(yī)療設(shè)備有限公司);全波長酶標(biāo)儀/超微(Epoch,Biotek Instruments,美國伯騰儀器有限公司);小動物呼吸機(jī)(HX-100E,成都泰盟科技有限公司);BL-420E 多導(dǎo)聯(lián)生物功能實驗記錄儀(BL-420E,成都泰盟科技有限公司);心電監(jiān)護(hù)除顫儀(TEC-7621C,日本光電公司);高速臺式冷凍離心機(jī)(TGL-16G,上海安亭科學(xué)儀器廠);交流電電壓轉(zhuǎn)換器(上海變壓器廠)。

    1.3 動物模型制備及處理 術(shù)前12 h 禁食、不禁水,兔耳緣靜脈注射25% 烏拉坦麻醉,劑量為4 ml/kg。仰臥固定,無菌操作下行氣管插管,自由呼吸室內(nèi)空氣;分離右頸總動脈,緩慢插入動脈導(dǎo)管用以測定平均動脈壓(mean artery pressure,MAP)并采取血液標(biāo)本。假手術(shù)組不建立心肺復(fù)蘇(cardiopulmonary resuscitation,CPR)模型,僅行麻醉、氣管插管和頸動脈置管。其他4 組采用體外電擊誘發(fā)室顫模型,50 V 交流電持續(xù)放電50~80 s,監(jiān)護(hù)儀顯示出現(xiàn)心室顫動波形及MAP <20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)并持續(xù)3 min,提示心臟驟停模型制備成功。模型制備成功后立即行CPR,胸外按壓(按壓頻率200 次/min,按壓深度為兔胸廓前后徑1/3)與機(jī)械通氣[吸入空氣中氧氣濃度(fraction of inspiration O2,F(xiàn)iO2)1.0,通氣頻率30 次/min,潮氣量15 ml/kg]同時進(jìn)行,并給予腎上腺素30 μg/kg,復(fù)蘇2 min 時,若心電圖仍為心室顫動波或正常動脈搏動波消失,給予30 J 雙相波除顫,復(fù)蘇2 min 為1 個循環(huán);5 個循環(huán)后自主循環(huán)仍未恢復(fù)視為復(fù)蘇失敗。+ROSC 標(biāo)準(zhǔn):心電圖顯示自主心律,MAP ≥60 mmHg并持續(xù)10 min。在CPR 開始即刻,空白對照組經(jīng)腹腔注射生理鹽水10 ml;小劑量MB 組、中劑量MB 組及高劑量MB 組分別經(jīng)腹腔注射MB 注射液1.0 mg/kg、5.0 mg/kg 及10.0 mg/kg。5 組兔均于+ROSC 后24 h放血處死并迅速取出全腦組織用以測定腦組織含水量及觀察海馬CA1 區(qū)病理變化。

    1.4 觀察指標(biāo) 各組兔均于致顫前15 min 及+ROSC 后1、6、12 及24 h 從右頸內(nèi)動脈采血2 ml,注入6 ml 一次性負(fù)壓真空無菌采血管靜置15 min后,以3 000 r/min 離心20 min,取血清置于-20℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測腦損傷標(biāo)志物(NSE、S-100β 蛋白)及凋亡蛋白酶Caspase-3 水平。

    1.5 腦組織含水量測定 采用干濕重法測定腦組織含水量。電子天平精確稱量腦組織質(zhì)量并記錄后,將腦組織置于100℃烤箱烘烤24 h 后再稱量其質(zhì)量并記錄。采用按Ellis 公式計算腦組織含水量。

    腦組織含水量=[(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量]×100%

    1.6 腦組織病理學(xué)觀察 甲醛完全浸泡兔腦后,分離出海馬組織,通過脫水、包埋及切片程序備好石蠟切片,然后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色,電鏡鏡檢,采集分析圖像,觀察海馬CA1 區(qū)病理變化。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,各組不同時間點(diǎn)比較采用重復(fù)測量方差分析,組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組NSE、S-100β 蛋白、Caspase-3 及腦組織含水量比較 +ROSC 后24 h 腦組織含水量,假手術(shù)組為(56.86%±2.99%)、空白對照組為(72.63%±4.61%)、小劑量MB 組為(66.99%±3.95%)、中劑量MB 組為(62.71%±5.45%)、高劑量MB 組為(69.80%±5.65%)。致顫前15 min,各組NSE、S-100β 蛋白及Caspase-3比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。空白對照組、小劑量MB 組、中劑量MB 組及高劑量MB 組+ROSC后1、6、12、24 h NSE、S-100β 蛋 白、Caspase-3 以及+ROSC 后24 h 腦組織含水量均較假手術(shù)組明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),表明造模成功。+ROSC 后24 h,小劑量MB 組、中劑量MB 組及高劑量MB 組腦組織含水量均低于空白對照組;小劑量MB 組、中劑量MB 組腦組織含水量低于高劑量MB 組,且中劑量MB 組低于小劑量MB 組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。+ROSC 后1、6、12、24 h,小劑量MB 組、中劑量MB 組及高劑量MB 組NSE 低于空白對照組;小劑量MB 組、中劑量MB 組NSE 低于高劑量MB 組,且中劑量MB 組低于小劑量MB 組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。+ROSC 后1、6、12、24 h,空白對照組、高劑量MB 組S-100β 蛋白、Caspase-3比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。+ROSC 后1、6、12、24 h,小劑量MB 組、中劑量MB 組S-100β 蛋白、Caspase-3 低于空白對照組,且中劑量MB 組低于小劑量MB 組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

    表1 各組NSE、S-100β 蛋白、Caspase-3 比較()

    表1 各組NSE、S-100β 蛋白、Caspase-3 比較()

    注:與假手術(shù)組比較,①P<0.05;與空白對照組比較,②P <0.05;與小劑量MB 組比較,③P<0.05;與中劑量MB 組比較,④P<0.05

    2.2 各組海馬CA1 區(qū)病理學(xué)觀察 假手術(shù)組未見明顯異常;空白對照組可見神經(jīng)細(xì)胞明顯水腫并伴有散在紅色神經(jīng)元細(xì)胞;低劑量MB組、中劑量MB組、高劑量MB 組紅色神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞水腫程度較空白對照組減輕,其中,中劑量MB 組減輕程度較明顯。見圖1。

    3 討論

    隨著復(fù)蘇技術(shù)不斷完善、CPR 指南逐步更新,心臟驟停患者+ROSC 率提高至47%[9]。然而,近30 年來,院外心臟驟停出院存活率未見顯著變化,不同人群中的總體存活率為6.7%~8.4%,平均存活率為7.6%[10];院內(nèi)心臟驟?;颊叱鲈捍婊盥蕿?2.0%~22.0%,平均存活率為17.0%[11]。由此可見,心臟驟?;颊?ROSC 率提高并非意味著出院存活率及生存質(zhì)量提高。心臟驟?;颊?ROSC 后,機(jī)體發(fā)生一系列復(fù)雜的病理生理改變,包括心臟驟停后腦損傷、心肌功能異常、全身性缺血-再灌注損傷和尚未消除的觸發(fā)心臟驟停的各種原有疾病(或病因)[12]。心臟驟停后腦損傷是22.9%院內(nèi)心肺功能停止(in-of-hospital cardiac arrest,IHCA)患者和67.7% 院前心肺功能停止(out-of-hospital cardiac arrest,OHCA)患者死亡的主要原因[13]。大腦不僅對缺血敏感,對再灌注同樣敏感,+ROSC 過程中,血流和氧供的恢復(fù)引起大腦再灌注損傷,心臟驟停后腦損傷本質(zhì)為缺血再灌注損傷。有研究報道,腦缺血再灌注損傷可能是由心臟驟停期腦灌注不足和隨后的腦水腫引起[14]。盡管已經(jīng)認(rèn)識到腦水腫是心臟驟停后腦損傷的重要特征和評估預(yù)后的重要指標(biāo),但心臟驟停后腦水腫相關(guān)研究較少[15]。動物模型神經(jīng)病理學(xué)和神經(jīng)影像學(xué)研究報道,心臟驟停導(dǎo)致的全腦缺血再灌注損傷更易損傷海馬區(qū)[16-17]。因此,腦海馬區(qū)成為研究神經(jīng)元水腫、壞死及凋亡的重要區(qū)域。凋亡是一種典型的Caspase 依賴性的程序性細(xì)胞死亡,Caspase-3 激活是凋亡誘導(dǎo)途徑的共同特征,其在腦缺血再灌注損傷后增加[18]。此外,腦缺血再灌注損傷的生物標(biāo)志物是S-100β 蛋白、NSE,兩者主要來源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[19]。

    本研究結(jié)果顯示,小劑量MB 組、中劑量MB 組及高劑量MB 組+ROSC 后24 h 腦組織含水量均低于空白對照組;+ROSC 后1、6、12、24 h,小劑量MB 組、中劑量MB 組及高劑量MB 組NSE 低于空白對照組;+ROSC 后1、6、12、24 h,小劑量MB 組、中劑量MB 組S-100β 蛋白、Caspase-3 低于空白對照組。其中,中劑量MB(5.0 mg/kg)用藥對腦組織含水量、NSE、S-100β 蛋白、Caspase-3 的降低更明顯。本研究腦組織海馬CA1 區(qū)病理觀察顯示,低劑量MB 組、中劑量MB 組、高劑量MB 組紅色神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞水腫程度較空白對照組減輕,其中,中劑量MB 組減輕程度較明顯。

    綜上所述,MB 對心臟驟停后兔腦缺血再灌注損傷有一定保護(hù)作用,應(yīng)用中劑量MB(5.0 mg/kg)的保護(hù)作用較明顯,其可能通過減輕腦水腫程度、改善腦組織形態(tài)、抑制凋亡等途徑發(fā)揮腦保護(hù)作用,關(guān)于MB 對心臟驟停后全腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究探討。

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