高效液相色譜法測定飼用玉米中玉米赤霉烯酮的不確定度評定

王 露，李曉偉，馮培培，趙素勤，王繼美

（河南中標(biāo)檢測服務(wù)有限公司，河南鄭州 450000）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA），又稱F-2毒素，是由鐮刀菌屬菌株產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，廣泛存在于霉變玉米等谷物作物中，會導(dǎo)致畜禽出現(xiàn)生殖、免疫疾病，造成畜牧企業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。同時還可以通過被污染的谷類作物和動物性食品進(jìn)入人體，誘發(fā)腫瘤和產(chǎn)生免疫疾病，給人類健康造成極大的危害[1-2]。目前世界上70%～75%玉米的用途是制作飼料，確定玉米赤霉烯酮的含量是評估飼用玉米優(yōu)劣的重要依據(jù)。我國GB 13078—2017[3]規(guī)定，飼用玉米玉米赤霉烯酮含量不得超過0.5 mg·kg-1。目前玉米赤霉烯酮的測定方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和高效液相色譜法等[4]。本文嚴(yán)格按照《飼料中玉米赤霉烯酮的測定 免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》（GB/T 28716—2012）[5]操作，依據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》（CNAS—GL 006：2019）[6]的規(guī)定，對其檢驗結(jié)果的不確定度進(jìn)行評估，為實驗室出具的玉米赤霉烯酮檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品為某公司送檢的飼用玉米粒，實驗室制備樣品完全通過1 mm試驗篩；玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液（濃度為 100.0 μg·mL-1）。

甲醇、乙腈（HPLC級）；氫氧化鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀（分析純）；一級水；玉米赤霉烯酮免疫親和柱；玻璃纖維濾紙（直徑11 cm，無熒光特性）。

1.2 儀器與設(shè)備

U3000高效液相色譜儀配有熒光檢測器；多管渦旋振蕩器；水浴式氮吹儀；粉碎機(jī)；高速冷凍離心機(jī)；pH計；電子天平；玻璃器皿；移液器。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 μg·mL-1）。用移液器準(zhǔn)確移取1 mL玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 μg·mL-1）置于 10 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度。

（2）玉米赤霉烯酮系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。用移液器將玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)中間液準(zhǔn)確移取到容量瓶（10 mL）中，用80%乙腈水溶液稀釋定容至刻度，得到20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1以及500 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品處理

（1）提取。在250 mL具塞錐形瓶中，用百分之一天平稱取40 g樣品，加入4.0 g NaCl，80%乙腈水溶液100 mL，振蕩0.5 h，過濾后用移液器移取濾液10.0 mL，再加入PBS溶液40.0 mL，用玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清，備用。

（2）凈化（按廠家說明執(zhí)行）。在免疫親和柱上端連接10 mL注射器；移取10 mL濾液，以1～2滴/s的速度通過免疫親和柱；加5 mL水淋洗柱子一次，棄掉流出的液體；用注射器吹干柱中水；加入2 mL甲醇以2～3滴/s的速度洗脫；將收集洗脫液55 ℃氮氣吹干，用2 mL提取液（乙腈+甲醇+水，46+46+8）復(fù)溶，混勻，過0.45 μm濾膜，備用。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：Syncronis C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：45%乙腈+46%甲醇+8%水；流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：激發(fā)波長274 nm；發(fā)射波長440 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

1.4 數(shù)學(xué)模型

根據(jù)測定原理及方法，試樣中玉米赤霉烯酮含量按式（1）計算。

式中：Pi為試樣溶液峰面積值；V為樣品的總稀釋體積，mL；cst為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，ng·mL-1；Vst為標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣體積，μL；Pst為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積平均值；m為試樣質(zhì)量，g；Vi為試樣溶液進(jìn)樣體積，μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

根據(jù)測定過程和數(shù)學(xué)模型分析，影響玉米中玉米赤霉烯酮含量的測量不確定度的因素有：①標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制；②標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合；③回收率測定；④重復(fù)性測定；⑤樣品稱量；⑥樣品的前處理操作；⑦高效液相色譜儀。

2.2 不確定度的量化與評定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對不確定度urel-s

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對不確定度urel-s1。玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的濃度為c=100 μg·mL-1（證書），U=1.2 μg·mL-1（k=2），則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）標(biāo)準(zhǔn)系列工作液配制引入的相對不確定度urel-s2。該過程使用了10 mL容量瓶、20～200 μL可調(diào)移液槍和100～1 000 μL可調(diào)移液槍，按照J(rèn)JG 196—2006[7]和JJG 646—2006[8]的要求，用最大允差計算不確定度，按照矩形分布考慮(表 1)。標(biāo)準(zhǔn)系列工作液配制引入的相對不確定度為

表1 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時移液器引入的不確定度

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對不確定度urel-st

將配制玉米赤霉烯酮系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的5個濃度點分別注入高效液相色譜儀，各進(jìn)行2次平行測定（n=10），標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度平均值為測定結(jié)果見表2。

采用最小二乘法擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積平均值為縱坐標(biāo)（Y），回歸方程為Y=229.44X+997.63（a=229.44，b=997.63），線性相關(guān)系數(shù)R2=1.000 0。根據(jù)表2可以計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差SR=207.994與偏差平方和SX=303 040。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度的峰面積測定值（n=10）

樣品重復(fù)測定6次（q=6），將測定的峰面積代入線性回歸方程計算樣品溶液的濃度X樣，結(jié)果分別為 74.98 ng·mL-1、75.92 ng·mL-1、75.75 ng·mL-1、78.08 ng·mL-1、75.43ng·mL-1和 77.23 ng·mL-1，樣液濃度平均值

綜上所述，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

因此，由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對不確定度為

2.2.3 回收率引入的相對不確定度urel-rec

向樣品中加標(biāo)，添加量為50 μg·kg-1，通過前處理，并對樣品進(jìn)行了6次平行測定（n=6）。根據(jù)測定的峰面積，計算得到加標(biāo)回收率分別為93.3%、94.1%、93.6%、94.8%、96.3%和95.2%，平均值為按照貝塞爾公式計算樣品加標(biāo)回收率的標(biāo)準(zhǔn)偏差為S=1.114 9。

2.2.4 重復(fù)性測定引入的相對不確定度urel-p

根據(jù)上述樣品溶液濃度的測定結(jié)果，計算出樣品中玉米赤霉烯酮含量C（in=6），結(jié)果為187.45 μg·kg-1、189.80 μg·kg-1、189.38 μg·kg-1、195.20 μg·kg-1、188.58 μg·kg-1和 193.08 μg·kg-1，樣液濃度平均值：計算出樣品重復(fù)性測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差(貝塞爾公式)

2.2.5 樣品稱量引入的相對不確定度urel-m

根據(jù)國標(biāo)要求，使用百分之一天平稱取40.0 g樣品，證書顯示該天平的擴(kuò)展不確定度U=0.01 g（k=2）。因此樣品稱量引入的不確定度um=0.005 g，其相對不確定度為urel-m=0.005÷40.0=0.000 125。

2.2.6 樣品前處理引入的相對不確定度urel-d

在樣品的前處理中，使用了100 mL的量筒1次，其最大允差為±1.0 mL；使用了50 mL的量筒1次，其最大允差為±0.5 mL；使用了2～10 mL的移液器2次，其最大允差為±0.12%；使用1 000 μL移液器4次，其最大允差為±1.0%。按照矩形分布考慮（），樣品提取引入的相對不確定度為

2.2.7 高效液相色譜儀操作引入的相對不確定度urel-h

使用的高效液相色譜儀，經(jīng)證書查得其測量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為6%（k=2），則高效液相色譜儀操作引入的相對不確定度為

2.3 合成不確定度ur

將各個不確定度分量及其評定結(jié)果匯總于表3，并對其進(jìn)行合成，得到相對合成不確定度為

表3 相對不確定度匯總表

綜上所述，飼用玉米中玉米赤霉烯酮(高效液相色譜法測定)的合成不確定度ur=0.056 060×76.23=4.273 45 μg·kg-1。。

2.4 擴(kuò)展不確定度U

采用正態(tài)分布分析，P=95%，k=2，可得到高效液相色譜法測定飼用玉米中玉米赤霉烯酮的擴(kuò)展不確定度為U=k×ur=8.55 μg·Kg-1。

高效液相色譜法測定飼用玉米中玉米赤霉烯酮的結(jié)果可表示為C=（76.23±8.55）μg·kg-1，置信水平P=95%。

3 結(jié)論

依據(jù)GB/T 28716—2012測定飼用玉米中玉米赤霉烯酮的含量，通過對各個不確定度分量的分析，其中標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和高效液相色譜儀的操作是影響不確定度的因素中占比最大的，分別為30.489 6%和24.437 3%，而樣品稱量引入的相對不確定度幾乎可以忽略不計。因此，在實驗室采用該方法對飼用玉米進(jìn)行檢測時，要在配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時選擇精密度高的計量器具，保證標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的準(zhǔn)確度，同時需要定期開展檢定校準(zhǔn)，保證計量器具和高效液相色譜儀精密性和穩(wěn)定性，減小不確定度分量，保證檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和合理性[9]。