黃芩苷通過調(diào)控miR-145抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲

卓冰冷 彭艷 周志玉

(?？谑腥嗣襻t(yī)院健康管理體檢部，海南 海口 570208)

卵巢癌是一種常見的女性惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率居女性腫瘤的前列，預(yù)后不良，嚴(yán)重影響女性健康〔1〕。卵巢癌早期癥狀不明顯，大部分患者確診時(shí)已是晚期，且發(fā)生轉(zhuǎn)移，增加臨床的治療難度，進(jìn)一步導(dǎo)致卵巢癌患者預(yù)后差、死亡率居高不下〔2〕。卵巢癌的治療方式除常見的手術(shù)、放化療外，基因治療成為研究的熱點(diǎn)〔3,4〕。微小RNA(miRNA)是近年來研究的熱點(diǎn)，可作為腫瘤診斷、治療的潛在基因靶點(diǎn)。miR-145在多腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可通過調(diào)控miR-145影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲〔5〕。黃芩是一種常見的中草藥，對(duì)多種疾病如肺炎、高血壓等有治療作用〔6,7〕?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芩對(duì)腫瘤的病理演進(jìn)過程發(fā)揮抑制作用。黃芩苷是一種天然黃酮，是黃芩的主要活性成分，被研究證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮抑制作用〔8,9〕，其抗腫瘤作用機(jī)制較復(fù)雜，尚未完全明確。本研究擬從miR-145的角度探究黃芩苷對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲的調(diào)控作用，為黃芩苷抗腫瘤機(jī)制的進(jìn)一步闡釋提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)主要材料 卵巢癌多種細(xì)胞系(SKOV3、HO-8910、SW626、A2780、Caov-3)購自北納生物有限公司，黃芩苷購自中國藥品生物制品檢定所，DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、L15培養(yǎng)基、胎牛血清、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，Lipofectamine2000購自美國Life Technologies公司，Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)購自寶生物工程(大連)有限公司；流式細(xì)胞檢測(cè)試劑盒購自美國賽默飛世爾生物科技有限公司，Transwell小室購自美國Corning公司，miR-145抑制劑購自上海吉?jiǎng)P生物有限公司。酶標(biāo)儀購自德國Binder公司，流式細(xì)胞儀、7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2細(xì)胞的培養(yǎng) Caov-3、A2780細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，SKOV3、HO-8910細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，SW626細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的L15培養(yǎng)基，均置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育。

1.3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 選取對(duì)數(shù)期Caov-3細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組、黃芩苷(100 μmol/L)組、anti-miR-145組、黃芩苷+anti-miR-145組。在Lipofectamine2000說明書指示下，anti-miR-145組Caov-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-145抑制劑；黃芩苷+anti-miR-145組細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-145抑制劑后加入100 μmol/L黃芩苷進(jìn)行處理，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，對(duì)照組為常規(guī)培養(yǎng)的Caov-3細(xì)胞。

1.4qPCR實(shí)驗(yàn) 黃芩苷粉與適量DMSO溶液充分混合，濃度調(diào)整為5 000 μmol/L，暗室中保存，實(shí)驗(yàn)前，加入細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋為1 μmol/L、5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L，分別加入各組細(xì)胞中，在Trizol試劑說明書指示下，提取各組卵巢癌細(xì)胞總RNA，加入1.0 μl逆轉(zhuǎn)錄酶，37℃孵育15 min，95℃孵育5 s，合成cDNA。以β-actin為參照，進(jìn)行qPCR，根據(jù)qPCR實(shí)際說明書指示，擴(kuò)增條件為95℃ 3 min，95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。miR-145和β-actin引物由上海生工合成，miR-145正義鏈：5′-TTGTCCTCACGGTCCAGTTT-3′，反義鏈：5′-TTTCCA GGAATCCCCATCTTAGC-3′；β-actin正義鏈：5′-GC ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3′，反義鏈：5′-TCACCTTCACCGTTCCAGTTTTT-3′。

1.5MTT實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)照組、黃芩苷(100 μmol/L)組、anti-miR-145組、黃芩苷+anti-miR-145組Caov-3細(xì)胞，將3×103個(gè)Caov-3細(xì)胞接種至96孔板，37℃培養(yǎng)24、48、72 h，每孔Caov-3細(xì)胞中加入20 μl MTT(5 mg/ml)，37℃培養(yǎng)4 h，每孔Caov-3細(xì)胞中加入150 μl DMSO，37℃培養(yǎng)10 min，振蕩15 min，置于酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm吸光值(A值)。

1.6流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn) 將對(duì)照組、黃芩苷(100 μmol/L)組、anti-miR-145組、黃芩苷+anti-miR-145組Caov-3細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml，37℃培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，吸取10 μl 磷脂酰結(jié)合蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)和5 μl碘化丙啶(PI)加入每孔Caov-3細(xì)胞，暗室中染色15 min，置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)凋亡率。

1.7Transwell實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)照組、黃芩苷(100 μmol/L)組、anti-miR-145組、黃芩苷+anti-miR-145組轉(zhuǎn)染24 h的Caov-3細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基重懸，基質(zhì)膠與DMEM培養(yǎng)基按1∶5進(jìn)行稀釋，加入Transwell小室膜中，進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)；Transwell上室加入2×105個(gè)Caov-3細(xì)胞重懸液，Transwell下室加入600 μl含10%胎牛血清培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h；磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗、棉簽輕輕擦拭Transwell上室，甲醛固定30min，結(jié)晶紫染色30min，顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù)5個(gè)區(qū)域細(xì)胞，取其平均值。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)Transwell小室不添加基質(zhì)膠稀釋液，其與同侵襲。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1黃芩苷對(duì)卵巢癌多種細(xì)胞系中miR-145表達(dá)量的影響 與人正常卵巢上皮細(xì)胞(IOSE80，1.000±0.085)相比，100 μmol/L黃芩苷作用于卵巢癌多種細(xì)胞系(SKOV3、HO-8910、SW626、A2780、Caov-3)明顯促進(jìn)miR-145的表達(dá)量(1.653±0.112，1.896±0.105，2.315±0.164，3.251±0.232，3.852±0.241，P<0.05)，其中在Caov-3細(xì)胞中的表達(dá)量相對(duì)較高。

2.2不同濃度黃芩苷對(duì)miR-145表達(dá)量的影響 與對(duì)照組(1.000±0.073)相比，1、5、25、50、100 μmol/L黃芩苷組miR-145相對(duì)表達(dá)量(1.265±0.087、1.315±0.109、2.152±0.185、3.025±0.231、3.865±0.263)均顯著升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)；因此選取100 μmol/L黃芩苷作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

2.3黃芩苷聯(lián)合miR-145抑制劑對(duì)miR-145表達(dá)量的影響 與對(duì)照組比較，100 μmol/L黃芩苷組miR-145相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與100 μmol/L黃芩苷組比較，anti-miR-145組miR-145相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-145組比較，黃芩苷+anti-miR-145組miR-145相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 黃芩苷聯(lián)合miR-145抑制劑對(duì)miR-145表達(dá)量、細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移

2.4黃芩苷聯(lián)合miR-145抑制劑對(duì)細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組比較，100 μmol/L黃芩苷組48、72 h細(xì)胞增殖顯著降低(P<0.05)；與100 μmol/L黃芩苷組比較，anti-miR-145組48、72 h細(xì)胞增殖顯著升高(P<0.05)；與anti-miR-145組比較，黃芩苷+anti-miR-145組48、72 h細(xì)胞增殖顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.5黃芩苷聯(lián)合miR-145抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，100 μmol/L黃芩苷組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與100 μmol/L黃芩苷組比較，anti-miR-145組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-145組比較，黃芩苷+anti-miR-145組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表1，圖1。

圖1 黃芩苷聯(lián)合miR-145抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

2.6黃芩苷聯(lián)合miR-145抑制劑對(duì)細(xì)胞侵襲、遷移的影響 與對(duì)照組比較，100 μmol/L黃芩苷組細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)；與100 μmol/L黃芩苷組比較，anti-miR-145組細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05)；與anti-miR-145組比較，黃芩苷+anti-miR-145組細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)。見表1，圖2。

圖2 黃芩苷聯(lián)合miR-145抑制劑對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

3 討 論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，也是女性腫瘤死亡率居高不下的主要原因。卵巢癌患者預(yù)后差，目前無有效治療方案。miRNA被證實(shí)參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并與腫瘤患者的臨床病理特征顯著相關(guān)，可作為腫瘤基因靶向診斷、治療的潛在分子靶點(diǎn)〔10～13〕。miR-145被證實(shí)在多腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。在非小細(xì)胞肺癌中，miR-145表達(dá)量降低，過表達(dá)miR-145抑制細(xì)胞的遷移和侵襲〔14〕。miR-145在膀胱癌組織及多種細(xì)胞系中表達(dá)量降低，過表達(dá)miR-145可抑制細(xì)胞的增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，表明miR-145有抗腫瘤作用〔15〕。在卵巢癌組織生長(zhǎng)過程中，miR-145表達(dá)量明顯降低，過表達(dá)miR-145顯著抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡〔16〕，表明miR-145在卵巢癌病理進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用。

黃芩苷是中藥黃芩的重要活性成分，被證實(shí)有多種病理作用如抗感染〔17〕、抗病毒〔18〕等。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可通過調(diào)控miRNA的表達(dá)量從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等過程。黃芩苷作用的前列腺癌細(xì)胞中miR-485-5p表達(dá)量顯著增加，表明黃芩苷可能通過促進(jìn)miR-485-5p表達(dá)量抑制前列腺癌細(xì)胞增殖〔19〕。與正常乳腺細(xì)胞相比，miR-126在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)量明顯降低，進(jìn)一步檢測(cè)黃芩苷作用的乳腺癌細(xì)胞中miR-126表達(dá)量明顯上調(diào)，提示黃芩苷可能通過上調(diào)miR-126抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)凋亡〔20〕。上述研究表明，黃芩苷可能通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞中的miRNA表達(dá)量發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究結(jié)果表明miR-145在卵巢癌病理演進(jìn)過程中發(fā)揮抗癌作用，與劉龍浩等〔16〕報(bào)道結(jié)果相一致；100 μmol/L黃芩苷可抑制Caov-3細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移，促進(jìn)凋亡，進(jìn)一步證實(shí)黃芩苷在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抗癌作用；黃芩苷作用于轉(zhuǎn)染miR-145抑制劑的Caov-3細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，miR-145抑制劑與黃芩苷聯(lián)合作用明顯逆轉(zhuǎn)黃芩苷對(duì)Caov-3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用及凋亡促進(jìn)作用，表明在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中，黃芩苷通過上調(diào)miR-145抑制細(xì)胞的惡性生物學(xué)特性。

綜上，黃芩苷可上調(diào)卵巢癌細(xì)胞中miR-145的表達(dá)量，有一定濃度依賴性；黃芩苷抑制Caov-3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)凋亡，其作用機(jī)制是通過上調(diào)miR-145的表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)僅在細(xì)胞水平進(jìn)行了初步研究，未來會(huì)通過構(gòu)建動(dòng)物模型、探究miR-145下游靶基因等多方面進(jìn)一步研究黃芩苷的作用機(jī)制。