韭菜籽油微膠囊的制備及工藝優(yōu)化

尹國(guó)友， 于英楠， 孫 婕， 劉亦菲， 陳 涵， 王 召

(河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院1，平頂山 467036) (平頂山市平豐種業(yè)有限責(zé)任公司2，平頂山 467001)

韭(AlliumtuberosumRottl.ex Spreng.)為多年生宿根草本植物，適應(yīng)性強(qiáng)，抗寒耐熱，全國(guó)均有種植，常用做中藥材，其根和籽亦可入藥[1,2]。韭菜籽是韭菜干燥成熟的種子，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià)值都極高，富含生物堿、甾體皂苷、多不飽和脂肪酸、氨基酸、礦物質(zhì)元素、蛋白質(zhì)、膳食纖維和以及B 族維生素等生物活性物質(zhì)[3-7]。近年來關(guān)于韭菜籽油的研究主要集中在提取和成分鑒定與分析等方面[8,9]。韭菜籽油富含亞油酸，被視為一種保健和營(yíng)養(yǎng)的食用油新來源[9-11]。

食用油脂通常不易分散于食品體系，這就限制了其生理活性和加工性能[12]。韭菜籽油富含不飽和脂肪酸，儲(chǔ)存穩(wěn)定性較差。微膠囊技術(shù)可以利用天然的或者合成的高分子包囊材料，將固體、液體或氣體物質(zhì)包埋在微小、半透性或密封的膠囊內(nèi)，使內(nèi)容物在特定條件下以可控的速率進(jìn)行釋放[13]，可以將油脂轉(zhuǎn)化為粉體，即粉末油脂。油脂粉末化后有利于其運(yùn)輸、儲(chǔ)藏和食用，可擴(kuò)大油脂的使用范圍，而且油脂微膠囊化后可防止油脂的氧化酸敗[14,15]。在保護(hù)核芯物質(zhì)不被氧化的情況下也不會(huì)影響核芯物質(zhì)本身的理化性質(zhì)，能有效控制釋放活性物質(zhì)[16-18]，因此廣泛被應(yīng)用于食品[19]、醫(yī)學(xué)[20]、化妝品[21]、紡織品[22]等領(lǐng)域。

本研究以韭菜籽油為原料，制備具有良好穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)表征的微膠囊韭菜籽油，為韭菜籽油的微膠囊工業(yè)化生產(chǎn)和綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

韭菜籽油(超臨界CO2流體萃取制備)，明膠，阿拉伯膠，CMC，HI-CAP 100麥芽糊酪蛋白酸鈉，TG酶，氫氧化鈉，無水乙醇，碘化鉀，三氯甲烷，石油醚，0.02 mol/L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液，可溶性淀粉。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3E型pH計(jì)，T25型分散機(jī)，HH-S4型恒溫水浴鍋，010-1SA型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，ME204E電子天平，SCIENTZ-12 Ⅰ/Ⅱ型冷凍干燥機(jī)，KQ5200DB 型數(shù)控超聲波清洗器，PEI inspect F50掃描電鏡。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)流程圖

韭菜籽油微膠囊制備流程圖見圖1。

圖1 韭菜籽油微膠囊制備流程圖

1.3.2 壁材選擇實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[23-25]的實(shí)驗(yàn)方法稍作修改。

乳狀液的制備：稱取一定量壁材置于燒杯中，水浴攪拌使其進(jìn)行充分溶解。而后加入韭菜籽油，并在12 000 r/min條件下分散3 min，制備成均勻的乳狀液。

復(fù)凝聚反應(yīng)：將乳狀液在40 ℃水浴下攪拌，加入10%乙酸溶液，將pH調(diào)節(jié)至壁材等電點(diǎn)附近，繼續(xù)反應(yīng)15 min后，用冰水速冷卻至15 ℃以下。

固化：用 10%的氫氧化鈉溶液將反應(yīng)體系的pH值調(diào)節(jié)至6.0，加入一定量的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG)，保持15 ℃左右的溫度，固化3 h。

干燥：將制備好的微膠囊懸濁液靜置分層，除去上清液，在-4 ℃冰箱中進(jìn)行冷凍，冷凍后樣品經(jīng)過冷凍干燥得到微膠囊粉末，或在進(jìn)樣溫度180 ℃，進(jìn)樣速度15 mL/min噴霧干燥器內(nèi)進(jìn)行噴霧干燥。

單因素實(shí)驗(yàn)：選取pH、壁材濃度、壁材比以及芯壁比作為因素在各因素梯度下制備微膠囊并檢測(cè)其包埋率。

1.3.3 微膠囊表面油、總油及包埋率的測(cè)定

參考楊艷紅等[26]的方法并稍作修改。

韭菜籽油微膠囊表面油測(cè)定：稱取3 g樣品置于燒瓶中，分多次將50 mL石油醚加入燒杯中，每次倒入后均振蕩 3 min。過濾并合并濾液，轉(zhuǎn)移至干燥且已稱重的燒瓶中，記空燒瓶質(zhì)量為m1，在60 ℃恒溫水浴加熱濾液，蒸出石油醚，直至表面油和燒杯的總質(zhì)量不再變，稱質(zhì)量記為m2，表面油質(zhì)量記為mx。

mx=m2-m1

(1)

韭菜籽油微膠囊總油測(cè)定：準(zhǔn)確稱取3 g樣品至燒瓶中，記空瓶質(zhì)量m3，加入150 mL石油醚進(jìn)行萃取，60 ℃恒溫水浴加熱直至總油和燒瓶的總質(zhì)量不再變化，稱質(zhì)量記為m4，微膠囊總油質(zhì)量記為my。

my=m4-m3

(2)

韭菜籽油微膠囊包埋率記為E。

(3)

根據(jù)各組壁材對(duì)韭菜籽油包埋率的測(cè)定結(jié)果，選定最優(yōu)壁材組合，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 微膠囊光學(xué)顯微鏡觀察

將制備的微膠囊制備成涂片，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察并記錄照片。

1.3.5 微膠囊掃描電鏡觀察

取少量干燥后微囊粉末，粘于導(dǎo)電膠，吹去多余粉末并噴金，噴金厚度100 μm，在視野清晰且有代表性的條件下觀察微膠囊形態(tài)。加速電壓設(shè)定10 kV。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用 Design Expert 11軟件進(jìn)行結(jié)果分析。選擇反應(yīng)pH、壁材比、芯壁比以及壁材質(zhì)量濃度作為響應(yīng)面的4個(gè)因素變量，以韭菜籽油微膠囊包埋率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)方案，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析以及優(yōu)化，各因素水平選取見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 壁材選擇實(shí)驗(yàn)

2.1.1 明膠-阿拉伯膠微膠囊單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 明膠-阿拉伯膠微膠囊壁材選擇結(jié)果

由圖2可知，明膠-阿拉伯膠微膠囊包埋率最高為77.77%。pH、壁材質(zhì)量濃度、壁材比以及芯壁比均對(duì)微膠囊包埋率有著較為明顯的影響。明膠的表面帶電性取決于所處的pH環(huán)境，當(dāng)明膠所處環(huán)境pH低于等電點(diǎn)時(shí)，其呈正電性，而阿拉伯膠是一種負(fù)電荷聚合物，當(dāng)明膠與阿拉伯膠所帶正負(fù)電荷越接近，添加量越接近，凈電荷越少，凝聚反應(yīng)越充分，復(fù)合凝聚效果越好，包埋率越高[27]。如果壁材添加量過多，會(huì)出現(xiàn)壁材之間相互碰撞粘連的情況，降低包埋率。如果芯材添加量過多，可能會(huì)使包埋韭菜籽油量過大，從而導(dǎo)致微膠囊不穩(wěn)定的現(xiàn)象[28]。

明膠-阿拉伯膠韭菜籽油微膠囊在光學(xué)顯微鏡下均為單核微膠囊，未見多核微膠囊產(chǎn)生，微膠囊粒徑不均勻，微膠囊數(shù)量較少，粘連現(xiàn)象較多，見圖3。

圖3 明膠-阿拉伯膠微膠囊光學(xué)顯微鏡圖(50×)

明膠-阿拉伯膠微膠囊凍干后掃描電鏡如圖4a所示，為不規(guī)則形態(tài)，外壁較為光滑。從外觀看，其壁材粘連較為嚴(yán)重，可能是因?yàn)榘⒗z黏度較高，凍干過程中壁材迅速縮水從而造成壁材堆積在一起，故未呈現(xiàn)規(guī)則球狀[29]。明膠-阿拉伯膠微膠囊噴干后掃描電鏡如圖4b所示，呈較為規(guī)則的微球狀，大小較不均勻，細(xì)致觀察微膠囊表面不光滑，可能是由于微膠囊在噴霧干燥過程中迅速干燥，造成的微膠囊表面脫水不均勻所造成的。

圖4 明膠-阿拉伯膠韭菜籽油微膠囊掃描電鏡圖

2.1.2 明膠-羧甲基纖維素鈉(CMC)微膠囊單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖5可知，明膠-CMC微膠囊包埋率最高為87.4%。材濃度、壁材比以及芯壁比均對(duì)微膠囊包埋率有著較為明顯的影響。在制備微膠囊過程中，CMC較為難以溶解，所以當(dāng)壁材質(zhì)量濃度超過0.9 g/100 mL時(shí)隨著壁材質(zhì)量濃度的增加，CMC在溶液體系中溶解不完全，導(dǎo)致明膠無法反應(yīng)完全，造成包埋率下降，故壁材質(zhì)量濃度選用0.9 g/100 mL作為微膠囊制備壁材質(zhì)量濃度。對(duì)于壁材比對(duì)微膠囊包埋率的影響來說，當(dāng)兩種壁材所帶相反電荷數(shù)越接近，微膠囊的包埋率越高，故當(dāng)壁材比為9∶1時(shí)微膠囊包埋率相較其他壁材比較高。同時(shí)如果添加量過多，會(huì)出現(xiàn)壁材之間相互碰撞粘連的情況，降低包埋率。芯材添加量過多，可能會(huì)使包埋韭菜籽油量過大，從而導(dǎo)致微膠囊不穩(wěn)定的現(xiàn)象[30]。

明膠-CMC韭菜籽油微膠囊在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)所制備的微膠囊中絕大部分為單核微膠囊，少量為多核微膠囊。微膠囊粒徑大小不均勻，但微膠囊數(shù)量較多，有少量粘連現(xiàn)象發(fā)生，見圖6。

如圖7a所示，明膠-CMC微膠囊凍干后樣品呈不規(guī)則形狀且外壁有少量較小的微膠囊出現(xiàn)，由于復(fù)凝聚法形成的微膠囊并非完全疏水，故其還含有一定量的水分，所以在未進(jìn)行分散的干燥過程中微膠囊極易相互粘連變形[31]。如圖7b所示，明膠-CMC微膠囊噴干后，所觀察到的微膠囊多數(shù)呈規(guī)則球狀，少量呈不規(guī)則形狀，且有可見的破碎的微膠囊。其中較為規(guī)則的球狀微膠囊表面光滑，有較少數(shù)凹陷。微膠囊之間粘連性較大，聚堆現(xiàn)象嚴(yán)重。

圖5 明膠-羧甲基纖維素鈉微膠囊壁材選擇結(jié)果

圖6 明膠-羧甲基纖維素鈉微膠囊光學(xué)顯微鏡圖

圖7 明膠-羧甲基纖維素鈉韭菜籽油微膠囊掃描電鏡圖

2.1.3 HI-CAP 100-明膠單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖8可知，HI-CAP 100-明膠微膠囊包埋率最高為47.13%。壁材質(zhì)量濃度、壁材比以及芯壁比均對(duì)微膠囊包埋率的影響較不顯著，只有pH對(duì)微膠囊的影響略微顯著，復(fù)凝聚法制備微囊過程中，囊材、芯材通過靜電作用相互吸引，因此需要嚴(yán)格控制pH[32]，將溶液pH調(diào)至明膠等電點(diǎn)以下時(shí)，明膠分子帶正電荷，在此pH下，HI-CAP 100-Na帶負(fù)電荷，兩者具有相反的電荷，從而相互交聯(lián)形成復(fù)合物[30]。但是總的來看，HI-CAP 100-明膠微膠囊包埋率整體水平都不高。

HI-CAP 100-明膠韭菜籽油微膠囊在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)所制備的微膠囊中近似明膠-CMC微膠囊，大部分為單核微膠囊，少量為多核微膠囊。微膠囊粒徑大小不均勻，有少量粘連現(xiàn)象發(fā)生，見圖9。

HI-CAP 100-明膠微膠囊凍干后掃描電鏡如圖10a所示，外壁較為光滑，為不規(guī)則形態(tài)。從外觀看，其壁材粘連較為嚴(yán)重，可能是因?yàn)槟z體致使微膠囊黏度較高，凍干過程中壁材迅速縮水從而造成壁材堆積在一起，故未呈現(xiàn)規(guī)則球狀[29]。HI-CAP 100-明膠微膠囊噴干后掃描電鏡如圖10b所示，有較多的球體，呈現(xiàn)規(guī)則的形狀，但大小較不均勻，細(xì)致觀察微膠囊表面較不光滑，可能是由于微膠囊在噴霧干燥過程中迅速干燥，表面脫水不均勻所造成的。

圖8 HI-CAP 100-明膠微膠囊壁材選擇結(jié)果

圖9 HI-CAP 100-明膠微膠囊光學(xué)顯微鏡圖

圖10 HI-CAP 100-明膠韭菜籽油微膠囊掃描電鏡圖

2.1.4 HI-CAP 100-麥芽糊精單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖11可知，HI-CAP 100-麥芽糊精微膠囊包埋率最高為90.77%。芯材濃度、壁材比以及芯壁比均對(duì)微膠囊包埋率有著較為明顯的影響。在制備微膠囊過程中，HI-CAP 100與麥芽糊精溶解較好，在壁材達(dá)到最高時(shí)，包埋率下降較為緩慢，故壁材質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)均會(huì)使微膠囊保持較高的包埋率。壁材比超過1∶1后，下降趨勢(shì)不符合預(yù)期，可能因?yàn)閷?shí)驗(yàn)操作等緣故造成數(shù)據(jù)不穩(wěn)定。HI-CAP 100可使乳液具有較低的黏度同時(shí)可以使液滴表面適當(dāng)飽和，從而產(chǎn)生尺寸較小的液滴，絮凝速率通常較慢，具有更高的穩(wěn)定性[33]。 HI-CAP 100-麥芽糊精韭菜籽油微膠囊在光學(xué)顯微鏡下均為單核微膠囊，未見多核微膠囊產(chǎn)生，微膠囊粒徑較為均勻，微膠囊數(shù)量較多，且粘連現(xiàn)象較少，見圖12。

圖11 HI-CAP 100-麥芽糊精微膠囊壁材選擇結(jié)果

圖12 HI-CAP 100-麥芽糊精微膠囊光學(xué)顯微鏡圖

如圖13a所示，HI-CAP 100-麥芽糊精微膠囊凍干后呈較為規(guī)則的網(wǎng)絡(luò)孔隙結(jié)構(gòu)，其原因可能是因?yàn)镠I-CAP 100是以淀粉為原料在一定條件下，在淀粉多糖長(zhǎng)鏈上同時(shí)引入親水羧酸基團(tuán)和疏水烯基長(zhǎng)鏈，所以其制備的乳液有較強(qiáng)的穩(wěn)定性[34]。所以當(dāng)經(jīng)過凍干時(shí)，可以形成較為規(guī)則的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。如圖13b所示，HI-CAP 100-麥芽糊精微膠囊噴干后呈規(guī)則球形，單個(gè)微膠囊經(jīng)噴干后并未見凹陷。部分微膠囊表面出現(xiàn)褶皺，可能是因?yàn)槲⒛z囊壁材較厚，噴干過程中產(chǎn)生不均勻收縮所造成的[35]。

圖13 HI-CAP 100-麥芽糊精韭菜籽油微膠囊掃描電鏡圖

2.1.5 微膠囊壁材選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)壁材包埋率、微膠囊形態(tài)觀察、掃描電鏡結(jié)果分析以及微膠囊的干燥方式的研究結(jié)果，選擇HI-CAP 100-麥芽糊精作為微膠囊壁材，噴霧干燥法作為微膠囊干燥方式進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以反應(yīng)pH、壁材比、芯壁比以及壁材質(zhì)量濃度作為響應(yīng)面的4個(gè)因素變量，以韭菜籽油微膠囊包埋率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)方案，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析以及優(yōu)化，Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸模型分析

利用Design-Expert 11統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)29組不同因素組合條件下所得韭菜籽油的包埋率進(jìn)行回歸分析擬合，得到回歸方程模型方差分析及回歸方程系數(shù)估計(jì)值(表3)。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 多元二次模型的方差分析表

包埋率(%)=89.80+2.19A+0.785 8B+2.24C+1.88D+1.36AC+0.942 5AD-1.03BD-3.05A2-1.77B2-3.05C2-2.83D2

(4)

由表3可知，pH、芯壁比、壁材質(zhì)量濃度對(duì)反應(yīng)包埋率的影響達(dá)到了極顯著得程度，而壁材比對(duì)包埋率的影響達(dá)到了顯著的程度，pH與芯壁比，pH與壁材質(zhì)量濃度，壁材比與壁材質(zhì)量濃度之間的相互作用也達(dá)到了顯著程度。

2.2.3 微膠囊最佳工藝條件確定

通過響應(yīng)面分析可知，響應(yīng)面曲面坡度陡峭，等高線呈橢圓形，當(dāng)芯壁比、壁材質(zhì)量濃度處于低值與高值時(shí)，隨著pH的增加，包埋率都先增加后減小，說明pH與芯壁比、pH與壁材質(zhì)量濃度交互作用顯著[36]。當(dāng)壁材比處于低值與高值時(shí)，隨著壁材質(zhì)量濃度的增加，包埋率都先增加后減小，說明壁材比和壁材質(zhì)量濃度交互作用顯著。二次多項(xiàng)回歸模型中二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2的系數(shù)均為負(fù)值，說明響應(yīng)面開口向下方程有極大值。對(duì)回歸方程求導(dǎo)，并令其等于零，可以得到曲面的最高點(diǎn)，即獲得韭菜籽油微膠囊的最佳工藝條件：反應(yīng)pH為4.56，壁材比為1.07∶1，芯壁比為1.28∶1，壁材質(zhì)量濃度為1.04 g/100 mL，在此條件下，韭菜籽油微膠囊預(yù)測(cè)包埋率可達(dá)91.58%。

2.2.4 驗(yàn)證型實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化的最佳工藝參數(shù)，噴霧干燥制備韭菜籽油微膠囊，做3組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)性較好，平均包埋率為90. 80%，與預(yù)測(cè)理論值差0.78%，相對(duì)誤差小于1%，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳工藝參數(shù)可靠。

3 結(jié)論

分別采用明膠-阿拉伯膠、明膠-CMC、HI-CAP 100-明膠以及HI-CAP 100-麥芽糊精4種組合作為壁材，利用復(fù)凝聚法制備韭菜籽油微膠囊。以韭菜籽油微膠囊的包埋率、光學(xué)顯微鏡觀察和掃描電鏡結(jié)構(gòu)表征為反應(yīng)指標(biāo)，在反應(yīng)pH、壁材質(zhì)量濃度、壁材比及芯壁比4個(gè)不同因素下，確定了最佳組合壁材為HI-CAP 100-麥芽糊精，進(jìn)而通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，最終確定了韭菜籽油微膠囊最佳優(yōu)化工藝條件為反應(yīng)pH為4.56，壁材比為1.07∶1，芯壁比為1.28∶1，壁材質(zhì)量濃度為1.04 g/100 mL，在此條件下韭菜籽油微膠囊包埋率達(dá)到了90.80%。