鯉皰疹病毒3型ORF57基因工程亞單位疫苗制備及免疫保護(hù)研究

劉舒亞，何汶璐，陶 雨，黃雙慧，任永強(qiáng)，耿 毅，黃小麗，陳德芳，歐陽萍，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130； 2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 中葡中醫(yī)藥國際合作中心，四川 瀘州 646099； 3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，四川 成都 611130)

錦鯉皰疹病毒(Koi herpesvirus，KHV)，又名為鯉魚皰疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3)，是一種線性、雙鏈DNA病毒，基因組大小約為295 kb，編碼155個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，是皰疹病毒目中已知的最大的皰疹病毒。1998年在以色列首次報道，該病于2001年在香港首次暴發(fā)，隨后東南亞許多國家相繼報道鯉魚感染CyHV-3。自20世紀(jì)90年代末出現(xiàn)以來，這種具有高度傳染性和高死亡率的疾病對世界范圍內(nèi)的錦鯉及普通鯉魚養(yǎng)殖業(yè)都造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

現(xiàn)這種疾病在世界上廣泛分布，該病常發(fā)生于春秋兩季，所有年齡段的鯉魚、錦鯉和鯉魚變種都是受感染的物種。臨床癥狀表現(xiàn)為背鰭折疊、食欲不振、呼吸困難、體表黏液增多，患病魚眼球凹陷，皮膚出血皰疹樣變，鰓蒼白或壞死等。病毒在鰓、腸、肝、腦和腎組織中復(fù)制，死亡率高達(dá)80%～100%。由于其發(fā)病范圍廣，死亡率高，已被列入世界動物疫病名錄。有學(xué)者認(rèn)為，病毒首先通過鰓感染，鰓壞死細(xì)胞攜帶大量病毒傳播到水環(huán)境中，然后再感染其他個體。然而通過生物發(fā)光成像分析，CyHV-3可能通過皮膚進(jìn)入魚體，鯉魚皮膚的損傷區(qū)和傷口愈合區(qū)很容易發(fā)生病毒入侵。目前對其只能通過疫苗、生物安全措施或育種來預(yù)防和控制CyHV-3感染，暫無有效的治療藥物。

目前通過基因工程制作亞單位疫苗，將目的基因插入合適的載體中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，已顯示出最好的中等效力。然而CyHV-3的結(jié)構(gòu)和功能尚處于探索階段，由于目前市場上無高效、安全、防治CyHV-3的疫苗，基因工程亞單位疫苗因其具備安全性高、穩(wěn)定性好、產(chǎn)量高等特點(diǎn)，所以成為CyHV-3新型疫苗開發(fā)的一個重要方向。CyHV-3的155個開放讀碼框中只有少數(shù)被研究，例如，ORF25、ORF26、ORF27、ORF65、ORF148和ORF149編碼的膜糖蛋白，ORF16編碼的G蛋白偶聯(lián)受體，ORF134編碼病毒IL-10，ORF12編碼腫瘤壞死因子受體同源性，ORF57、ORF81、ORF83可編碼囊膜蛋白，ORF72和ORF92編碼衣殼蛋白。這些開放閱讀框編碼的蛋白有很大的潛力被應(yīng)用于亞單位疫苗的研發(fā)。

與其他皰疹病毒類似，CyHV-3的成熟病毒粒子由DNA核心、衣殼、被膜和囊膜組成。在最近的一項(xiàng)研究中，通過基于抗CyHV-3抗體的親和性，從鯉魚組織中鑒定出78種宿主蛋白和5種潛在的免疫原性病毒蛋白。在結(jié)構(gòu)蛋白中，由于囊膜蛋白參與宿主-病毒的相互作用，如在病毒感染和組裝過程中與細(xì)胞受體的黏附和與宿主細(xì)胞膜的融合，因此對疫苗的開發(fā)具有重要意義。

已有研究表明，CyHV-3 ORF57編碼囊膜蛋白，具有被應(yīng)用于亞單位疫苗研發(fā)的潛力。因此，本研究旨在檢測ORF57的免疫原性，并檢測其免疫后鯉魚體內(nèi)抗體的產(chǎn)生。將ORF57序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將目的序列克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)，經(jīng)大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)獲得重組蛋白ORF57。將其與免疫佐劑混合制備成亞單位疫苗對健康鯉魚進(jìn)行免疫接種，檢測了ORF57亞單位疫苗對鯉魚的免疫保護(hù)作用并對免疫后的鯉魚體內(nèi)抗體的產(chǎn)生進(jìn)行了檢測。為CyHV-3疫苗的開發(fā)及重組蛋白ORF57在免疫學(xué)中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株、質(zhì)粒及主要實(shí)驗(yàn)試劑

CyHV-3病毒株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心分離鑒定并保存；健康鯉魚IgM、pET-32a(+)空載蛋白、鯉魚腦細(xì)胞系(CCB)由本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體pMD19-T，表達(dá)載體PET-32a (+)，購自寶生物工程(大連)公司；大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、大腸埃希菌BL21(DE3)，購自天根生化科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠Ig(二抗)、鼠抗His標(biāo)簽(一抗)Ni-NTA-Sefinose柱，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物

雄性健康新西蘭大白兔，2 kg；購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司；健康鯉魚，(50±5) g，購自宜賓翠屏區(qū)某鯉魚養(yǎng)殖場。

1.2 方法

1.2.1 CyHV-3 ORF57序列的克隆

根據(jù)GenBank上CyHV-3全基因組序列(GenBank登錄號為 DQ657948.1)，Primer Premiers 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見表1。將CyHV-3病毒液接種于CCB細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，收集細(xì)胞沉淀，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix12.5 μL，cDNA模板1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddHO 9.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

表1 CyHV-3 ORF57序列的特異性引物

PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，將含有目的基因的凝膠塊回收?；厥债a(chǎn)物與pMD19-T連接，轉(zhuǎn)至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆進(jìn)行菌液PCR 和雙酶切鑒定。酶切反應(yīng)體系：HⅠ 0.5 μL，dⅢ 0.5 μL，重組質(zhì)粒5 μL，10×Green Buffer 1 μL，ddHO 3 μL。反應(yīng)條件：37 ℃，30 min。鑒定正確的重組克隆質(zhì)粒命名為pMD19-T- CyHV-3-ORF57，陽性質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序驗(yàn)證。

1.2.2 CyHV-3 ORF57序列及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

使用ProtParam在線工具(https：//www.expasy.org/tools)將CyHV-3 ORF57序列的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列；使用 ProtScale(https：//web.expasy.org/protscale/)在線工具進(jìn)行氨基酸序列親/疏水性分析，TMHMM Server v.2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)程序進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測，SignalP-5.0在線預(yù)測信號肽(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，選用KinasePhos(http：//kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/)在線分析磷酸化位點(diǎn)，應(yīng)用Psipred(http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)在線程序和PyMOL軟件分別預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。

1.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

將含重組質(zhì)粒pMD19-T-CyHV-3-ORF57與表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)的菌株分別接種于含AMP的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。提取質(zhì)粒并對表達(dá)質(zhì)粒和重組克隆質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切鑒定產(chǎn)物，回收目的片段。目的片段與表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)于16 ℃連接過夜，連接反應(yīng)體系：目的片段回收產(chǎn)物3.5 μL，膠回收表達(dá)質(zhì)粒pET-32a 1 μL，T4 DNA Ligase 0.5 μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 1 μL，ddHO 4 μL。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞， 篩選陽性克隆進(jìn)行菌液PCR和酶切鑒定。將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-32a(+)-CyHV-3-ORF57。

1.2.4 重組蛋白的表達(dá)、純化和特異性檢測

重組質(zhì)粒pET-32a(+)-CyHV-3-ORF57轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株BL21(DE3)，將其接種于含AMP的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 ℃下150 r·min培養(yǎng)至=0.6，加入1.0 mmol·LIPTG繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)4 h。然后將菌液于8 000×離心10 min，棄掉上清，所得的菌體沉淀PBS重懸洗滌3次后，加入3 mL PBS重懸。將重懸的菌體放置于-80 ℃和室溫中反復(fù)凍融3次，用超聲進(jìn)行破碎。超聲后的菌體于8 000×離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管中，并用3 mL 8 mol·L尿素溶解剩余的沉淀。最后將得到的蛋白上清液樣品和沉淀樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE，分析目的蛋白在菌體中的表達(dá)分布情況。

對以包涵體形式表達(dá)的重組ORF57采用Ni-NTA-Sefinose柱進(jìn)行純化，使用核酸蛋白分光光度計(jì)測定純化后的蛋白濃度，梯度透析復(fù)性法獲得復(fù)性重組ORF57蛋白，10% SDS-PAGE進(jìn)行分析。重組蛋白于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用10% SDS-PAGE分離純化的蛋白質(zhì)，SDS-PAGE膠剝離后放入裝有轉(zhuǎn)膜緩沖液的平皿中，充分浸泡5～10 min。在轉(zhuǎn)移盒負(fù)極上從下至上依次置放3張濾紙-凝膠-PVDF膜-3張濾紙，恒流150 mA轉(zhuǎn)移1 h。之后將PVDF膜放入裝有3% BSA/TBST 的平皿中，37 ℃封閉1 h。封閉完成后，用TBST洗滌PVDF膜 3 次，每次洗滌10 min。按1∶1 000 稀釋一抗(兔抗 His 標(biāo)簽抗體)，將PVDF膜放入裝有一抗的平皿中，37 ℃孵育1～2 h，棄掉一抗，用TBST洗滌PVDF 膜3次，每次洗滌10 min。按1∶5 000 稀釋二抗(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔 IgG，將PVDF膜放入裝有二抗的平皿中，37 ℃孵育1 h。結(jié)束后，用TBST 洗滌PVDF膜。最后按照二甲基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液說明書進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.2.5 重組蛋白ORF57亞單位疫苗的免疫保護(hù)性研究

純化后的重組蛋白ORF57與佐劑(漁用商品佐劑MontanideISA 763 AVG)等體積充分混合后制備成亞單位疫苗，選擇健康鯉魚[CyHV-3的PCR結(jié)果為陰性，(50.0±5.0)g]分為4組，每組30尾；分別為重組蛋白ORF57亞單位疫苗組、pET-32a(+)空載蛋白組、等量佐劑組和等量PBS組(空白組)，在實(shí)驗(yàn)室(25±1)℃馴化14 d后采用腹腔注射的方式對健康鯉魚進(jìn)行接種，每尾注射200 μL，免疫3次，每次間隔14 d。從4組實(shí)驗(yàn)魚中隨機(jī)選取10尾在免疫后第1、2、3、4、5、6周每尾靜脈采血0.5 mL收集血清為后續(xù)試驗(yàn)備用。

為檢測疫苗對感染魚的免疫保護(hù)情況，免疫28 d后，對重組蛋白ORF57亞單位疫苗組、PBS和pET-32a(+)空載蛋白組剩余的20尾實(shí)驗(yàn)魚進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，采用腹腔注射攻毒，攻毒劑量為10PFU·尾。攻毒后觀察各組魚的臨床表現(xiàn)，同時記錄攻毒21 d內(nèi)各組魚的死亡情況，計(jì)算存活率。

1.2.6 鯉魚血清抗體消長規(guī)律檢測

將實(shí)驗(yàn)室制備的健康鯉魚IgM用無菌PBS調(diào)整終濃度到1.0 mg·mL，與弗氏佐劑等體積混合后對大白兔進(jìn)行免疫。免疫方式為背部皮下多點(diǎn)注射，注射劑量為2 mL，免疫次數(shù)為3次，每次間隔7 d，一免使用完全佐劑，二、三免使用不完全佐劑。免疫結(jié)束后1周耳緣靜脈采血，靜置離心后得到血清，采用鹽析法制備兔抗鯉魚血清抗體。

取免疫后1～6周魚尾靜脈血清，用ELISA法檢測重組蛋白ORF57特異性抗體。將重組蛋白ORF57作為抗原，用磷酸鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋至50 μg·mL；健康鯉魚的血清為陰性對照。各組待測血清加入96孔板中，在4 ℃下包被過夜。用PBST(PBS中0.1%吐溫-20)洗滌3次，然后37 ℃下用3% BSA在PBST中封閉2 h。以兔抗鯉魚IgM抗血清(1∶200，本實(shí)驗(yàn)室制備)和山羊抗兔IgG-HRP(1∶2 000)分別作為一抗和二抗。最后3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液進(jìn)行顯色，2 mol·L濃硫酸終止顯色，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長下的吸光度值，進(jìn)行抗體含量的檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 CyHV-3 ORF57生物信息學(xué)分析

CyHV-3 ORF57序列在CyHV-3的基因組中序列范圍為99 382～100 830，大小為1 449 bp。該序列編碼的多肽由473個氨基酸殘基組成，其中含量較多的氨基酸為丙氨酸(Ala 10.8%)和天冬氨酸(Asp 8.9%)，含量較少的是色氨酸(Trp 1.5%)，并且沒有吡咯賴氨酸(Pyl)和硒半胱氨酸(Sec)(圖1-A)， 其中帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp + Glu)為71，帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg + Lys)為59。親/疏水性預(yù)測結(jié)果表明(圖1-B)，ORF57的多肽鏈之中，主要有4個疏水區(qū)，分別在其氨基酸序列的75～90位、96～115位、132～144位和404～421位，疏水性最高值是2.200，最低值是-3.200，并且親水區(qū)明顯多于疏水區(qū)，說明ORF57蛋白應(yīng)是親水蛋白。TMHMM跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果顯示，ORF57編碼的多肽鏈中沒有跨膜區(qū)域，所有區(qū)域都在膜外，是個膜外蛋白(圖1-C)，并且該多肽鏈并沒有信號肽序列(圖1-D)。

A，ORF57氨基酸序列的組成分析；B，ORF57氨基酸序列的親/疏水性分析；C，TMHMM程序?qū)RF57氨基酸序列的跨膜區(qū)預(yù)測；D，信號肽預(yù)測。A， Composition analysis of ORF57 amino acid sequence； B， Affinity/hydrophobicity analysis of ORF57 amino acid sequence； C， Prediction of transmembrane region of ORF57 amino acid sequence by TMHMM； D， Prediction of signal peptide.圖1 ORF57氨基酸序列的組成分析、親/疏水性分析以及跨膜區(qū)和信號肽的預(yù)測Fig.1 ORF57 amino acid sequence composition analysis， affinity/hydrophobicity analysis and prediction of transmembrane domain and signal peptide

根據(jù)NetPhos 3.1在線分析結(jié)果顯示，當(dāng)閾值為0.5時，ORF57的氨基酸序列中一共有47個磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)分別為絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸(圖2)。Psipred在線程序?qū)yHV-3 ORF57二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果表明，ORF57編碼氨基酸中含有50.53%的α-螺旋、9.94%的-β折疊、4.65%的β-轉(zhuǎn)角以及34.88%的無規(guī)則卷曲(圖3-A)。

圖2 CyHV-3ORF57氨基酸序列的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig.2 Prediction of phosphorylation site of CyHV-3ORF57 amino acid sequence

通過尋找與ORF57多肽鏈具有較高同源性的已知3D結(jié)構(gòu)模型，構(gòu)建了ORF57多肽鏈3D結(jié)構(gòu)，主要包含α-螺旋和無規(guī)則卷曲(圖3-B)。

h，α-螺旋；e，β-折疊；t，β-轉(zhuǎn)角；c，無規(guī)則卷曲。h， α-helix； e， β-sheet； t， β-turn； c， Random coil.圖3 CyHV-3 ORF57蛋白的二級結(jié)構(gòu)(A)和三級結(jié)構(gòu)(B)預(yù)測Fig.3 Secondary structure (A) and tertiary structure (B) of CyHV-3 ORF57 protein

2.2 CyHV-3 ORF57序列擴(kuò)增、克隆及鑒定

由圖4-A可知以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增出1 449 bp的目的片段；對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果顯示：單酶切可見一條大小約為5 000 bp的線性條帶；雙酶切可見兩條線性條帶，與載體和目的片段大小一致(圖4-B)。結(jié)果表明，CyHV-3 ORF57序列已成功連接到pMD19-T載體上。

A圖中：M，DNA Marker 10000；1，ORF57序列擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 449 bp；2，陰性對照。B圖中：M，DNA Marker 10000；1，pMD19-T-CyHV-3-ORF57雙酶切鑒定；2，pMD19-T-CyHV-3-ORF57單酶切鑒定。In Fig. A： M， DNA Marker 10000； 1， ORF57 amplification product； 2， Negative control. In Fig. B， M， DNA Marker 10000； 1， pMD19-T-CyHV-3-ORF57 double digestion identification； 2， pMD19-T-CyHV-3-ORF57 single digestion identification.圖4 CyHV-3 ORF57序列的PCR擴(kuò)增和T載體重組克隆質(zhì)粒鑒定Fig.4 The PCR amplication result of the CyHV-3 ORF57 sequence and identification of cloing plasmid

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

重組原核表達(dá)質(zhì)粒酶切和測序結(jié)果說明，CyHV-3-ORF57序列已經(jīng)成功連接到pET-32a(+)載體上。結(jié)果顯示：單酶切可見一條大小約為6 000 bp的線性條帶；雙酶切可見兩條大小分別約為2 692 bp和1 449 bp的線性條帶，與載體和目的片段大小一致(圖5)。

1、2，pET-32a(+)；3、4，pMD19-T-CyHV-3-ORF57雙酶切。1， 2， pET-32a (+)； 3， 4， pMD19-T-CyHV-3-ORF57 double digestion.圖5 CyHV-3-ORF57重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.5 Digestion identification of CyHV-3-ORF57 recombinant expression plasmid

2.4 重組蛋白ORF57的表達(dá)、純化及鑒定

經(jīng)SDS-PAGE鑒定得到大小約為75 ku的蛋白條帶，符合預(yù)期的目的蛋白大??；結(jié)果表明，重組蛋白ORF57以包涵體形式存在(圖6)。獲得純化的重組蛋白ORF57(圖7-A)。純化后的重組蛋白經(jīng)Western blotting分析表明能與兔抗6×His抗血清和山羊抗兔IgG-HRP特異性結(jié)合(圖7-B)。

M，蛋白質(zhì)Marker；1、2，IPTG誘導(dǎo)的BL21-pET32a菌液的上清；3、4，IPTG誘導(dǎo)的BL21-pET32a菌液的沉淀。M， Protein Marker； 1， 2， Induced supernatant of BL21-pET32a by IPTG； 3， 4， Induced precipitation of BL21-pET32a by IPTG.圖6 重組蛋白ORF57的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.6 Expression of recombinant protein ORF57

A圖中：M，蛋白質(zhì)Marker；1，純化所得目的蛋白條帶。B圖中：M，蛋白質(zhì)Marker；1，目的蛋白免疫印跡。In Fig. A： M， Protein Marker； 1， Purified protein. In Fig. B： M， Protein Marker； 1， Target protein.圖7 重組蛋白ORF57的純化和Western-blot驗(yàn)證Fig.7 Purification and Western-blot analysis of ORF57

2.5 亞單位疫苗對鯉魚的免疫保護(hù)

采用Kaplan-Meier方法分析的存活數(shù)據(jù)表明，PBS組在攻毒第2天后出現(xiàn)大量死亡且最后存活率為10%，pET-32a(+)組的為15%，rpORF組為65%(圖8)。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，重組蛋白ORF57組魚類存活率顯著高于PBS組和pET-32a(+)組(<0.05)，pET-32a(+)組與PBS組結(jié)果相似(圖8)。

圖8 攻毒后的累計(jì)存活率Fig.8 Cumulative survival rate after infection

2.6 血清抗體檢測

血清抗體檢測結(jié)果表明，在7～42 d，重組蛋白ORF57疫苗組的抗體水平顯著高于PBS組、佐劑組和pET-32a(+)空載組(<0.05)。PBS組自始至終無明顯變化，抗體水平最低。而佐劑組在7～14 d升高，21 d后開始下降，維持與PBS相同的水平。pET-32a(+)空載組抗體水平在7～14 d升高后下降，28～42 d與PBS組相似。不同的是，重組蛋白ORF57疫苗組的抗體水平顯著升高。重組蛋白450 nm的吸光度保持在1.0左右，28 d達(dá)到峰值，35 d開始下降(圖9)。

不同柱上沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The bars without the same lowercase letters indicated the significant difference(P<0.05).圖9 ELISA法檢測鯉魚血清抗體水平Fig.9 The carp serum antibody levels detected by ELISA

3 討論

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷擴(kuò)大和產(chǎn)量的不斷增長，魚類養(yǎng)殖密度不斷增加，出現(xiàn)了許多水產(chǎn)病害，嚴(yán)重?fù)p害了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，尤其是病毒性病害。目前，疫苗已成為控制水產(chǎn)養(yǎng)殖中病毒感染的一種更有效、安全、綠色的干預(yù)手段。根據(jù)制備方法和生產(chǎn)方式的不同，可分為減毒疫苗、亞單位疫苗、滅活疫苗等傳統(tǒng)疫苗和DNA疫苗等新型疫苗。

減毒疫苗又稱為活疫苗，在防治過程中可能會因?yàn)槔^發(fā)性突變導(dǎo)致毒力的逆轉(zhuǎn)，具有潛在的風(fēng)險，并且在某些情況下，活疫苗可導(dǎo)致自身免疫力較差的個體出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥；滅活疫苗具有安全性好，無毒性或毒性較弱，易制備等優(yōu)點(diǎn)，但其存在滅活制備時部分抗原受到破壞而導(dǎo)致免疫效果不理想，以及不具備交叉保護(hù)效果造成免疫失敗的問題；而亞單位疫苗采用一定的方法只保留有效抗原成分，被保留下來的抗原成分具有穩(wěn)定的免疫原性。目前在水生動物領(lǐng)域也已經(jīng)報道了一些針對草魚和鯉魚的亞單位疫苗。作為最有前途的疫苗之一，亞單位疫苗和DNA疫苗等基因工程疫苗由于具有保護(hù)性免疫原的基礎(chǔ)，有更安全、更獨(dú)立于血清型的特點(diǎn)。因此，疫苗保護(hù)性的鑒定對于開發(fā)有效的基因工程疫苗至關(guān)重要。

CyHV-3因其高致病性及傳染性，造成錦鯉和鯉魚養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。CyHV-3 ORF57編碼必需的毒力因子，是CyHV-3結(jié)構(gòu)和功能特性研究最為深入的囊膜蛋白之一，研究表明，在ORF57序列缺失的情況下，病毒毒力降低，ORF57缺失病毒可作為減毒疫苗候選。一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)ORF57在皰疹病毒中相對保守，包括鯉魚皰疹病毒Ⅰ型(CyHV-1)、鯉魚皰疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)、鯉魚皰疹病毒Ⅲ型(CyHV-3)和鰻魚皰疹病毒Ⅰ型(AngHV-1)。在前3種皰疹病毒中，ORF57中的氨基酸序列相似性在67.5%～72.4%。在本研究中，利用生物信息學(xué)方法對ORF57序列的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行分析，探討其生物學(xué)功能。結(jié)果表明，ORF57編碼的多肽鏈含有473個氨基酸殘基，其中帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp + Glu)為71，帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg + Lys)為59。在跨膜區(qū)的預(yù)測中，結(jié)果顯示，ORF57并沒有跨膜區(qū)，其氨基酸殘基都在外，證明其是膜外蛋白，位于外膜的蛋白很大一部分都具有良好的免疫原性。

選擇ORF57作為抗原基因，設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增ORF57序列。通過克隆、酶切和測序鑒定目的基因。將目的基因連接到pET-32a(+)表達(dá)載體上，用IPTG誘導(dǎo)ORF57的表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA柱親和層析純化，純化后的蛋白經(jīng)Western印跡檢測。Western blot結(jié)果顯示，重組蛋白ORF57與兔抗-6×His抗血清分別有特異性反應(yīng)，并顯示一條由ORF57序列、His-tag序列和部分表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)序列組成的預(yù)測帶，這些結(jié)果表明，重組蛋白ORF57在體外得到了正確的表達(dá)，能夠在鯉魚體內(nèi)提供保護(hù)，并具有抗原性，可作為疫苗開發(fā)的候選免疫原。

另外，血清抗體水平的測定是評價疫苗效果的直接方法。在本研究中，檢測了PBS、佐劑、pET-32a(+)和ORF57治療組的血清抗體水平。免疫7 d后鯉魚血清抗體水平提高，免疫28 d后達(dá)到峰值，結(jié)果表明，重組蛋白ORF57可顯著提高血清抗體水平，ORF57亞單位疫苗具有良好的免疫原性。此外商業(yè)佐劑在早期也有增強(qiáng)免疫的效果。通過計(jì)算存活率來評估亞單位疫苗對CyHV-3感染的有效性，鯉魚免疫28 d后CyHV-3強(qiáng)毒攻毒具有75%的存活率，ORF57亞單位疫苗組鯉魚的存活率顯著高于PBS和pET-32a(+)組，證實(shí)重組蛋白ORF57亞單位疫苗對CyHV-3的感染具有免疫保護(hù)性。

綜上所述，以O(shè)RF57和商品佐劑MontanideISA 763 AVG制成的亞單位疫苗注射免疫可提高鯉魚的抗體水平和對CyHV-3的免疫保護(hù)率。ORF57作為候選抗原，可提高鯉魚抗CyHV-3感染的抗體水平和存活率。本研究結(jié)果豐富了CyHV-3 ORF57的分子特征和系統(tǒng)發(fā)育信息，ORF57亞單位疫苗組鯉魚的存活率顯著高于對照組，表明ORF57有望作為亞單位疫苗使用。然而，要了解這種疫苗的實(shí)際臨床應(yīng)用效果，還需要進(jìn)一步的實(shí)踐。