氯通道抑制劑緩解栽培大豆鹽傷害的離子特征

孟 娜，薛 輝，魏 明，魏勝華

(1.安徽工程大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2. 安徽珩戍林業(yè)規(guī)劃設(shè)計(jì)有限公司，安徽 蕪湖 241000)

作物產(chǎn)量高低不僅受遺傳因素控制，還受營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境因素影響。土壤鹽漬化已成為導(dǎo)致全球可利用耕地日益減少、限制作物產(chǎn)量和品質(zhì)提高的主要非生物逆境之一，全球有超過(guò) 8 億 hm的土地受鹽害影響，占全部土地面積的6%。礦質(zhì)元素是植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)或新陳代謝的基本組成成分，植物良好的生長(zhǎng)和發(fā)育依賴于礦質(zhì)元素的均衡供應(yīng)，任何一種元素的匱乏或過(guò)剩，都將導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育異常。大豆[( L).Merr.]起源于中國(guó)，是我國(guó)主要農(nóng)作物之一，屬中度鹽敏感的“忌氯植物”，其鹽害作用主要由Cl造成。鹽脅迫打破細(xì)胞內(nèi)離子平衡，引起離子損傷、養(yǎng)分缺失和細(xì)胞代謝紊亂，抑制植物光合作用，阻礙了植株的正常生長(zhǎng)和發(fā)育，因此，維持離子內(nèi)環(huán)境平衡對(duì)于植物細(xì)胞應(yīng)對(duì)高鹽環(huán)境至關(guān)重要。維持細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)并不是某一種元素單方面作用，而是多種元素共同作用的結(jié)果，同時(shí)也取決于植物調(diào)控離子流(流入和流出)的能力，然而，目前有關(guān)大豆植物細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)的研究多集中在Na和部分大量元素，忽略了Cl、元素與元素之間，以及元素整體的變化。植物離子組學(xué)能夠定量、精準(zhǔn)地反映某種環(huán)境刺激下植物體產(chǎn)生的無(wú)機(jī)化學(xué)響應(yīng)，特別是高通量的元素分析手段的出現(xiàn)，使得同時(shí)定量分析植物多個(gè)元素的含量成為可能，為系統(tǒng)研究植物體內(nèi)離子的動(dòng)態(tài)平衡提供重要的研究途徑。因此，明晰鹽脅迫下植物離子的響應(yīng)特征，為揭示栽培大豆耐鹽機(jī)制提供全新的視角和科學(xué)的理論依據(jù)。

氯(Cl)是植物生長(zhǎng)和發(fā)育所必需的首要微量元素，主要分布于植物的莖稈和葉片等營(yíng)養(yǎng)器官，參與維持細(xì)胞滲透壓和電荷平衡、氣孔開(kāi)閉、光合作用中光系統(tǒng)Ⅱ水的光解放氧反應(yīng)等生理過(guò)程。氯在土壤和植物體內(nèi)主要以Cl形式存在，Cl通過(guò)共質(zhì)體(主導(dǎo))和質(zhì)外體途徑進(jìn)入根細(xì)胞并向木質(zhì)部運(yùn)輸，在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中需借助細(xì)胞膜上的陰離子通道或運(yùn)輸?shù)鞍?。目前已在擬南芥、水稻、馬鈴薯、玉米、菠菜、煙草、大豆中克隆到Cl通道基因，其中大豆氯離子通道基因(1)編碼蛋白定位于液泡膜，鹽脅迫下可把細(xì)胞質(zhì)中過(guò)量的Cl轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡內(nèi)累積，對(duì)維持和重建體內(nèi)Cl穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。植物根部通過(guò)木質(zhì)部薄壁細(xì)胞質(zhì)膜上的3種Cl通道，即木質(zhì)部慢速激活陰離子通道(X-SLAC)、木質(zhì)部快速激活陰離子通道(X-QUAC)和木質(zhì)部?jī)?nèi)向整流陰離子通道(X-IRAC)，調(diào)控Cl向?qū)Ч芎偷厣喜糠洲D(zhuǎn)運(yùn)。在此跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中Cl對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑較敏感，常用的Cl通道抑制劑主要有Zn、蒽-9-羧酸(9-AC)、尼氟滅酸(NFA)等，其中Zn是超極化激活型Cl通道(內(nèi)流Cl通道)的抑制劑，外施Zn均可提高大豆、煙草和甘薯等“氯敏感植物”的耐氯/鹽性，而且Zn和NFA對(duì)大豆和甘薯幼苗耐鹽/氯性的作用效果是一致的，雖然9-AC對(duì)大豆和甘薯幼苗耐鹽/氯性的影響沒(méi)有報(bào)道，但在煙草中Zn、9-AC和NFA均表現(xiàn)為能夠緩解鹽脅迫對(duì)煙草幼苗的傷害。目前對(duì)Cl通道抑制劑的研究主要集中在對(duì)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的啟閉、電生理效應(yīng)和離子吸收等生理指標(biāo)的研究，從元素水平層面探究Cl通道抑制劑緩解植物鹽傷害作用尚鮮有報(bào)道。

綏農(nóng)35是黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院綏化分院以綏農(nóng)10為母本，綏農(nóng)02-315為父本，經(jīng)有性雜交、系譜法選育而成的大豆新品種，2012年2月經(jīng)黑龍江省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定推廣。本文選擇綏農(nóng)35品種為試材，選擇Zn、9-AC和NFA 3種Cl通道抑制劑，將有關(guān)生理指標(biāo)、解剖結(jié)構(gòu)和離子組相結(jié)合，探討鹽脅迫下外加Zn對(duì)栽培大豆離子穩(wěn)態(tài)影響，旨在為栽培大豆植物拮抗鹽脅迫研究提供離子組依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 鹽濃度篩選

試材為栽培大豆[. (L). Merr.]品種綏農(nóng)35(材料由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院綏化所提供)，當(dāng)大豆幼苗第一片三出復(fù)葉完全展開(kāi)后，將幼苗隨機(jī)分成對(duì)照組(Control)和鹽處理組(NaCl)2組，對(duì)照組大豆幼苗培養(yǎng)在1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液；鹽處理組又進(jìn)一步分成3小組，分別培養(yǎng)在含100、140和200 mmol·LNaCl的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中。營(yíng)養(yǎng)液每2 d更換1次，鹽脅迫處理8 d后，觀察拍照比較大豆幼苗的生長(zhǎng)情況，選擇合適的鹽脅迫濃度。

1.2 材料培養(yǎng)和處理

選擇140 mmol·LNaCl為鹽脅迫處理濃度，參照屈婭娜等選擇20 μmol·L作為Cl通道抑制劑濃度。當(dāng)大豆幼苗第一片三出復(fù)葉完全展開(kāi)后，幼苗隨機(jī)分成5組：第1組大豆幼苗繼續(xù)培養(yǎng)在1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(Control)；第2組大豆幼苗培養(yǎng)在含140 mmol·LNaCl的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(NaCl)；第3組大豆幼苗培養(yǎng)在含140 mmol·LNaCl的1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液加20 μmol·L氯化鋅(NaCl+Zn)；第4組大豆幼苗培養(yǎng)在含140 mmol·LNaCl的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液加20 μmol·L蒽-9-羧酸(NaCl+9-AC)；第5組大豆幼苗培養(yǎng)在含140 mmol·LNaCl的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液加20 μmol·L尼氟滅酸(NaCl+NFA)。營(yíng)養(yǎng)液每2 d更換一次，鹽脅迫處理8 d，觀察拍照比較大豆植株幼苗表型，選擇合適的Cl通道抑制劑。

1.3 植株的形態(tài)學(xué)特征參數(shù)

參考孫啟高等觀察大豆葉片長(zhǎng)度、寬度、面積和周長(zhǎng)。用掃描儀(分辨率300 dpi)對(duì)大豆第一片三出復(fù)葉的頂葉進(jìn)行掃描；用S-Viewer軟件測(cè)定葉長(zhǎng)、葉寬和葉周長(zhǎng)，葉長(zhǎng)是指平行于主脈最長(zhǎng)段、葉寬是指垂直主脈最寬段，葉周長(zhǎng)是指葉片邊緣一周的長(zhǎng)度；使用Li-3000型葉面積儀測(cè)定葉面積，不包括葉柄部分；用直尺測(cè)量主根長(zhǎng)和株高。重復(fù)3次。

1.4 根部解剖結(jié)構(gòu)

根部解剖結(jié)構(gòu)采用石蠟制片法。重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)觀察5個(gè)樣片中的10個(gè)視野。

和Cl-含量的測(cè)定

Cl含量的測(cè)定采用分光光度法；NO含量參照王學(xué)奎的測(cè)定方法。

1.6 葉綠素含量和Fv/Fm值的測(cè)定

采用丙酮/乙醇混合液法測(cè)定葉片中葉綠素含量；/測(cè)定參照Meng等的測(cè)定方法。所測(cè)葉片均選自大豆第二對(duì)三出復(fù)葉。

1.7 離子組測(cè)定方法

參照Ardini等方法略有改動(dòng)，大豆幼苗用去離子水清洗吸干，將葉部與植株分開(kāi)，105 ℃烘箱殺青15 min，于80 ℃烘干至恒重，磨碎后過(guò)30目篩。精密稱取0.5 g過(guò)篩后的樣品，加入4 mL硝酸，于消解罐80 ℃預(yù)氧化1 h，放入微波消解儀消解后加超純水定容至50 mL待測(cè)，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)測(cè)定葉片9種元素(K、 Na、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn和Mo)含量。

1.8 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行均值、標(biāo)準(zhǔn)差和差異顯著性分析，不同字母表示數(shù)據(jù)間的差異顯著性(<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫濃度和氯通道抑制劑的篩選

大豆幼苗在正常營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)旺盛、莖葉繁茂、且葉色濃綠，而經(jīng)不同濃度NaCl處理后，植株均表現(xiàn)出矮小和葉面積減小，100 mmol·LNaCl處理8 d后植株生長(zhǎng)良好，受鹽傷害不明顯；140 mmol·LNaCl處理后，幼苗生長(zhǎng)較對(duì)照組明顯矮小，下部葉片已開(kāi)始出現(xiàn)干枯現(xiàn)象，但幼苗仍能正常生長(zhǎng)；200 mmol·LNaCl處理8 d后植株葉片大量枯萎和脫落，無(wú)法正常生活(圖1-A)，因此，后續(xù)試驗(yàn)的鹽脅迫濃度選擇140 mmol·L。

對(duì)照組大豆幼苗生長(zhǎng)旺盛，莖葉繁茂，葉色濃綠；經(jīng)140 mmol·LNaCl 處理8 d后，植株矮小、葉面積減小，低部葉片有干枯、脫落現(xiàn)象；外加Zn植株生長(zhǎng)有所好轉(zhuǎn)，葉片無(wú)干枯和脫落現(xiàn)象；外加9-AC處理，與單獨(dú)鹽脅迫處理組比較，大豆幼苗矮小，生長(zhǎng)明顯受阻礙；而外加NFA處理4～5 d后大豆幼苗開(kāi)始干枯，甚至死亡(圖1-B)。因此，通過(guò)對(duì)大豆植株表型的觀察比較，本研究后續(xù)試驗(yàn)選擇Zn作為氯離子通道抑制劑。

從左到右依次是A ( Control， 100、140和200 mmol·L-1NaCl )， B (Control， NaCl， Zn2+， 9-AC和NFA)。From left to right， A (Control， 100， 140 and 200 mmol·L-1NaCl)， B (Control， NaCl， Zn2+， 9-AC and NFA).圖1 不同鹽濃度(A)和氯離子通道抑制劑(B)栽培大豆綏農(nóng)35植株表型比較Fig.1 The appearance of Glycine max cultivar Suinong 35 under different concentrations of NaCl treatments (A) and different chloride channel inhibitors (B)

2.2 大豆植株的形態(tài)參數(shù)

鹽脅迫下，栽培大豆品種綏農(nóng)35葉部形態(tài)參數(shù)、根長(zhǎng)和株高數(shù)值與對(duì)照組相比較均下降，下降百分比分別為葉片長(zhǎng)度37.2%、葉片寬度33.8%、葉片面積56.2%、葉片周長(zhǎng)48.9%、根長(zhǎng)22.9%和株高38.7%；而鹽處理外加Zn與單獨(dú)鹽處理相比，以上各參數(shù)的數(shù)值有所回升，上升的百分比分別為葉片長(zhǎng)度17.7%、葉片寬度20.7%、葉片面積44.6%、葉片周長(zhǎng)44.2%、根長(zhǎng)37.9%和株高18.4%；當(dāng)鹽處理外加Zn與對(duì)照組相比較時(shí)，下降百分比為葉片長(zhǎng)度26.1%、葉片寬度20.1%、葉片面積36.7%、葉片周長(zhǎng)26.3%和株高27.4%，而根長(zhǎng)達(dá)到對(duì)照組水平(表1)。

表1 不同處理下栽培大豆品種綏農(nóng)35植株的形態(tài)參數(shù)比較

2.3 大豆植株根部解剖結(jié)構(gòu)

對(duì)照組大豆幼苗根部表皮細(xì)胞較小，排列緊密，橫切面呈長(zhǎng)方形；次生木質(zhì)部導(dǎo)管平均孔徑較大；皮層細(xì)胞間隙大，所占根部的比例較小，而中柱占根部的比例較大。鹽脅迫下，根部橫切面整體形態(tài)及維管柱細(xì)胞都發(fā)生細(xì)胞變小、收縮；表皮細(xì)胞皺縮、向內(nèi)凹陷；次生木質(zhì)部導(dǎo)管平均直徑較?。黄铀几勘壤^大，而維管柱占根部的比例較小。鹽脅迫外加Zn，表皮細(xì)胞排列較整齊，向內(nèi)凹陷減少；根平均直徑、皮層平均厚度和中柱平均直徑均回升，介于對(duì)照組與鹽脅迫組之間(圖2和表2)。

從左到右依次是：Control、NaCl、NaCl+ Zn2+。A，根部解剖結(jié)構(gòu)特征；B，根部表皮細(xì)胞。px，初生木質(zhì)部；sx，次生木質(zhì)部；sp，次生韌皮部；st，中柱；c，皮層；ec，表皮細(xì)胞。From left to right： Control， NaCl， NaCl+ Zn2+， respectively. A， Cross-sections of roots； B， Epidermis cell of roots. px， Primary xylem； sx， Second xylem； sp， Second phloem； st， Stele； c， Cortex； ec， Epidermis cell.圖2 不同處理下栽培品種綏農(nóng)35植株根部解剖結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)參數(shù)特征比較Fig.2 Comparison of anatomical structures and parameters of roots in Glycine max cultivar Suinong 35 under different treatments

表2 不同處理下栽培大豆品種綏農(nóng)35根部結(jié)構(gòu)參數(shù)

與對(duì)照組相比，鹽脅迫下大豆幼苗根部除了皮層/根直徑比由20.90%上升至27.56%外，其他參數(shù)值均下降，下降百分比分別為根直徑42.3%、皮層厚度23.9%、次生導(dǎo)管直徑19.3%和中柱直徑52.2%，中柱/根直徑比由51.89%下降至42.95%；外加Zn后，各指標(biāo)下降幅度減小，數(shù)值有所回升，根直徑和中柱直徑下降百分比分別為19.8%和32.0%，特別是皮層厚度甚至回升至對(duì)照組水平；另外，加入Zn對(duì)次生導(dǎo)管直徑和皮層/根直徑比影響不大(表2)。

2.4 植株葉部葉綠素含量和Fv/Fm值比較

與對(duì)照組相比較，鹽脅迫下大豆幼苗葉部總?cè)~綠素含量和/均顯著下降，下降百分比分別為28.5%和2.6%，外加Zn其下降百分比分別為16.1%和1.6%；與鹽脅迫相比，外源添加Zn后，總?cè)~綠素含量和/均有所回升，回升幅度為17.1%和1.0%(圖3)。

數(shù)據(jù)均3個(gè)重復(fù)平均值，不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Statistical data were expressed as of three replicates. Means in bars with different letters indicated significant differences (P<0.05) among treatments according to Duncan’s multiple-range test.The same as below.圖3 不同處理下栽培大豆綏農(nóng)35植株葉部總?cè)~綠素含量(A)和Fv/Fm (B)值Fig.3 Total chlorophyll contents (A) and Fv/Fm value (B) of Glycine max cultivar Suinong 35 under different treatments

2.5 大豆植株和Cl-含量比較

圖4 不同處理下測(cè)定栽培大豆綏農(nóng)35植株根、莖和葉部Cl-(A)和含量Fig.4 Contents of Cl-(A) and NO3-(B) of roots， stems and leaves in Glycine max cultivar Suinong 35 under different treatments

表3 不同處理下栽培大豆綏農(nóng)35葉部元素含量

2.6 大豆植株葉部離子組響應(yīng)特征

葉部離子組測(cè)定結(jié)果顯示，不同處理組Ca和Mg含量較穩(wěn)定，受外界環(huán)境的影響不大，其他元素(K、Na、Fe、Mn、Cu、Zn和Mo)含量均有變化。與對(duì)照組相比，鹽脅迫下K、Na和Zn含量明顯增加，分別上升了48.7%，1 843.6%和17.5%，F(xiàn)e、Mn和Mo含量分別下降了21.9%、41.1%和43.6%，而Cu變化不大；外加Zn后，K、Na、Zn、Mn和Mo的變化趨勢(shì)與單獨(dú)鹽脅迫處理組相同，只是變化幅度不同，K、Na和Zn含量均分別比對(duì)照組增加了44.1%、1 834.1%和69.7%，Mn和Mo含量的下降百分比分別為21.2%、73.8%，值得注意的是，Cu和Fe在2種處理中變化趨勢(shì)有所不同，單獨(dú)鹽脅迫時(shí)Cu含量變化不大，而外加Zn后增加了53.3%；Fe含量則表現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)，即鹽脅迫下降了21.9%，外加Zn后上升了60.2%。外加Zn與單獨(dú)鹽脅迫相比較，外加Zn對(duì)于K、Na、Ca和Mg均無(wú)明顯變化，對(duì)于微量元素Fe、Mn、Cu、Zn和Mo的影響則較大，其中Mo表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，由鹽脅迫的1.586 mg·kg下降至0.737 mg·kg，下降幅度為53.5%，而Fe、Mn、Cu和Zn含量則均有所提高，其上升幅度分別為105.3%、33.8%、43.6%和44.4%。

3 結(jié)論與討論

作物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)是一個(gè)綜合復(fù)雜的過(guò)程，在高鹽環(huán)境下，植物的結(jié)構(gòu)與代謝均會(huì)做出調(diào)整以適應(yīng)其生長(zhǎng)環(huán)境。將本研究結(jié)果與已報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)資料相比較，發(fā)現(xiàn)鹽/氯逆境外加3種不同的氯通道抑制劑對(duì)不同植物的作用效果不盡相同，Zn對(duì)“氯敏感植物”大豆、甘薯和煙草均表現(xiàn)出有利于緩解鹽/氯傷害，但是NFA對(duì)煙草幼苗的作用效果好于Zn，與本研究中NFA對(duì)大豆幼苗作用效果相反，這可能與研究材料、濃度不同以及抑制劑專一性有關(guān)。

結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ)，鹽脅迫下根部吸收過(guò)量的鹽離子，經(jīng)莖部輸導(dǎo)組織運(yùn)輸至葉部積累并產(chǎn)生離子毒害。植物根系是最先感受土壤逆境脅迫的重要部位，表皮細(xì)胞是對(duì)外界環(huán)境的第一道防線。本研究發(fā)現(xiàn)，外加Zn根部表皮細(xì)胞較完整，能有效阻礙部分鹽離子進(jìn)入根部；根部次生導(dǎo)管數(shù)量和孔徑回升接近對(duì)照組水平，而皮層細(xì)胞厚度減少，這些結(jié)構(gòu)的改變可降低根系總的新陳代謝消耗、減少水分橫向運(yùn)輸?shù)木嚯x，有利于水分和礦質(zhì)元素的吸收和運(yùn)輸。因此，外加Zn通過(guò)改變?cè)耘啻蠖垢拷馄式Y(jié)構(gòu)特征，可調(diào)控對(duì)水分和礦質(zhì)元素的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，并提高栽培大豆幼苗耐鹽脅迫能力。

葉綠素是植物光合作用的重要組成物質(zhì)，葉綠素含量的高低直接影響光合能力的強(qiáng)弱，大豆生物產(chǎn)量與葉綠素含量呈正相關(guān)。最大光化學(xué)效率/是反映PSⅡ活性中心光能轉(zhuǎn)換效率的重要參數(shù)和光抑制程度的良好指標(biāo)，未受逆境時(shí)，植物/值相對(duì)穩(wěn)定，逆境則明顯下調(diào)。商靜等發(fā)現(xiàn)，高氯土壤條件外施Cl通道抑制劑能增加光合色素含量和光合電子傳遞效率，緩解鹽傷害作用。目前有關(guān)鹽脅迫下離子含量和植物代謝之間的相互作用知之甚少，由于光合抑制與Cl濃度的相關(guān)性顯著，鹽脅迫下，栽培大豆葉部Cl含量增加打破原有的離子穩(wěn)態(tài)，葉綠素含量和光合效率的降低，光合作用受到抑制，外加Zn葉部葉綠素含量和/值均較對(duì)照組回升，說(shuō)明外加Zn后大豆光合能力有所提高，從離子組數(shù)據(jù)分析認(rèn)為這可能與葉部重建離子穩(wěn)態(tài)和離子平衡有關(guān)。