飼料中添加蠅蛆蛋白對中華鱉肝和血清免疫代謝應(yīng)答的影響

梁倩蓉，鄭天倫，陳小明，朱凝瑜，鄭曉葉，何潤真，曹飛飛，薛輝利，丁雪燕

(浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站 浙江省漁業(yè)檢驗(yàn)檢測與疫病防控中心，浙江 杭州 310023)

中華鱉()是我國南方重要的名特水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，廣泛養(yǎng)殖于浙江、廣東、湖南等地，因具有較高營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值，深受消費(fèi)者和養(yǎng)殖戶青睞。中華鱉攝食營養(yǎng)需求主要包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類、維生素和礦物質(zhì)等，對飼料蛋白水平尤其是動物蛋白要求較高。目前中華鱉飼料仍較依賴進(jìn)口魚粉作為其蛋白來源，進(jìn)口魚粉也將成為制約其養(yǎng)殖發(fā)展的一大重要因素。受各種因素影響進(jìn)口魚粉價格居高不下，魚粉替代方面的研究將逐漸成為熱門研究課題。

昆蟲繁殖速度快、食性廣泛、食物轉(zhuǎn)化率高，且飼養(yǎng)空間小，營養(yǎng)豐富，是緩解和改善飼料中動物性蛋白的重要蛋白質(zhì)資源。蠅蛆是一種優(yōu)質(zhì)的動物蛋白源，不僅蛋白含量高(干蛆粗蛋白含量可高達(dá)60%以上)，含有豐富的礦物質(zhì)和維生素，同時其體內(nèi)含有抗菌肽、幾丁質(zhì)和凝集素等具有免疫調(diào)節(jié)功能的物質(zhì)，是飼料中動物性蛋白的良好替代物，但作為免疫增強(qiáng)劑在水產(chǎn)動物中的應(yīng)用研究仍較少。轉(zhuǎn)錄組測序可快速全面獲取某一物種生物組織或細(xì)胞在某一狀態(tài)下幾乎所有轉(zhuǎn)錄本和基因序列的集合，基于大數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析可揭示特定的生物學(xué)過程，目前已被廣泛用于識別許多水生動物對環(huán)境或致病性應(yīng)激源響應(yīng)的關(guān)鍵基因和通路，有助于了解深層的應(yīng)答機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)目前已應(yīng)用于中華鱉的相關(guān)研究，包括脂多糖刺激下的腸道分子免疫反應(yīng)、雜交鱉與親本免疫和生長差異基因表達(dá)、在急性冷脅迫下生理和免疫反應(yīng)，以及感染出血性綜合征病毒(TSHSV)后中華鱉肺組織發(fā)生的免疫應(yīng)答，而鮮有研究報道基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析蠅蛆蛋白作為免疫調(diào)節(jié)劑添加飼料后對中華鱉免疫代謝應(yīng)答的影響和作用。

本研究對投喂不同含量蠅蛆蛋白添加飼料后中華鱉存活率和平均體增重率進(jìn)行統(tǒng)計，測定血清6種常見非特異性免疫酶活性，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)比較投喂蠅蛆蛋白添加飼料后中華鱉免疫代謝相關(guān)基因差異轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況，擬從存活率、體增重率、非特異性免疫酶活性、基因表達(dá)等多方面揭示蠅蛆蛋白作為飼料添加劑對中華鱉免疫和代謝系統(tǒng)的影響變化和潛在機(jī)理，以期為蠅蛆蛋白作為中華鱉飼料添加劑有效性評價提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 蠅蛆蛋白添加飼料制備

無菌蠅蛆蛋白粉由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院朱鳳香課題組提供。常規(guī)飼料配方：魚粉36%、膨化大豆2%、發(fā)酵豆粕32%、酵母4%、淀粉22%、多維元素1.2%、多礦元素1.2%、磷酸氫二鈣1.2%、氯化膽堿0.4%。

將蠅蛆蛋白粉與中華鱉常規(guī)粉狀飼料分別按質(zhì)量比5∶95和10∶90進(jìn)行混合，做成軟顆粒飼料用于中華鱉飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 動物飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用中華鱉稚鱉900只，平均體重(20±2)g，由湖州德清一家省級中華鱉良種場繁育，放置在25 ℃水泥池中馴化暫養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖和樣品采集

將900只中華鱉隨機(jī)均等分為常規(guī)飼料組(G1)、5%蠅蛆蛋白添加飼料組(G2)和10%蠅蛆蛋白添加飼料組(G3)，每組300只。在相同實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件下，分別飼喂相應(yīng)飼料(投喂量為甲魚體重的2%)，3個月后統(tǒng)計存活率，并稱量體重，計算平均體增重率。重復(fù)3次，計算公式如下：

存活率(%)=100×試驗(yàn)結(jié)束中華鱉數(shù)/試驗(yàn)初始中華鱉數(shù)；

平均體增重率(%)=100×(試驗(yàn)結(jié)束鱉均重-試驗(yàn)初始鱉均重)/試驗(yàn)鱉初均重。

3個投喂組每組隨機(jī)選取5只中華鱉，處死后采血制備混合血清用于測定非特異性免疫酶活性，并將肝樣品分別混合保存于液氮中用于轉(zhuǎn)錄組測序和實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)，其中，非特異性免疫酶活性送南京建成生物工程研究所測定，轉(zhuǎn)錄組測序送杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司分析。

1.2.2 測序、基因組裝與注釋

實(shí)驗(yàn)流程按照Illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格執(zhí)行。肝總RNA使用Trizol試劑(Invitrogen，美國)按照操作說明書提取，經(jīng)Bioanalyzer 2100和RNA 1000 Nano LabChip試劑盒(Agilent，美國)質(zhì)檢合格后，使用連接有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA。以富集的mRNA隨機(jī)打斷成的短片段為模板，用6堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA，隨后RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ進(jìn)行二鏈cDNA合成。AMPure XP磁珠純化雙鏈產(chǎn)物，T4 DNA聚合酶和Klenow DNA聚合酶修復(fù)黏性末端，3′末端加堿基A并加接頭，磁珠選擇片段后用USER酶降解含有U的cDNA第二鏈，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得最終測序文庫。文庫質(zhì)檢合格后采用Illumina Hiseq4000平臺進(jìn)行測序，測序讀長為雙端2×150 bp。

使用cutadapt去除測序接頭，fqtrim過濾掉不合格的序列后得到有效數(shù)據(jù)，用FastQC軟件獲取測序結(jié)果，并進(jìn)行綜合評價，質(zhì)量符合要求的測序數(shù)據(jù)用于Trinity 2.4.0進(jìn)行基因組裝，去冗余去重復(fù)得到高質(zhì)量的unigene。選取美國國家生物技術(shù)信息中心非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(NCBI_nr：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，基因本體論數(shù)據(jù)庫(GO：http：//www.geneontology.org)，京都基因和基因組百科全書(KEGG： http：//www.genome.jp/kegg/)，蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(Pfam：http：//pfam.xfam.org/)，瑞士蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(SwissProt：http：//www.expasy.ch/sprot/)，直系同源蛋白分組比對數(shù)據(jù)庫(eggNOG：http：//eggnogdb.embl.de/)，利用DIAMOND軟件對unigene進(jìn)行相應(yīng)的功能注釋(E-value<0.000 01)。

1.2.3 差異基因表達(dá)分析

利用Salmon軟件計算每百萬映射讀取的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量(TPM)，展示unigene的表達(dá)水平，并利用edgeR包以log2 (fold change)>1或log2 (fold change)<-1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選顯著差異表達(dá)基因(<0.05)?；谝陨辖Y(jié)果進(jìn)行基因GO功能分類和KEGG通路富集分析。

1.2.4 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證此次轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，挑選關(guān)鍵通路中15個重要基因利用qRT-PCR進(jìn)行基因相對表達(dá)水平分析，以-為內(nèi)參基因。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Green I Master mix 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，100 ng cDNA，ddHO補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s， 退火20 s(溫度見表1)，78 ℃ 1 s，40個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用2-△△C法計算基因的相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用Duncan’s多重比較法分析試驗(yàn)結(jié)果差異顯著性(<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加蠅蛆蛋白對中華鱉生長與非特異性免疫活性的影響

投喂3月后，3組中華鱉存活率分別為80.3%、83.7%和87.0%，平均體增重率分別為(294.7±12.6)%、(302.7±10.0)%和(340.0±16.3)%，投喂蠅蛆蛋白添加飼料組的中華鱉養(yǎng)殖成活率和平均體增重率較常規(guī)飼料組高，G3組的平均體增重率與G1組相比顯著升高(<0.05)(圖1)。

G1，常規(guī)飼料組；G2，5%蠅蛆蛋白添加飼料組；G3，10%蠅蛆蛋白添加飼料組。柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。G1， Normal fodder feed group； G2， 5% maggot additive fodder feed group； G3，10% maggot additive fodder feed group. Data marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05.圖1 投喂蠅蛆蛋白添加飼料對中華鱉養(yǎng)殖存活率、平均體增重率的影響Fig.1 Effects of feeding with maggot protein added dietaries on cultivated survival and average body weight gain ratios of Pelodiscus sinensis

隨著蠅蛆蛋白含量的增加，堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶活性均逐漸升高(表2)；與之相反，谷胱甘肽過氧化物酶活性則顯著降低(<0.05)。G3組的超氧化物歧化酶、溶菌酶活性顯著(<0.05)高于G2組和G1組，而G2組和G1組則無顯著差異(>0.05)。

表2 投喂蠅蛆蛋白添加飼料對中華鱉血清生化指標(biāo)的影響

2.2 飼料中添加蠅蛆蛋白對中華鱉基因表達(dá)的影響

本次測序共獲得57 231個N50長度為1 381 bp的高質(zhì)量unigene。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，G2和G1組差異表達(dá)基因(DEGs)有3 882個，2 879個基因上調(diào)表達(dá)，1 003個基因下調(diào)表達(dá)；G3和G1組差異表達(dá)基因有3 624個，2 686個基因上調(diào)表達(dá)，938個基因下調(diào)表達(dá)；G3和G2組差異基因有1 111個，609個基因上調(diào)表達(dá)，502個基因下調(diào)表達(dá)(圖2)。

圖2 三個投喂組差異表達(dá)基因數(shù)量Fig.2 Numbers of differentially expressed genes in three compared groups

2.3 差異表達(dá)基因GO功能分類

對G1、G2和G3組的差異基因進(jìn)行GO功能分類并比較，結(jié)果見表3。這些差異基因功能與細(xì)胞增殖、能量代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等行為關(guān)系密切，不同組間差異基因功能聚集具有一定相似性，均在氧化還原過程，細(xì)胞質(zhì)、膜整合構(gòu)件，ATP結(jié)合功能類群中顯著富集。

表3 差異基因GO功能分類

2.4 差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析

對差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析并比較，由圖3-A可知，G2和G1差異基因KEGG主要富集在補(bǔ)體與凝血級聯(lián)、吞噬體、類固醇激素生物合成等20種通路上；由圖3-B可知，G3和G1差異基因主要富集在補(bǔ)體與凝血級聯(lián)、吞噬體、單純性皰疹病毒感染等20種通路上；由圖3-C可知，G3和G2差異基因主要富集在補(bǔ)體與凝血級聯(lián)、吞噬體、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等20種通路上。分析發(fā)現(xiàn)，不同組間的差異基因均富集在吞噬體、補(bǔ)體與凝血級聯(lián)等通路上，其中G3與G2、G1的差異基因較多富集于免疫應(yīng)答和代謝調(diào)節(jié)相關(guān)通路，包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝和維生素消化與吸收等通路。

A，G1和G2比較；B，G1和G3比較；C，G2和G3比較。下同。A， G1 vs G2； B， G1vs G3； C， G2 vs G3. The same as below.圖3 差異表達(dá)基因KEGG通路富集散點(diǎn)圖Fig.3 Scatterplot of enriched KEGG pathways for differentially expressed genes

2.5 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

選取15個關(guān)鍵通路中的差異表達(dá)基因，通過qRT-PCR對表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖4所示。qRT-PCR與轉(zhuǎn)錄組測序基因表達(dá)變化趨勢基本一致，僅在表達(dá)水平上稍有差異。

圖4 基因表達(dá)量驗(yàn)證Fig.4 Validation of gene expressions

和2是3組間比較均存在差異表達(dá)的基因。其中，測序相對表達(dá)水平均略低于qRT-PCR，與此趨勢相同的還有、61、7、2等基因，而9測序相對表達(dá)水平則略高于qRT-PCR。

3 討論

蠅蛆替代水產(chǎn)飼料中動物性蛋白具有良好的應(yīng)用效果，具有提高水生動物的養(yǎng)殖存活率、體增重率和體內(nèi)非特異性酶活性等潛在作用。何中央等和張海琪等的研究表明，蠅蛆蛋白粉替代中華鱉日本品系常規(guī)飼料中50%的魚粉可提高中華鱉存活率、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶等抗氧化酶活性，但降低了生長率；而程逍妹等則發(fā)現(xiàn)，飼料中添加15%和30%蠅蛆蛋白能顯著提高中華鱉生長率，但也提高了體增重率，降低飼料系數(shù)，以及堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、溶菌酶活性。據(jù)此推測，飼料中添加適量蠅蛆蛋白有促進(jìn)中華鱉生長和提高免疫系統(tǒng)功能的潛在作用。除中華鱉外，學(xué)者在羅非魚和泥鰍等魚類中也進(jìn)行了蠅蛆蛋白替代相關(guān)試驗(yàn)：史東杰等以蠅蛆粉替代羅非魚飼料中的魚粉后，羅非魚肝SOD活性提高，肌肉脂肪沉積量降低；張海濤等研究發(fā)現(xiàn)，蠅蛆蛋白粉添加飼料可以提高泥鰍增重率、特定生長率，并提高SOD、CAT和溶菌酶活性，且蠅蛆蛋白添加比例越高效果越好。

本實(shí)驗(yàn)添加蠅蛆蛋白飼料組的中華鱉存活率、平均體增重率較常規(guī)飼料組顯著升高，除谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著降低外，添加蠅蛆蛋白飼料組的5種酶活性普遍顯著高于常規(guī)飼料組，與張海琪等、程逍妹等的研究結(jié)果相似，表明蠅蛆蛋白的攝入對中華鱉非特異性免疫系統(tǒng)有促進(jìn)作用。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，蠅蛆蛋白添加飼料組與常規(guī)飼料組的差異基因均富集于吞噬體、補(bǔ)體與凝血級聯(lián)等免疫相關(guān)通路，其中10%添加組與5%添加組、常規(guī)飼料組的差異基因還富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，維生素消化與吸收等免疫代謝調(diào)節(jié)相關(guān)通路。

肝富含免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，在抗原及抗原遞呈作用下引起免疫耐受或炎癥的發(fā)生，并有效地調(diào)節(jié)正在進(jìn)行中的免疫反應(yīng)，是中華鱉重要的造血和免疫器官。免疫細(xì)胞的吞噬作用對于吞滅病原體、加工和呈遞抗原并連接先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)之間的反應(yīng)具有重要意義，吞噬體為此生物學(xué)過程中的核心成員。本研究中，與常規(guī)飼料組相比，添加蠅蛆蛋白飼料組的vATP酶、cathepsin酶、NADPH氧化酶、GTP結(jié)合蛋白Rab和抗原肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TAP相關(guān)基因均顯著上調(diào)表達(dá)，這些基因在吞噬體通路中具有重要功能。與5%蠅蛆蛋白添加組、常規(guī)飼料組比較，10%蠅蛆蛋白添加組中主要參與病原識別作用的toll樣受體2基因和參與連接特異性免疫系統(tǒng)、促進(jìn)細(xì)胞免疫和體液免疫的抗原呈遞和基因均顯著上調(diào)表達(dá)，表明中華鱉肝吞噬體通路被顯著激活。由此推測，投喂蠅蛆蛋白具有增強(qiáng)中華鱉肝細(xì)胞吞噬并促進(jìn)特異性免疫系統(tǒng)活化的潛在作用。

補(bǔ)體應(yīng)答是先天性免疫系統(tǒng)中主要效應(yīng)機(jī)制之一，同時也在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中起到重要作用。最新研究表明，補(bǔ)體與凝血級聯(lián)通路在大黃魚、鱘魚、大瀧六線魚、大鯢等水生動物抗病原應(yīng)答中扮演重要角色，在本研究中，投喂蠅蛆蛋白后中華鱉肝此通路許多相關(guān)基因顯著上調(diào)表達(dá)，包括補(bǔ)體系統(tǒng)中核心基因3，經(jīng)典途徑中1，凝集素途徑中2，參與膜攻擊階段的補(bǔ)體成員6、7、8、9等和凝血級聯(lián)中凝血因子5、7、9、10、13，以及纖維蛋白原等基因，表明蠅蛆蛋白的攝入具有通過促進(jìn)中華鱉肝補(bǔ)體途徑中相關(guān)重要因子和凝血級聯(lián)通路中部分凝血因子上調(diào)表達(dá)，從而促進(jìn)補(bǔ)體系統(tǒng)和凝血反應(yīng)活化的潛在作用。細(xì)胞因子是連接先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵細(xì)胞間調(diào)節(jié)因子和動員因子，本研究中腫瘤壞死因子受體超家族成員14、6和白介素受體11等許多細(xì)胞因子受體基因發(fā)生顯著的差異表達(dá)，推測這些基因與中華鱉抗病、抗炎、凋亡等免疫應(yīng)答密切相關(guān)。

肝也是中華鱉重要的消化和代謝器官。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等是構(gòu)成中華鱉營養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)，而維生素在中華鱉肝物質(zhì)代謝中起重要作用，并具有提高免疫蛋白和促進(jìn)膠原蛋白合成的潛在作用。本研究中添加蠅蛆蛋白組中華鱉肝相關(guān)通路中酰胺酶和可溶性維生素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等多個基因上調(diào)表達(dá)，表明蠅蛆蛋白的攝入具有促進(jìn)中華鱉肝蛋白合成和維生素消化吸收的作用。

研究結(jié)果提示，飼料中添加一定量的蠅蛆蛋白具有增強(qiáng)中華鱉免疫應(yīng)答和代謝調(diào)節(jié)的作用，且可能隨著添加量增加作用效果加強(qiáng)，本研究中蠅蛆蛋白添加比例以10%效果最佳，其調(diào)控機(jī)理與吞噬體，補(bǔ)體與凝血級聯(lián)，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，維生素消化與吸收等通路密切相關(guān)。