2，4-表蕓苔素內酯浸種對干旱脅迫下大麥種子萌發(fā)期淀粉代謝的影響

馮彩軍，宋瑞嬌，宋凌宇，張 松，齊軍倉

(石河子大學 農學院，新疆生產建設兵團綠洲生態(tài)農業(yè)重點實驗室，新疆 石河子 832003)

大麥作為一種栽培歷史悠久的禾本科作物，因其環(huán)境適應性強，具有優(yōu)良的食用、飼用和藥用價值而被世界各地廣泛種植。我國西南與西北地區(qū)是大麥的主要種植區(qū)，這些地區(qū)降雨少，經常遭受干旱的影響，尤其是在春季降水量相對較低，蒸散量較大，大麥播種期經常遭遇干旱脅迫，對種子萌發(fā)產生顯著的不良影響，不止會延遲種子的萌發(fā)時間，還會降低種子發(fā)芽率，因此迫切需要尋找途徑來解決干旱脅迫對大麥種子萌發(fā)、生長發(fā)育造成的不良影響。

蕓苔素內酯是一種甾體激素，被認為是第6類植物激素，不僅能促進作物的生長和提高產量，還可以提高作物對各種非生物及生物脅迫的耐受性。2，4-表蕓苔素內酯作為油菜素類固醇的類似物，已被證明可促進并維持抗氧化防御系統(tǒng)、光合作用和激素內環(huán)境穩(wěn)定，以及增加滲透壓和大量營養(yǎng)素積累，進而緩解低溫、高溫，以及鹽和重金屬脅迫對作物生長發(fā)育的抑制作用。雖然前人對蕓苔素內酯在誘導植物抗旱性方面做了諸多研究，但在干旱脅迫下蕓苔素內酯對大麥種子萌發(fā)影響的研究卻比較少。

種子萌發(fā)是植物生命周期中非常脆弱的階段，種胚是異養(yǎng)的，需要營養(yǎng)供給系統(tǒng)來維持生長，直到幼苗達到光合自養(yǎng)狀態(tài)，在谷類作物中，這種供養(yǎng)系統(tǒng)主要是淀粉。大麥中含量最豐富的成分是淀粉，其比例為62%～77%。α淀粉酶和β淀粉酶是負責分解淀粉的主要酶。在萌發(fā)期間，α淀粉酶可在胚乳中動員淀粉，水解淀粉聚合物中的α-1，4-葡聚糖鍵，將直鏈淀粉轉化為麥芽糖和葡萄糖(可溶性糖)?？扇苄蕴堑漠a生與種子萌發(fā)呈正相關，同時，可溶性糖濃度的增加提高了植物對干旱、鹽和極端溫度等非生物脅迫的耐受性。在本研究中，我們用不同濃度的2，4-表蕓苔素內酯處理大麥種子，測定種子的發(fā)芽率、根長、芽長、胚芽鞘長、胚根數(shù)、淀粉酶活性，以及淀粉、可溶性總糖、蔗糖、果糖、葡萄糖含量等指標，采用多個時間段動態(tài)分析其整個發(fā)芽過程，以期明確大麥種子萌發(fā)在干旱脅迫下對蕓苔素內酯的生理響應機制，為解決大麥實際生產中在播種期遭遇干旱脅迫問題提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

粒大飽滿、均勻一致的新啤6號大麥種子，2，4-表蕓苔素內酯可溶性液劑(有效成分含量0.01%)。

1.2 試驗設計

采用單因素隨機區(qū)組設計，共設置7組處理(分別標記為CK、D、E、E、E、E、E)，每組設3次重復。將大麥種子用質量分數(shù)10% NaClO溶液消毒10 min，D、E、E、E、E、E處理分別用0、5、25、50、100、200 μg·L2，4-表蕓苔素內酯溶液浸種24 h，期間隔12 h換1次新鮮的蕓苔素內酯溶液，CK用蒸餾水浸種24 h，然后將浸泡過的種子整齊地擺放到鋪有4層濾紙的發(fā)芽盒中，每盒擺放50粒種子。D、E、E、E、E、E處理發(fā)芽盒內分別加入40 mL的質量分數(shù)23%聚乙二醇-6000溶液(種子萌發(fā)半致死脅迫濃度)進行培養(yǎng)；CK處理發(fā)芽盒內加入40 mL蒸餾水進行培養(yǎng)。所有發(fā)芽盒置放到GZP-250A型智能人工氣候培養(yǎng)箱(南京恒裕電子儀器廠)中，培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照時間為12 h。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 發(fā)芽率和根長、芽長、胚芽鞘長測定

在萌發(fā)72 h后，統(tǒng)計發(fā)芽情況，以胚根達到種子長、胚芽達到種子長度的一半作為種子萌發(fā)的指標。

發(fā)芽率(%)=72 h內能正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100。

選取10株有代表性的大麥幼苗，用蒸餾水快速沖洗干凈，統(tǒng)計根數(shù)，用直尺手動測量根長、芽長、胚芽鞘長。

1.3.2 淀粉酶活性測定

在種子萌發(fā)12、24、36、48、60、72 h，分別從發(fā)芽盒內選取10顆發(fā)芽種子，采用二硝基水楊酸測定還原糖的方法測定淀粉酶活性。測定過程中采用加熱鈍化β淀粉酶，測出α淀粉酶活性，再與非鈍化條件下測定的總活性(α+β)比較，求出β淀粉酶的活性。酶活性定義為在40 ℃、pH值5.6條件下，1 min催化底物釋放1 mg葡萄糖的量為1個酶活性單位(U)。

1.3.3 淀粉含量測定

選取萌發(fā)12、24、36、48、60、72 h的大麥種子，用蒸餾水將種子表面的聚乙二醇沖洗干凈，60 ℃烘干，用磨樣機粉碎，過60目篩(孔徑0.3 mm)，稱取0.1 g樣品測定淀粉含量，測定方法參照文獻[13]并略作修改。該方法測得的直鏈和支鏈淀粉含量均為相對于0.1 g樣品的比例，總淀粉含量為支鏈淀粉含量和直鏈淀粉含量之和，均用百分比表示。

本試驗用Hitachi U-5100紫外分光光度計對直鏈和支鏈淀粉的掃描液進行可見光全波段掃描得到吸收光譜，直鏈淀粉的測定波長λ為644 nm，參比波長λ為416 nm；支鏈淀粉的測定波長λ為538 nm，參比波長λ為766 nm；直鏈淀粉標準曲線：=0017 9-0112 5，=0.995 5；支鏈淀粉標準曲線：=0002 5+0002 76，=0.995 9。

1.3.4 可溶性總糖、葡萄糖、蔗糖、果糖含量測定

可溶性總糖、蔗糖和果糖含量的測定方法均參照文獻[14]，葡萄糖含量用南京建成試劑盒(F006-1)測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。用Duncan法進行多重比較，顯著性水平為=0.05。采用Microsoft Excel 2010軟件繪制圖表，圖、表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤。

2 結果與分析

2.1 蕓苔素內酯對干旱脅迫下大麥種子萌發(fā)與幼苗生長的影響

由表1可見，干旱脅迫顯著抑制了大麥種子萌發(fā)和萌發(fā)后幼苗的生長。與CK相比，干旱脅迫處理使大麥種子的發(fā)芽率顯著降低，胚芽長、胚芽鞘長和胚根長均分別降低了78.56%、52.61%和71.53%，而根數(shù)量沒有發(fā)生顯著變化。與單獨干旱脅迫相比，蕓苔素內酯浸種處理下大麥種子發(fā)芽率表現(xiàn)出低濃度促進，高濃度抑制的趨勢，5和25 μg·L蕓苔素內酯均能顯著提高干旱脅迫下大麥幼苗的發(fā)芽率，較單獨干旱脅迫處理分別提高10.33、22.66百分點；且當濃度為5 μg·L時，蕓苔素內酯對胚根長的促進作用非常明顯，相較于單獨干旱脅迫增加了0.81 cm，25和50 μg·L蕓苔素內酯也對胚根長有一定的促進作用。5和25 μg·L蕓苔素內酯對胚芽和胚芽鞘的長度有非常明顯的促進作用，分別比單獨干旱脅迫處理增加了15.57%、18.03%和28.97%、35.17%。相較于單獨干旱脅迫處理，100和200 μg·L蕓苔素內酯處理均會使大麥種子的發(fā)芽率降低，尤其是在200 μg·L蕓苔素內酯處理下，胚芽鞘長、胚根長比單獨干旱脅迫處理降低了19.31%和13.85%。

表1 蕓苔素內酯對干旱脅迫下大麥種子萌發(fā)與幼苗生長的影響

2.2 蕓苔素內酯對干旱脅迫下大麥種子萌發(fā)過程中淀粉酶活性的影響

由圖1可見，大麥種子萌發(fā)的12～72 h，α淀粉酶、β淀粉酶和總淀粉酶活性均隨萌發(fā)時間的延長而逐漸增加，與CK相比，干旱脅迫處理顯著抑制了淀粉酶活性。萌發(fā)12 h，α淀粉酶活性非常低，但適宜濃度蕓苔素內酯溶液處理依然可有效緩解干旱對α淀粉酶活性的抑制，萌發(fā)72 h時，α淀粉酶在5、25和50 μg·L蕓苔素內酯處理下的活性分別為9.19、9.90、9.26 U·mg，與單獨干旱脅迫處理相比分別增加了11.39%、19.95%、12.24%，差異均達到顯著水平(<0.05)，而100、200 μg·L蕓苔素內酯處理的α淀粉酶活性顯著低于單獨干旱脅迫處理(圖1-A)。25 μg·L蕓苔素內酯處理的β淀粉酶活性在萌發(fā)72 h時達到46.65 U·mg，顯著高于除CK外的其他處理，然而，100和200 μg·L蕓苔素內酯處理使種子β淀粉酶活性顯著降低，比CK和單獨干旱脅迫處理分別降低了32.68%、36.64%和10.37%、15.65%(圖1-B)。萌發(fā)72 h，5、25 μg·L蕓苔素內酯處理的總淀粉酶活性為51.82和56.55 U·mg，與CK相比分別降低了12.42%、4.42%，與單獨干旱脅迫處理相比分別增加了18.61%、29.43%，差異均達到顯著性水平(<0.05)，200 μg·L蕓苔素內酯處理的總淀粉酶活性顯著低于單獨干旱脅迫處理(圖1-C)。此外，在種子萌發(fā)的各時間段(除36 h)內，與單獨干旱脅迫處理相比，α淀粉酶、β淀粉酶和總淀粉酶活性均在25 μg·L蕓苔素內酯處理下顯著提高，而200 μg·L蕓苔素內酯處理下則降低。

數(shù)據(jù)以鮮重計。同一時期不同處理沒有相同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Data was detected based on fresh weight. Data marked without the same lowercase letter in the same period indicated significant differences at P<0.05.The same as below.圖1 蕓苔素內酯對干旱脅迫下大麥種子α淀粉酶(A)、β淀粉酶(B)和總淀粉酶(C)活性的影響Fig.1 Effects of brassinosteroid on activities of α amylase (A)， β amylase (B) and total amylase (C) of barley seeds under drought stress

2.3 蕓苔素內酯對干旱脅迫下大麥種子萌發(fā)過程中淀粉含量的影響

大麥種子萌發(fā)12～72 h，直鏈、支鏈和總淀粉含量呈持續(xù)降低的變化趨勢，且干旱脅迫下種子的直鏈、支鏈和總淀粉含量均顯著高于CK(圖2)。與單獨干旱處理相比，5、25和50 μg·L蕓苔素內酯處理的支鏈淀粉含量在種子萌發(fā)的各時間段內(除36 h)均降低，在萌發(fā)72 h分別降低1.62、4.29、3.36百分點，差異均顯著(<0.05)，而200 μg·L蕓苔素內酯處理的支鏈淀則略高于單獨干旱脅迫處理(圖2-A)。種子萌發(fā)過程中，5、25和50 μg·L蕓苔素內酯處理的直鏈淀粉含量均低于單獨干旱處理，在萌發(fā)72 h分別降低0.62、1.18、1.94百分點，200 μg·L蕓苔素內酯處理則與單獨干旱脅迫處理相比沒有顯著差異(圖2-B)。5、25和50 μg·L蕓苔素內酯處理可使種子萌發(fā)各時間段內(除36 h)的總淀粉含量均低于單獨干旱脅迫處理，在萌發(fā)72 h分別降低2.24、5.47、5.31百分點，差異均達到顯著水平(<0.05)，而200 μg·L蕓苔素內酯處理的總淀粉含量則比單獨干旱脅迫處理升高粉含量0.71百分點(圖2-C)。

圖2 蕓苔素內酯對干旱脅迫下大麥種子中支鏈淀粉(A)、直鏈淀粉(B)和總淀粉含量(C)的影響Fig.2 Effects of brassinosteroid on contents of amylopectin (A)， amylose (B) and total starch(C) in barley seeds under drought stress

2.4 蕓苔素內酯對干旱脅迫下大麥種子萌發(fā)過程中糖含量的影響

由圖3可見，隨著大麥種子的萌發(fā)，可溶性總糖含量和葡萄糖含量呈逐漸增加的趨勢。在種子萌發(fā)的12、24、36、48、60、72 h，單獨干旱脅迫處理的大麥種子可溶性總糖含量比CK降低15.61%～57.43%，且差異顯著(<0.05)，同時，25 μg·L蕓苔素內酯預處理的大麥種子可溶性總糖含量在各時間段內都高于單獨干旱處理。在萌發(fā)72 h時，5、25和50 μg·L蕓苔素內酯預處理的大麥種子可溶性總糖含量分別比單獨干旱處理高5.03%、8.77%和10.04%，而100、200 μg·L蕓苔素內酯處理則顯著低于單獨干旱脅迫處理(圖3-A)。與CK相比，干旱脅迫處理顯著降低了種子萌發(fā)過程中的葡萄糖含量，在萌發(fā)各時間段內，適宜濃度(5、25和50 μg·L)的蕓苔素內酯處理均促進干旱脅迫下葡萄糖含量的積累，而較高濃度(200 μg·L)蕓苔素內酯處理的種子內葡萄糖含量均低于單獨干旱脅迫處理(圖3-B)。大麥種子萌發(fā)過程中，蔗糖含量先升高后降低，在正常條件(CK)下，36 h時達到最大值，而在干旱脅迫條件下，48 h時達到峰值；在種子萌發(fā)的各時間段內，25 μg·L蕓苔素內酯預處理的蔗糖含量高于單獨干旱處理，在萌發(fā)24、36、48、72 h，200 μg·L蕓苔素內酯預處理的大麥種子蔗糖含量均低于單獨干旱處理(圖3-C)。在正常條件(CK)下，果糖含量呈先升高后降低的趨勢，在干旱脅迫條件下，果糖含量沒有隨著萌發(fā)時間出現(xiàn)明顯有規(guī)律的變化趨勢，25 μg·L蕓苔素內酯預處理的果糖含量除36 h外的其他各時間段內均高于其他處理，在萌發(fā)72 h，25和50 μg·L蕓苔素內酯預處理的果糖含量分別比單獨干旱處理高2.51%、1.74%，而200 μg·L蕓苔素內酯預處理的果糖含量比單獨干旱脅迫處理低4.15%(圖3-D)。

圖3 蕓苔素內酯對干旱脅迫下大麥種子可溶性總糖(A)、葡萄糖(B)、蔗糖(C)、果糖(D)含量的影響Fig.3 Effects of brassinosteroid on the contents of soluble total sugar (A)， glucose (B)， sucrose (C) and fructose (D) in barley seeds under drought stress

3 結論與討論

眾所周知，干旱脅迫不利于種子的萌發(fā)和幼苗生長，本研究也證實了這一點，即正常條件下大麥種子的發(fā)芽率與幼苗生長狀況明顯優(yōu)于干旱脅迫處理的種子。蕓苔素內酯作為一種新型植物生長調節(jié)激素，其功能已在不同的非生物脅迫條件下被廣泛研究，以增強各種作物的種子活力和促進幼苗生長。研究發(fā)現(xiàn)，蕓苔素內酯浸種可提高鹽脅迫下蕎麥種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率，縮短出苗所用時間和提高成苗率。此外，蕓苔素內酯浸種對鹽和干旱脅迫下棉花種子萌發(fā)的促進效應具有低濃度促進、高濃度抑制的趨勢。在本研究中，蕓苔素內酯處理對干旱脅迫下大麥種子的發(fā)芽率也同樣表現(xiàn)出低濃度促進、高濃度抑制的作用，25 μg·L蕓苔素內酯預處理時，干旱脅迫對大麥種子發(fā)芽率的抑制作用最小。Chon等用不同濃度的蕓苔素內酯處理了9份水稻品種，發(fā)現(xiàn)適宜濃度蕓苔素內酯溶液處理1周可促進所有水稻品種的中胚軸、胚芽鞘和葉鞘的伸長。本研究也得到了類似的結果，即在干旱脅迫下，經5、25 μg·L蕓苔素內酯處理后的大麥種子，其芽長、胚芽鞘長和根長均高于單獨干旱脅迫處理。然而，當蕓苔素內酯的質量濃度升高至200 μg·L時，對上述指標均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

種子萌發(fā)始于吸脹，并隨著胚根和胚芽通過種皮突出而終止，這一過程需要的能量和物質主要通過淀粉代謝提供，α淀粉酶和β淀粉酶是淀粉水解過程中的關鍵酶。本研究發(fā)現(xiàn)，在大麥種子萌發(fā)的12～72 h，α淀粉酶、β淀粉酶和總淀粉酶活性呈持續(xù)上升趨勢，這與王鳳等的研究結果相似。干旱脅迫會顯著抑制種子內α淀粉酶、β淀粉酶和總淀粉酶的活性，本研究得到了同樣的結果。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，25 μg·L蕓苔素內酯處理可使干旱脅迫下種子的α淀粉酶、β淀粉酶和總淀粉酶活性在萌發(fā)的各時間段內(除36 h)均顯著高于單獨干旱脅迫處理，而較高濃度(200 μg·L)的蕓苔素內酯溶液處理則表現(xiàn)出相反的作用。郭秀璞等的研究也證明，較低濃度蕓苔素內酯浸種處理的小麥種子在萌發(fā)時α淀粉酶活性提高，促進了小麥種子萌發(fā)和幼苗早期生長，而較高濃度的蕓苔素內酯則沒有表現(xiàn)促進效果。

植物在干旱條件下將淀粉降解為可溶性糖的能力可能對其在逆境下的生存和生長速度起著關鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，大麥種子在12～72 h的萌發(fā)過程中淀粉含量逐漸減少，可溶性總糖和葡萄糖含量逐漸增加，蔗糖和果糖含量在萌發(fā)過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這與黃升謀等和程昕昕等在小麥和玉米中的研究結果大體相符。陳蕾太等的研究表明，小麥種子萌發(fā)的0～72 h，干旱脅迫下種子的可溶性糖含量顯著低于正常條件。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫使大麥種子的可溶性總糖和葡萄糖含量顯著低于正常條件，蔗糖含量在正常條件下萌發(fā)48 h就已達到最大值，而在干旱脅迫條件下萌發(fā)60 h時達到最大值，這可能與干旱脅迫抑制了糖代謝相關酶的活性有關，進而延遲了蔗糖含量達到最大值的時間。李錢峰等的研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度蕓苔素內酯處理使萌發(fā)水稻種子的淀粉保持著更好的結晶度和有序結構，使萌發(fā)過程中胚乳淀粉降解較慢，可能是導致種子萌發(fā)早期胚根生長緩慢的原因之一。在本研究中，較高濃度(200 μg·L)蕓苔素內酯處理后的大麥種子含有較高的淀粉含量，而適宜濃度的蕓苔素內酯(5、25 μg·L)處理則降低了干旱脅迫下種子萌發(fā)各時間段內的淀粉含量，并提高了可溶性總糖含量。這些結果與潘明洪等獲得的結果類似，他們評估了亞精胺對干旱脅迫下白三葉種子淀粉代謝的影響。

綜上所述，干旱脅迫下大麥種子萌發(fā)和幼苗生長受到顯著抑制，淀粉酶活性顯著降低，淀粉含量降低緩慢，可溶性糖含量降低。適宜濃度的蕓苔素內酯處理可提高干旱脅迫大麥種子的萌發(fā)發(fā)芽率、芽和根的生長，提高種子內α淀粉酶、β淀粉酶和總淀粉酶活性，促使直鏈、支鏈和總淀粉含量下降，使種子萌發(fā)各時間段內的可溶性總糖、葡萄糖、蔗糖和果糖含量增加，而較高濃度的蕓苔素內酯則對種子萌發(fā)和淀粉代謝表現(xiàn)出抑制作用。因此，在大麥生產實踐中，對大麥種子進行5、25 μg·L2，4-表蕓苔素內酯浸種處理，可促進大麥萌發(fā)期的淀粉代謝，提高大麥種子的發(fā)芽率，促進芽和根的生長。