不同比例紅藍(lán)光對茶葉品質(zhì)成分的影響與相關(guān)調(diào)控機(jī)理研究

葛詩蓓，金迪迪，楊明來，王 輝，張 蘭，韓文炎，李 鑫，*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，浙江 杭州 310008； 2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230036； 3.浙江長芯光電科技有限公司，浙江 杭州 310020)

茶樹(L.)是一種多年生常綠園藝作物，是在我國和眾多熱帶、亞熱帶國家廣泛種植的重要經(jīng)濟(jì)作物。茶葉中含有大量有利于人體健康的成分，如茶多酚、氨基酸、咖啡堿等。在綠茶的品質(zhì)與營養(yǎng)評價中，茶多酚與游離氨基酸的含量和比例尤為重要。茶多酚也被稱為茶單寧、茶鞣質(zhì)，是茶葉中多羥基酚類化合物的復(fù)合物，約占茶葉干重的18%～36%，與茶樹的生長發(fā)育、新陳代謝和茶葉品質(zhì)密切相關(guān)。兒茶素是茶多酚的主要組成成分，其含量占茶多酚總量的70%～80%。茶葉中已鑒定出26種游離氨基酸，其含量占干物質(zhì)的1%～4%，其中，茶氨酸的含量占游離氨基酸總量的70%左右，在很大程度上影響了綠茶的滋味和品質(zhì)。

光照作為重要的環(huán)境因素之一，主要以光質(zhì)、光周期、光強(qiáng)等形式影響植物的生長發(fā)育。光質(zhì)影響植物體內(nèi)碳水化合物代謝和蛋白質(zhì)代謝，其中，紅光更有利于碳水化合物的積累，藍(lán)光更有利于蛋白質(zhì)的形成。谷艾素等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)紅光與藍(lán)光的比例為3∶1時，文心蘭組培苗的可溶性糖、碳水化合物和碳氮比均達(dá)到最大值，且顯著高于純紅光處理。氮代謝同樣受光質(zhì)影響，研究表明，紅光和藍(lán)光均能降低生菜中硝酸鹽的含量，藍(lán)光能同時提高葉用蔬菜中氨基酸的含量。光照同樣影響茶樹的生長發(fā)育和茶葉品質(zhì)形成，尤其是光質(zhì)，可以通過影響茶樹葉片的初級代謝和次級代謝來影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。遮陽網(wǎng)是夏季茶園中常用的降溫措施。秦志敏研究發(fā)現(xiàn)，不同顏色的遮陽網(wǎng)對茶葉品質(zhì)影響較大，如黑色和綠色遮陽網(wǎng)處理下茶葉中茶多酚的含量降低，而銀白色遮陽網(wǎng)處理下茶多酚含量增加。李麗田對比了不同顏色的透光膜對茶樹兒茶素合成的影響，發(fā)現(xiàn)茶樹新梢中表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素(EC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)的含量在紅膜、藍(lán)膜和紫膜處理下有所降低，但兒茶素(C)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)的含量受透光膜和生長發(fā)育階段的雙重影響。此外，陳思肜通過紅藍(lán)光對茶苗的補(bǔ)光試驗，明確了茶樹嫰梢中的茶氨酸是隨時間動態(tài)變化的，其含量在紅光處理的第28天達(dá)到峰值，在藍(lán)光處理的第14天達(dá)到峰值。光質(zhì)同樣影響加工過程中茶葉的品質(zhì)。張艷麗研究表明，萎凋過程中使用紅光和藍(lán)光有利于提高秋季鐵觀音和黃旦成茶的鮮爽度，降低茶湯苦澀味。張貝貝對比了不同光質(zhì)對萎凋過程中茶葉品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)紅光和藍(lán)光處理下紅茶的兒茶素、茶黃素和氨基酸的含量有所增加，但在黃光處理下效果最顯著。

以往的光質(zhì)研究多采用LED作為光源。本試驗采用更加高效耐用的激光燈作為補(bǔ)充光源，對長勢一致的3年生茶苗進(jìn)行不同比例紅藍(lán)光的補(bǔ)光處理，檢測茶葉品質(zhì)成分的變化情況和與品質(zhì)代謝相關(guān)的基因的表達(dá)情況，以期揭示補(bǔ)光對茶葉品質(zhì)的影響及其調(diào)控機(jī)制，為深入探究光質(zhì)調(diào)控茶葉品質(zhì)成分的機(jī)理，以及利用激光燈補(bǔ)光技術(shù)調(diào)控茶葉品質(zhì)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)計

試驗在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所(120°10′E，30°14′N，海拔16 m)進(jìn)行，試驗時間為2021年3—5月。以3年生的龍井43盆栽茶樹為供試材料，共設(shè)計8個處理，每個處理對應(yīng)10盆，每盆2～3株茶苗。統(tǒng)一采用浙江長芯光電科技有限公司的激光燈進(jìn)行純紅光(R)、純藍(lán)光(B)或紅藍(lán)混合光的補(bǔ)光處理，根據(jù)不同紅藍(lán)光輻照度比(R∶B)設(shè)置不同處理：CK，自然光(未補(bǔ)光)；T1，R∶B=1∶1；T2，R∶B=1∶4；T3，R∶B=1∶8；T4，R∶B=4∶1；T5，R∶B=8∶1；T6，R；T7，B。

調(diào)節(jié)光源的高度，使各處理的光照強(qiáng)度一致，避免因光強(qiáng)不同對茶苗產(chǎn)生影響。所有處理的光照強(qiáng)度均設(shè)為100 μmol·m·s，補(bǔ)光時間設(shè)置為每天的5：00—8：00和18：00—21：00。每隔3 d交換一次花盆的位置，并定時定量進(jìn)行水分管理，以有效避免由于光照不均勻而導(dǎo)致的誤差。

補(bǔ)光處理30 d后，取一芽二葉的樣品。一部分殺青烘干，用于檢測品質(zhì)成分含量；另一部分經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃，用于檢測相關(guān)基因的表達(dá)量。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 茶樣上清液提取

按照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》和GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測定》，對茶葉樣品進(jìn)行研磨、提取，獲得上清液，待測。

1.2.2 茶多酚與游離氨基酸含量測定

按照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》的操作要求，測定茶樣上清液中茶多酚的含量(以干重計)。按照GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測定》的操作要求，測定茶樣上清液中游離氨基酸的含量(以干重計)。所用到的主要檢測儀器為UV-2550型紫外可見分光光度計(日本Shimadzu)。

1.2.3 茶樣處理和兒茶素含量測定

為測定茶葉中不同兒茶素的含量，將茶樣用70%甲醇水溶液在70 ℃水浴上提取，4 ℃、12 000×離心獲得上清液。按照GB/T 8313—2018的操作要求測定茶樣中各類兒茶素(EGCG、ECG、EGC、EC)的含量(以干重計)。選用E2695型高效液相色譜系統(tǒng)(美國Waters)進(jìn)行測定。

1.2.4 實時定量PCR(qRT-PCR)分析

采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取茶樹葉片的RNA。采用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)對葉片總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用LightCycler480實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche)和AceQ qPCR SYBR Green Master Mix熒光染料試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進(jìn)行實時定量PCR分析，反應(yīng)體系(20 μL)如下：10 μL SYBR緩沖液，8.8 μL ddHO，正、反向引物各0.1 μL，1 μL DNA模板。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性10 s，65 ℃延伸40 s，擴(kuò)增40個循環(huán)。PCR完成后，分析熔解曲線，確定得到的PCR產(chǎn)物為單一物質(zhì)。采用Livak等的方法計算基因表達(dá)量。將試驗用到的各引物序列信息整理于表1。

表1 實時定量PCR引物序列

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，當(dāng)處理間差異顯著(<0.05)時，用LSD法進(jìn)行多重比較。用GraphPad Prism 8.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同比例紅藍(lán)光對茶葉茶多酚含量的影響

茶多酚是茶葉中最重要的品質(zhì)成分，但茶多酚多為苦澀味，含量過高會降低茶湯口感。與CK相比，T1、T6處理的茶多酚含量無顯著差異，其他處理的茶多酚含量均顯著下降，其中，T7處理的茶多酚含量最低，與CK相比下降了20.8%，其次為T5和T2，分別下降了16.8%和16.5%(圖1)。

柱上無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Bars marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05. The same as below.圖1 不同比例紅藍(lán)光對茶葉茶多酚含量的影響Fig.1 Effect of different ratios of red and blue light on polyphenol content of tea leaves

2.2 不同比例紅藍(lán)光對茶葉游離氨基酸含量的影響

游離氨基酸占茶葉干物質(zhì)的1%～4%，是茶葉鮮爽滋味的主要成分，也是在茶樹育種和栽培領(lǐng)域最受關(guān)注的成分之一。與CK相比，T1、T2、T3、T5處理的茶葉氨基酸含量顯著升高，增幅分別為27.95%、26.92%、25.84%、38.85%，以T5處理下增幅最大，而其他幾個處理下茶葉的氨基酸含量并無顯著變化(圖2)。

圖2 不同比例紅藍(lán)光對茶葉游離氨基酸含量的影響Fig.2 Effect of different ratios of red and blue light on free amino acid content of tea leaves

2.3 不同比例紅藍(lán)光對茶葉酚氨比的影響

酚氨比是茶多酚含量與氨基酸含量的比值，是評價茶葉品質(zhì)的重要指標(biāo)，一般來說，比值較低的茶葉，加工的綠茶品質(zhì)更好。與CK相比，除T6處理的酚氨比無顯著變化外，其他處理的酚氨比均顯著下降，且以T5處理的酚氨比最低，僅為CK的59%(圖3)。

圖3 不同比例紅藍(lán)光對茶葉酚氨比的影響Fig.3 Effect of different ratios of red and blue light on ratio of polyphenol to amino acid of tea leaves

2.4 不同比例紅藍(lán)光對茶葉兒茶素含量的影響

兒茶素類化合物約占茶多酚含量的75%～80%，是茶苦澀味的來源之一。EGCG、ECG、EGC、EC是最主要的4種兒茶素，其中，EGCG含量占茶多酚總量的50%～60%，是茶多酚的主要活性成分。本研究結(jié)果同樣證實，EGCG在上述4種組分中含量最高，ECG含量次之，EC含量最低(圖4)。同樣地，EGCG對光環(huán)境變化的響應(yīng)最劇烈。T6處理中上述4種兒茶素的含量與CK相比均無顯著差異；而T2、T3、T7處理中上述4種

種兒茶素的含量與CK相比均顯著降低，說明其有利于降低茶湯的苦澀滋味。同時，這一結(jié)果也與不同紅藍(lán)光比例對茶多酚、酚氨比的影響一致。

EGCG，表沒食子兒茶素沒食子酸酯；ECG，表兒茶素沒食子酸酯；EGC，表沒食子兒茶素；EC，表兒茶素。EGCG，Epigallocatechin gallate；ECG，Epicatechin gallate；EGC，Epigallocatechin；EC，Epicatechin。圖4 不同比例紅藍(lán)光對茶葉兒茶素含量的影響Fig.4 Effect of different ratios of red and blue light on catechin content of tea leaves

2.5 不同比例紅藍(lán)光對茶葉品質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)量的影響

初始苯丙烷途徑的代謝產(chǎn)物是兒茶素、花色苷、酚酸等茶多酚物質(zhì)的合成前體，是影響茶多酚代謝水平的重要步驟。苯丙氨酸脫氨酶(PAL)是初始苯丙烷途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，肉桂酸羥化酶(4CL)可最終催化合成類黃酮的前體物質(zhì)-香豆酰輔酶A。與CK相比，T7處理下茶樹苯丙氨酸脫氨酶基因的表達(dá)量顯著下調(diào)；T5處理下茶樹肉桂酸羥化酶基因4的表達(dá)量顯著下調(diào)。類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT)可將花青素催化為花色苷，而花青素還原酶(ANR)將花青素催化為兒茶素。與CK相比，茶樹類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)量在T4處理下顯著上調(diào)，但茶樹花青素還原酶基因的表達(dá)量在T2、T3、T5處理下顯著下調(diào)(圖5)。

圖5 不同比例紅藍(lán)光處理下茶葉品質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.5 Relative expression level of genes related to tea quality under different ratios of red and blue light

茶氨酸合成酶(TS)是茶氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶。與CK相比，茶樹茶氨酸合成酶基因1和2的表達(dá)量均在T6處理下顯著降低，而在其余處理下無顯著變化。

3 討論

茶多酚是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，是影響茶葉品質(zhì)的重要因素。茶葉中的兒茶素含量占茶多酚總量的70%～80%，是茶多酚的主要組成成分。茶葉中茶多酚的含量與茶樹的碳同化能力密切相關(guān)，光質(zhì)作為影響碳同化的主要因素之一，可能會對茶多酚含量產(chǎn)生一定的影響。為此，本研究測定了不同比例紅藍(lán)光條件下茶葉的茶多酚和4種主要兒茶素的含量。結(jié)果證實，紅藍(lán)光補(bǔ)光會影響茶葉中茶多酚的積累，除T1和T6處理外，其他處理均顯著降低了茶葉中茶多酚的含量。同時， T2、T3、T7處理(藍(lán)光比例較高或純藍(lán)光的補(bǔ)光處理)還顯著降低了4種兒茶素的含量。這與前人研究結(jié)論相符，均表明藍(lán)光能夠抑制茶葉中茶多酚和部分兒茶素的積累。但光質(zhì)對茶樹品質(zhì)的影響仍受光強(qiáng)、光照時長、試驗材料等因素的影響，如紅光補(bǔ)光處理35 d時，以及藍(lán)光補(bǔ)光處理21、28、35 d時，茶葉中兒茶素的積累增加。

本研究還檢測了茶多酚物質(zhì)合成相關(guān)的基因、4、、的相對表達(dá)量，結(jié)果表明，T5、T7處理均抑制初始苯丙烷途徑的代謝水平，這與茶多酚含量的結(jié)果互為印證。在茶多酚物質(zhì)代謝通路中，UFGT和ANR擁有相同的催化底物——花青素，前者促進(jìn)花色苷的合成，后者促進(jìn)兒茶素類物質(zhì)的合成，兩者存在底物競爭關(guān)系。因此，和的表達(dá)多呈現(xiàn)出相反的變化趨勢。本研究中，的表達(dá)量在T5處理下有所上調(diào)，而的表達(dá)量在T5處理下顯著下調(diào)，這與兒茶素含量的變化趨勢一致，推測T5處理抑制了兒茶素類物質(zhì)的合成，但增加了花色苷的積累。綜上，T5和T7處理下，初始苯丙烷途徑的代謝水平被抑制，兒茶素的積累減少，從而導(dǎo)致以兒茶素為主的茶多酚的含量降低。同時，T5處理還可通過精準(zhǔn)調(diào)控ANR的表達(dá)來抑制兒茶素類物質(zhì)的合成，降低茶葉中苦澀成分的積累，從而有效提高茶葉品質(zhì)。

游離氨基酸是茶葉的重要組成成分，其含量直接影響茶葉品質(zhì)和茶湯滋味。茶氨酸是茶樹中獨有的氨基酸，其含量約占游離氨基酸總量的70%，不僅是茶葉質(zhì)量評估中的一項重要指標(biāo)，還是測定游離氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)品。本研究中，多種比例的紅藍(lán)光條件均可顯著提高茶葉中游離氨基酸的含量，其中，T5處理下茶葉中游離氨基酸的含量最高。此外，茶氨酸的合成分解易受外界環(huán)境影響，除了光質(zhì)因素，光強(qiáng)和補(bǔ)光時長同樣能夠影響茶葉中茶氨酸的積累。TS是茶氨酸合成途徑中重要的合成酶。T6處理下，茶氨酸合成酶基因1和2的表達(dá)量顯著下調(diào)，意味著茶氨酸的合成受到抑制。此外，光照同樣影響茶氨酸代謝相關(guān)基因1、2、3、、1.1、1.2和氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達(dá)。

酚氨比作為評判茶葉品質(zhì)的重要指標(biāo)，是衡量茶湯滋味協(xié)調(diào)性的一個重要參數(shù)，與茶葉滋味濃度、鮮度和醇度呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)性。同時，茶葉也可根據(jù)酚氨比來選擇適宜的加工工藝，如酚氨比較高的茶葉更適合加工為紅茶，酚氨比較低的茶葉更適合加工為綠茶。本研究中，除了T6處理外，不同比例的紅藍(lán)光均有助于降低茶葉的酚氨比，其中T5處理的效果最顯著。由此可見，恰當(dāng)?shù)募t藍(lán)光補(bǔ)光可有效提高綠茶茶葉加工原料的品質(zhì)。

補(bǔ)光設(shè)備是農(nóng)業(yè)中重要的設(shè)施設(shè)備，市場上有普通日光燈、LED燈、激光燈等。目前，激光燈在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用和研究還較少，但與LED燈相比，其優(yōu)勢明顯，如光合作用量子效率高、射程長、能量集中、壽命高等，可解決傳統(tǒng)補(bǔ)光設(shè)備散熱效率低、出光不均勻、功率分布差等問題。本研究利用激光燈進(jìn)行補(bǔ)光試驗，初步明確了不同比例紅藍(lán)光補(bǔ)光對茶葉品質(zhì)的影響，為茶園利用高效補(bǔ)光設(shè)備調(diào)控茶葉品質(zhì)打下研究基礎(chǔ)。