基于納米材料的免疫層析試紙在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用

楊婭林，陸彥蓉，殷曉陽，李華明，彭大鵬

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所，國家獸藥殘留基準(zhǔn)實驗室，武漢 430070)

獸藥，尤其是抗微生物藥物，大量用于動物疾病的治療、預(yù)防以及飼料添加劑，其殘留會影響人或動物的健康，如出現(xiàn)過敏反應(yīng)、耐藥性增強、生殖危害及癌癥等?？焖贆z測是保證食品安全，減少獸藥殘留的重要手段，儀器分析法[1]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[2]是目前常用的檢測方式。儀器分析法的操作專業(yè)性、對使用場所的要求限制了其現(xiàn)場檢測的發(fā)展，ELISA盡管具有現(xiàn)場檢測優(yōu)勢，但繁瑣的操作過程，無法完成大規(guī)模食品篩選，且檢測結(jié)果易受到環(huán)境影響。免疫層析試紙主要由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊及底板構(gòu)成，以標(biāo)記材料的特殊性質(zhì)作為檢測信號，檢測卡的使用形式不受限于場所、操作人員，具有操作簡單、檢測時間短、靈敏度高及成本低等優(yōu)勢，是實現(xiàn)現(xiàn)場檢測、大量樣品篩選的重要方法。因此，文章以膠體金、量子點、磁性納米材料、時間分辨熒光微球作為綜述對象，對他們的優(yōu)缺點以及在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用進行闡述，展望免疫層析試紙技術(shù)未來應(yīng)用趨勢，以期提供新的發(fā)展思路，保證食品安全。

1 基于膠體金納米材料的檢測方法

膠體金(Colloidal gold，CG)主要通過還原氯金酸制備而成，以靜電吸附方式與蛋白質(zhì)結(jié)合而不改變其生物特性，在硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，NC膜)上與抗原發(fā)生特異性反應(yīng)后，膠體金聚集顯示紅色，最終通過對比檢測線間顏色深淺判定陰性、陽性的檢測結(jié)果(圖1)。

圖1 膠體金試紙檢測原理(A)、結(jié)果判定方法(B)Fig 1 Colloidal gold assay strip principle(A)、result reading method(B)

基于膠體金納米材料的免疫層析方法在獸藥殘留檢測領(lǐng)域有著重要地位。在已發(fā)表的免疫層析相關(guān)文獻中，約有75%的標(biāo)記材料都是膠體金[3]。如表1所示，目前膠體金試紙的檢測范圍幾乎包括所有的抗微生物藥物種類，檢測樣品涉及到水產(chǎn)品、肉類、禽蛋、乳制品等動物源性食品，以及尿液、血清等生物樣品，3～20 min可完成檢測，除此以外，膠體金試紙已實現(xiàn)多種藥物聯(lián)合檢測，可基本滿足大規(guī)模的食品篩選。

表1 膠體金免疫層析試紙的應(yīng)用Tab 1 Application of colloidal gold immunochromatographic assay strip

傳統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙主要通過肉眼對比檢測線顏色深淺判定結(jié)果。這種判讀方式往往受檢測人員主觀意識影響，檢測結(jié)果差異大，檢測靈敏度有限。為提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性，研究人員將銀離子沉積在金粒子表面[15]，或?qū)⑶蛐谓鹆Ｗ痈淖優(yōu)楸谆ɑ蚣{米星形狀[16]，增強膠體金的視覺可見性，以此減小檢測誤差，檢測靈敏度可提高5～10倍以上。另一方面，研究者也開發(fā)出光學(xué)檢測儀代替肉眼判讀，將C、T線的色密度轉(zhuǎn)化為光密度進行處理，由于色密度信號僅來自于NC膜表面10 μm，其中約有90%的信號因光散射、折射等原因出現(xiàn)損失[17]，所以這種信號轉(zhuǎn)化后的結(jié)果準(zhǔn)確性尚有待提高。

2 基于磁性納米材料的檢測方法

磁性納米材料(Magnetite nanoparticles，MNPs)，是一類特殊的納米級氧化物，可以通過物理法、化學(xué)法、生物法等多種途徑合成，剛合成的磁性粒子經(jīng)過表面修飾后，可以增強粒子的物理、化學(xué)穩(wěn)定性，同時提供便于蛋白質(zhì)偶聯(lián)的官能團。MNPs有著與膠體金相當(dāng)?shù)哪栁庀禂?shù)，標(biāo)記抗體后，與NC膜上的特異性抗原反應(yīng)顯示棕黃色。但如上所述，光學(xué)信號易產(chǎn)生損失，NC膜幾百微米的實際厚度，以及生物樣本中的有色成分，也會影響光學(xué)信號的獲取。磁信號則不會受到這些因素的影響，同時生物樣本幾乎無磁性，磁珠富集后的磁信號可被準(zhǔn)確測量，因此磁性試紙有著更高的準(zhǔn)確度、靈敏度。孫虹[18]使用MNPs作為標(biāo)記物檢測養(yǎng)殖用水、魚肉中的孔雀石綠殘留，25 min可獲得檢測結(jié)果，定量限為0.6、0.9 μg/L，與市售膠體金試紙經(jīng)檢測對比后，該磁性試紙具有更高的靈敏度。此外，磁性試紙?zhí)禺愋愿鼜?，相比于傳統(tǒng)的儀器分析法，耗時更短且操作簡單。Yan[19]在檢測呋喃唑酮分析物時，用MNPs分別標(biāo)記單克隆抗體、羊抗鼠抗體，利用兩種抗體的特異性結(jié)合，起到信號增強作用，檢測限低至0.044 μg/L，磁性試紙檢測靈敏度進一步提高5～10倍。雖然MNPs的合成方法較多，卻依舊缺少成熟、穩(wěn)定的合成途徑，適用于免疫層析的MNPs較少，因此，在獸藥殘留檢測中很難看到磁性試紙，昂貴的進口檢測儀器也是制約因素之一。

表2 磁性免疫層析試紙的應(yīng)用Tab 2 Application of magnetic immunochromatographic assay strip

MNPs經(jīng)修飾后仍能表現(xiàn)出優(yōu)異的磁性，只需外加磁場就可實現(xiàn)溶液中磁珠快速分離，對于其他納米材料，磁性特性使MNPs在免疫層析試紙上應(yīng)用更廣泛，例如檢測前的樣品處理。免疫層析試紙無法對待測物進行精準(zhǔn)選擇，加之檢測形式簡單，動物樣品中的蛋白、脂肪等基質(zhì)易對檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾。MNPs經(jīng)蛋白質(zhì)修飾后，可與目標(biāo)分析物特異性結(jié)合，通過外加磁場實現(xiàn)目標(biāo)分析物的快速分離，合適洗脫后可得到高純度目標(biāo)分析物，被稱為磁分離技術(shù)(圖2)，利用該技術(shù)處理樣品可大幅減少有機溶劑使用，洗脫后的MNPs還可重復(fù)利用，具有環(huán)保、經(jīng)濟優(yōu)勢，是磁性納米材料除標(biāo)記材料的特殊應(yīng)用。Zhang[25]使用該技術(shù)處理粗樣品，最終獲得高純度氯霉素類似物，整個過程簡單、快速，可有效提高后續(xù)檢測準(zhǔn)確性。于是，研究者便將磁分離技術(shù)與膠體金試紙條結(jié)合(表2)，相比于傳統(tǒng)處理方式，這種結(jié)合模式，能有效提高膠體金試紙靈敏度10倍以上。

圖2 磁分離技術(shù)Fig 2 Magnetic separation technology

3 基于量子點的檢測方法

量子點(Quantum dots，QDs)是由Ⅱ-Ⅵ族元素、Ⅲ-Ⅴ族元素或Ⅳ-Ⅵ族元素組成，具有發(fā)光特性的一種半導(dǎo)體納米晶體，比羅丹明、熒光素等傳統(tǒng)熒光染料，吸收波長更大，熒光強度更高，常使用以CdSe、CdS或CdTe為核心，ZnS或ZnSe鈍化后的核殼量子點作標(biāo)記材料。

Beloglazova[26]對牛奶樣本僅采用稀釋處理，檢測其中的慶大霉素殘留，對量子點試紙、膠體金試紙的檢測效果進行對比。結(jié)果表明，QDs檢測靈敏度比CG高5倍，量子點試紙假陽性率、假陰性率分別為2.4%、2.1%，均低于膠體金試紙(4.3%、3.2%)。這是因為QDs與抗體共價連接，比靜電吸附作用更加牢固，因此，抗干擾能力更強，且熒光信號較光學(xué)信號更易區(qū)分陽性、陰性結(jié)果，借助熒光信號檢測儀器，可以獲得更低檢測限。

Taranova[27]使用525 nm(綠色)、585 nm(黃色)、625 nm(紅色)三種不同顏色的QDs作檢測信號，檢測牛奶中氧氟沙星、氯霉素、鏈霉素三種藥物殘留，檢測限分別為0.3、0.12、0.2 μg/mL，檢測誤差低于8%，10 min就能完成三種藥物檢測，因檢測過程中，熒光顏色的變化形似紅綠燈，又被稱為“紅綠燈”信號試紙(圖3)。QDs可以通過改變其合成成分、粒徑，在相同波長激發(fā)時表現(xiàn)多色熒光，這一特性讓QDs在多種藥物同時檢測中，仍能保持良好區(qū)分性，為不同藥物的準(zhǔn)確定量提供了保證。

圖3 多色熒光試紙(A)、鏈霉素陽性(B)、氧氟沙星和氯霉素陽性(C)Fig 3 Multicolor fluorescence assay paper(A)、Streptomycinpositive(B)、Ofloxacin and Chloramphenicol positive(C)

如表3所示，量子點試紙已應(yīng)用于肉類、奶制品及生物樣品的檢測，在萊克多巴胺，以及鏈霉素、四環(huán)素、青霉素聯(lián)合檢測中，檢測限低至ng量級。盡管如此，研究者發(fā)現(xiàn)某些蛋白質(zhì)或溶劑分子會使QDs熒光強度下降或淬滅，于是研究者將大量QDs包裹在聚苯乙烯、二氧化硅等納米微球內(nèi)，以增強QDs熒光穩(wěn)定性。同時，納米微球包裹技術(shù)可以一定程度上隔絕Cd元素，避免生物毒性。InP、CuInS2、Ag2S等無鎘量子點，因無毒、環(huán)保優(yōu)勢逐漸成為研究熱點，Beloglazova[28]首次成功制備InP/ZnS無鎘量子點試紙，可以靈敏檢測兩種霉菌毒素，方法簡單且經(jīng)濟高效，但因無鎘量子點制備困難，因此未在獸藥殘留檢測廣泛應(yīng)用。

表3 量子點免疫層析試紙的應(yīng)用Tab 3 Application of quantum dot immunochromatographic assay strip

4 基于時間分辨熒光微球的檢測方法

時間分辨熒光微球(Time-resolved fluorescence microsphere，TRFM)，是將鑭系元素絡(luò)合物封裝在聚苯乙烯，或二氧化硅納米微球中的一種新型微球，可以提供穩(wěn)定、高強度的熒光信號，常用Eu(Ⅲ)系熒光微球。TRFM具有更大的Stokes位移，熒光穿透力、抗干擾能力更強，不易出現(xiàn)熒光淬滅現(xiàn)象，與非特異性熒光背景區(qū)分性好，幾乎無生物毒性。

如表4所示，Li[35]首次構(gòu)建Eu(Ⅲ)元素時間分辨熒光試紙，檢測地塞米松殘留，牛奶、豬肉的定量限分別為0.003 μg/L、0.062 μg/kg，10 min可完成檢測。Wang[36]制備的TRFM試紙，氯丙嗪檢測限為0.32 μg/kg，線性范圍更寬(0.46～10.0 μg/kg)，線性關(guān)系較好(R2=0.991)，樣品預(yù)處理后，6 min內(nèi)就可完成檢測?？梢?，TRFM具有較高的檢測靈敏度，能夠?qū)ΛF藥殘留檢測進行定量檢測。

表4 時間分辨熒光微球免疫層析試紙的應(yīng)用Tab 4 Application of time-resolved fluorescent microsphereimmunochromatographic assay strip

Hu[29]首次對TRFM、乳膠微球、QDs、CG的靈敏度及標(biāo)記消耗量進行系統(tǒng)比較。同比于量子點試紙，時間分辨熒光試紙靈敏度提高3～4倍，為7.2 ng/L。乳膠微球、QDs和CG抗體標(biāo)記量分別是0.02、0.054和 0.15 μg， TRFM抗體標(biāo)記量僅為0.005 μg。時間分辨熒光試紙T線包被抗原濃度0.4 mg/mL，其余三種試紙T線包被抗原濃度0.8 mg/mL。同時，時間分辨熒光試紙檢測范圍最大，檢測時間最短，準(zhǔn)確度最高，檢測結(jié)果與LC-MS/MS、商品化ELISA試劑盒一致。

綜上所述，時間分辨熒光試紙靈敏度更高、檢測范圍更大、抗原抗體消耗更少，能夠為獸藥殘留檢測提供新型、高效、經(jīng)濟的檢測方式。目前，時間分辨熒光試紙在獸藥殘留檢測的應(yīng)用處于起步階段，這是因為TRFM的生產(chǎn)技術(shù)不成熟，仍需依賴商品化微球，而商品化微球還存在分散性、熒光強度不穩(wěn)定現(xiàn)象。

5 展 望

綜上，每種納米材料的優(yōu)缺點如表5所示。納米材料為免疫層析試紙?zhí)峁┝颂厥鈾z測信號，大幅提高免疫層析試紙檢測靈敏度，并實現(xiàn)定量分析，其中MNPs因特有的磁性特性，為免疫層析試紙?zhí)峁┬碌臉悠诽幚矸绞剑员ＷC結(jié)果準(zhǔn)確性。

表5 納米材料特點Tab 5 Characteristics of Nanomaterials

基于此，為應(yīng)對動物食品中多種藥物及其代謝物殘留現(xiàn)狀，免疫層析試紙還應(yīng)具備多重分析功能，經(jīng)總結(jié)多重分析試紙主要有以下幾種應(yīng)用趨勢：

5.1 多檢測線試紙 多檢測線是指增加檢測線數(shù)量，在一條試紙上檢測不同藥物(圖4A)。為防止檢測線互相干擾，需要靈敏度、特異性更強的抗體，由于免疫探針在流動過程中，易出現(xiàn)稀釋、反應(yīng)緩慢等現(xiàn)象，進而會影響藥物檢測靈敏度，因此，待測物至檢測線距離應(yīng)著重考慮。

5.2 多通道檢測 多通道檢測是將檢測同種、不同種藥物的試紙條，組裝在一個檢測平臺的檢測方式，每一條試紙擁有單獨加樣槽、閱讀窗，可根據(jù)檢測需求，增減平臺試紙數(shù)量，是當(dāng)前商品化多重分析試紙的主要檢測方式(圖4B)。

5.3 矩陣檢測 相同區(qū)域下，點狀在數(shù)量上更具優(yōu)勢，將線性檢測線用點陣代替，可極大增加檢測數(shù)量，抗原包被數(shù)量可達32種(圖4C)。目前，矩陣檢測試紙已在傳染病診斷、病原體檢測中應(yīng)用，但由于檢測區(qū)域縮小，易受液體流速不均等外界因素干擾，尚無法保證結(jié)果準(zhǔn)確性，在獸藥殘留檢測中應(yīng)用較少。

圖4 多檢測線試紙(A)、多通道檢測(B)、矩陣檢測(C)Fig 4 Multi-detection line assay paper(A)、Multi-channeldetection(B)、Matrix detection(C)

定量分析是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確的重要手段。MNPs、QDs和TRFM的應(yīng)用，實現(xiàn)了數(shù)據(jù)化處理、存儲和運輸，結(jié)果準(zhǔn)確性大大提高。2010-2019年間，免疫層析試紙在食品安全中的應(yīng)用量快速增長。其中，傳統(tǒng)比色法試紙使用量減少，定量分析試紙使用量增多且呈幾倍增長，這得益于信號檢測儀器的開發(fā)與應(yīng)用，為滿足現(xiàn)場快檢需求，這些檢測儀器逐漸趨向于小型化、便攜化。大眾食品安全意識的提高，將帶來家庭檢測需求，智能手機的普及與發(fā)展，將促進家庭化、智能化、大眾化的新型閱讀方式形成，不斷推動獸藥殘留檢測技術(shù)發(fā)展。