電離輻射生物標志物γ-H2AX的檢測技術研究進展*

劉 櫻 熊忠華 夏斌元 陳 珊

（中國工程物理研究院材料研究所，綿陽 621907）

在真核生物中，脫氧核糖核酸（DNA）與組蛋白結合形成核小體，構成染色質的功能單位，而DNA雙鏈斷裂（DNA double strand break，DSB）是電離輻射引起DNA損傷的主要形式。當DNA雙鏈發(fā)生斷裂時，在斷裂位點將出現(xiàn)組蛋白H2AX在39位絲氨酸（γ-H2AX）的磷酸化。磷酸化的γ-H2AX在DSB位點累積，同時募集多種參與DNA損傷修復的分子，形成修復灶，共同參與早期DNA損傷修復。利用抗磷酸化γ-H2AX的抗體檢測，可建立電離輻射與磷酸化γ-H2AX焦點之間的關系［1-2］。1998年，Rogakou等［3］首次發(fā)現(xiàn)并報道了γ-H2AX可作為細胞DNA雙鏈斷裂的快速又敏感的信號分子，隨后的大量研究發(fā)現(xiàn)，γ-H2AX焦點數(shù)量在電離輻射發(fā)生大約30 min后達到峰值，在24 h內迅速下降并在幾天內下降到基線水平，具體時間取決于相應的輻射劑量，焦點數(shù)量也與輻射劑量相關［4-5］。采用γ-H2AX焦點法進行劑量估算需在放射后1~2 d內進行，這也使其成為目前時效性最高的輻射生物標志物之一。因此，近年來，γ-H2AX檢測技術在快速輻射劑量估算、輻射應急分診等方面的應用價值被國內外廣泛重視，尤其在精準化、小型化、高通量化等方面開展了諸多研究工作。

1 γ-H2AX常用檢測技術

目前，γ-H2AX的檢測方法主要包括免疫熒光法（熒光顯微鏡和流式細胞術）、酶聯(lián)免疫吸附測定法和免疫印跡法等，以上方法均基于免疫細胞化學技術，其原理為用標記的抗磷酸化γ-H2AX的抗體對目標細胞的磷酸化γ-H2AX進行定性、定位或定量檢測。

1.1 免疫熒光法

免疫熒光法主要利用γ-H2AX單克隆抗體作為一抗，與細胞內DSB位點處的γ-H2AX特異性結合，再加入標記有熒光素的二抗，與一抗形成夾心結構，利用熒光顯微鏡或流式細胞術采集熒光信號，即可分析目標細胞內γ-H2AX含量（圖1）。熒光顯微鏡觀察是最直觀且最便捷的檢測技術，既可以對細胞內γ-H2AX焦點計數(shù)，又可定性獲得其熒光強度大小，從而比較不同劑量下細胞內的γ-H2AX含量，但該方法存在主觀誤差，使得其準確度不高，目前已開發(fā)有多種圖像分析軟件對獲得的熒光圖像進行分析，可減少人為誤差并節(jié)約時間，提高準確性。而流式細胞術可實現(xiàn)大批量樣本中γ-H2AX的測定。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是酶免疫測定技術中應用最廣的技術。用于檢測γ-H2AX的主要原理是以γ-H2AX的單克隆抗體作為γ-H2AX捕獲抗體，組裝在固相載體（如聚苯乙烯微量反應板）上，當含γ-H2AX的標本被捕獲后，加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的檢測抗體，形成夾心結構。再加入酶標底物（即TMB溶液）和終止液即可通過在450 nm波長處測吸光度（A）值獲得標本中γ-H2AX的含量（圖2）。無論在定量分析精確度上，還是標本處理流程上，ELISA都較熒光顯微鏡和流式細胞術更具優(yōu)勢，且可采用酶標儀和96孔板進行高通量測定，因此，近年來也被廣泛用于γ-H2AX的測定。

1.3 蛋白質免疫印跡法

蛋白質免疫印跡是將電泳分離后的細胞或組織總蛋白質從凝膠轉移至固相支持硝酸纖維素膜（nitrocellulose membrane，NC膜）或聚偏二氟乙烯（polyvinylidene，PVDF）上形成印跡膜，印跡膜上的目標蛋白可以被特異性抗體識別并捕獲。同時，利用酶或同位素標記的二抗作為信標，經過底物顯色或放射自顯影可對被捕獲的目標蛋白進行信號示蹤（圖3）。

2 γ-H2AX檢測技術進展

γ-H2AX的檢測結果可反映出DSB損傷修復情況，其具有檢測周期短、特異性與靈敏度較高的優(yōu)點，可滿足輻射劑量估算和輻射應急分診的應用需求。目前，改進γ-H2AX檢測技術，主要涉及減少采樣量和檢測時間、借助新型顯微鏡技術、傳統(tǒng)技術改進、檢測自動化以及其他增強檢測效果的方法等，目的均為盡可能在更短時間、更少樣品量和更高通量的情況下獲得更清晰的檢測結果。

2.1 樣品量

輻射事故后，為盡早對受照人群進行初步劑量估計和早期分診，需要在同一時間內對盡可能多的樣本進行快速評估，因此檢測時所需的樣品量及其處理時間十分關鍵。常規(guī)檢測方法需要從裝有若干毫升體積血液樣品的肝素管中，通過Ficoll密度梯度離心法獲得足夠多的淋巴細胞，再進行隨后的洗滌、分離和固定步驟。Sowa等［6］比較了經靜脈穿刺和Ficoll密度梯度離心獲得的外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）和指尖毛細管血中分離的單個核細胞（capillary blood mononuclear cells，CBMCs），同時利用間接免疫熒光法分析γ-H2AX焦點情況，發(fā)現(xiàn)CBMCs可替代PBMCs用于DSB分析。而Wojewodzka等［7］通過改變樣品處理參數(shù)來評估其對γ-H2AX焦點的影響，并優(yōu)化出一種理論上可應用于指尖血的微量測定方案。Moquet等［8］已開發(fā)出一種檢測方法，只需少于0.1 ml的血液樣品，在理論上也可以實現(xiàn)手指穿刺取樣。該方法可將96個樣品的處理時間從常規(guī)方法的15 h減少為約4 h。但是需要犧牲細胞數(shù)和焦點清晰度。Heylmann和Kaina［9］則通過將指尖血注入肝素化的微量紅細胞壓積玻璃毛細管中，然后將其涂抹于玻片上，即可實現(xiàn)分析一滴血液中的γ-H2AX焦點來檢測DNA損傷，該方法簡單、快速、廉價，允許大量的血液采樣和長期存儲，適用于人類和動物群體中遺傳損傷的快速和大規(guī)模篩選。Johnston等［10］開發(fā)了一種不需要對血液樣品進行過濾、富集或純化的全血免疫分析方法，分析結果在0~5 Gy的劑量范圍內呈線性關系，理論上可以將這種分析從實驗室擴展到野外。

2.2 超分辨顯微鏡技術

通過光學檢測在單細胞水平上評估電離輻射暴露后的DNA損傷反應和修復動力學，是γ-H2AX檢測技術中常用的方法之一。近年來，借助新型超分辨顯微鏡技術，可以在納米尺度上研究電離輻射在單細胞中的分子效應［11］。在生物標本中，納米標記的分子結構可以精確到10 nm（可見光波長的1/50），這屬于單個核小體、抗體、受體等的范圍。而單分子定位顯微鏡（single molecule localization microscopy，SMLM）是目前最流行的超分辨技術之一。大多數(shù)單分子定位顯微鏡方法依賴于單個熒光團分子的隨機光譜調制，如光活化定位顯微鏡（photo-activated localization microscopy，PALM）、熒光PALM（fluorescence PALM，F(xiàn)PALM）、隨機光學重建顯微鏡（stochastic optical reconstruction microscopy，STORM）、直 接STORM（direct STORM，dSTORM）、基態(tài)耗盡顯微鏡（ground state depletion microscopy followed by individual molecule return，GSDIM）等。最近的大多數(shù)研究主要集中在對暴露于不同劑量γ射線輻射并在輻射暴露后不同時間點固定的細胞中，γ-H2AX特異性抗體進行SMLM研究［12-16］。

2.3 圖像分析軟件

提高光學檢測水平可以更深入地對DNA損傷機制進行基礎科學研究，但這些超分辨顯微鏡的使用會不同程度增加檢測成本和時間，并不適用于現(xiàn)場和快速檢測。而對獲得的熒光圖像進行準確地自動圖像分析則不僅可以縮短分析時間，也可減少人為誤差。使用圖像處理和分析的自動γ-H2AX分析已被證明比人工分析的準確度和平行性高，因為人工分析不能提供諸如核的大小或焦點的強度等額外信息［17-18］。焦點的量化和表征理論上需要統(tǒng)計大量的細胞來確保結果的可信度，因此這需要利用合適的圖像分析軟件，例如包含有圖像預處理和轉換、有效信息的提取，以便進行進一步的數(shù)據(jù)分析［18］。目前，已開發(fā)有多種基于顯微鏡圖像的開源或閉源的自動分析軟件，包括ImageJ［19-20］、DeepFoci［21］、CellProfiler［22-24］、FociCounter［25］、FoCo［26］、FocAn［27］等，均能對基于γ-H2AX的細胞圖像進行分析。開源軟件相較閉源軟件，因其具有可訪問的源代碼，使得用戶可根據(jù)特定的需求對參數(shù)進行修改；分析過程透明可視化；免費提供給科研工作者使用等優(yōu)點，成為許多科研工作中優(yōu)先考慮使用的軟件。表1比較了幾種常用圖像分析軟件所具備的功能，ImageJ和CellProfiler可提供多種插件，進行批量處理，同時可獲得逐步分析的結果；DeepFoci和FocAn可分析共聚焦顯微鏡獲得的3D多通道數(shù)據(jù)，從而分析三維立體結構下的焦點分布情況；FociCounter僅可獲得焦點及焦點強度等簡單數(shù)據(jù)，但軟件分析操作較為直觀簡潔?；趫D像分析軟件獲得的結果會因參數(shù)設置的不同而存在明顯差異，后續(xù)研究中需要建立統(tǒng)一的評判標準。

Table 1 Comparison of image analysis software functions表1圖像分析軟件功能比較

2.4 檢測新技術

成像流式細胞術（imaging flow cytometry，IFC）將光學顯微鏡和流式細胞術的優(yōu)勢結合，使研究人員在快速分析大量細胞的同時，可根據(jù)細胞形態(tài)學結果輔證分析結果。Lee等［28］開發(fā)出一種基于成像流式細胞術的快速、高通量γ-H2AX檢測方法，用于評估電離輻射暴露后人外周血細胞DNA雙鏈斷裂修復動力學，結果分析與已有文獻的理論曲線相符［5］?；诔上窳魇郊毎g建立的γ-H2AX檢測方法可以提供一個高通量的實用平臺，通過預測個體放射敏感性和與放療相關的不良反應風險，促進精準醫(yī)療。

對于像磷酸化組蛋白γ-H2AX這類特定蛋白質的相對定量分析，酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫印跡法都需要先將細胞裂解后提取總蛋白質方可進行后續(xù)實驗。細胞酶聯(lián)免疫吸附法（cell enzyme-linked immunosorbent assay，cell-ELISA）和細胞內免疫印跡法（in cell Western，ICW）則無需裂解細胞，而是在細胞原位檢測目標蛋白質，相較于傳統(tǒng)方法，省略了前期細胞裂解物的制備、制膠、電泳以及轉膜等費時又易出錯的步驟，也極大減少了因裂解細胞獲取總蛋白質時造成的損失，具有特異、靈敏及操作簡便等特點。Matsuzaki等［29］和Tronnet等［30］分別利用這兩種方法對檢測γ-H2AX進行了嘗試，并建立了一套靈敏便捷的檢測方法。

近年來，利用高效液相色譜串聯(lián)質譜技術（high liquid chroma-tography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）對γ-H2AX磷酸化位點進行定量檢測，可實現(xiàn)細胞內γ-H2AX定量分析，該方法于2015年由Matsuda等［31］建立，軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所謝劍煒研究員課題組［32］亦建立和評估了γ-H2AX質譜定量檢測技術在細胞基因毒性方面的應用，并獲得了DNA損傷及修復動力學曲線，在化合物的基因毒性測試中顯示了可行性及優(yōu)越性。

3 自動化/便攜式設備研制

改進生物劑量估算方法的檢測速度和效率，有助于在出現(xiàn)放射性事故時提高救援速率，保存有限醫(yī)療資源，遏制大規(guī)模的恐慌。因此需要研制出可快速自動甚至便攜式的生物劑量估算系統(tǒng)，用以評估可能的大量個人輻射照射劑量。

現(xiàn)有的商品化的自動化免疫熒光分析及顯微系統(tǒng)如AKLIDES［33］、Europattern［34］和Nova View［35］等，均可在一定程度上實現(xiàn)γ-H2AX生物劑量測定部分自動化，從而縮短時間，提高效率。Garty等［36-39］研制出一種基于機器人的自動生物劑量檢測 工 具 （rapid automated biodosimetry tool，RABIT），利用多種先進技術，實現(xiàn)了γ-H2AX生物劑量測定從樣品分離到熒光成像全流程自動化。測試結果表明，RABiT可在18 h工作周期內完成對5 859個生物樣本的測定。而針對現(xiàn)場輻射劑量生物測定，Bensimon Etzol等［40-42］搭建了一種可操作和便攜移動的生物劑量測量設備DosiKiT，可基于血液和毛囊樣本對輻射受照人群進行事故現(xiàn)場測量，從而獲得全身和局部的劑量評估。Zhong等［43］則以微流控技術為基礎，設計制作了一種便攜式的集成設備，簡化了γ-H2AX免疫熒光染色的方案，可在室溫下40 min內實現(xiàn)全自動γ-H2AX免疫熒光染色，實驗結果呈線性劑量響應關系，具有自動化、高效、經濟實用等特點。以上三者的比較總結于表2中。

Table 2 Comparison of automation/portable devices表2自動化/便攜式設備比較

4 總結與展望

隨著核技術在國防事業(yè)、能源產業(yè)、農林業(yè)及醫(yī)學診斷治療中越來越廣泛的應用，大規(guī)模暴露于電離輻射環(huán)境的風險也在增加。輻射事故應急處置要求快速對受照人員進行劑量評估，基于DNA損傷的γ-H2AX生物劑量測定方法可在較短時間內對輻照劑量進行估算，從而達到快速篩分受照人群以便于應急醫(yī)學處置的目的。本文總結了近10年來國內外基于電離輻射生物標志物γ-H2AX的檢測方法研究進展，作為電離輻射生物標志物，為縮短檢測時間，提高檢測效率，對γ-H2AX檢測過程中的樣品量、自動化圖像分析技術、檢測新技術等方面，國外學者均開展了一定深度的研究，國內學者則側重于方法的應用和機制的研究，在檢測技術改進方面仍存在差距與不足。在快速輻射劑量估算、輻射應急分診方面，建立快速準確，可便攜自動化的高通量γ-H2AX生物劑量測定方法是γ-H2AX作為電離輻射生物標志物未來最重要的研究方向之一，且具有極高的應用潛力。