茶鮮葉萎凋時(shí)期乙烯利溶液對(duì)游離氨基酸組分的影響

李 琴， 戴宇樵， 冉乾松， 楊 婷， 劉忠英， 潘 科*

（1.貴州大學(xué) 茶學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省茶葉研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006）

乙烯作為重要的植物激素可調(diào)控植物各種生物學(xué)和非生物學(xué)過(guò)程，如促進(jìn)萌發(fā)、抑制根系生長(zhǎng)、刺激花葉衰老及果實(shí)成熟[1]。植物離體后也與乙烯有著緊密關(guān)系，生產(chǎn)中常通過(guò)調(diào)控乙烯為生產(chǎn)服務(wù)[2]。如采后品質(zhì)調(diào)控，包括色澤、香氣、滋味、貨架期[3-5]。乙烯利在pH＞4時(shí)釋放乙烯氣體，常代替乙烯用于生產(chǎn)[6]。生產(chǎn)上常運(yùn)用乙烯利涂抹法、噴施法、浸液法達(dá)到生產(chǎn)目的。聶艷噴施75 mg/L乙烯利溶液增加簕杜鵑花枝數(shù)、花朵數(shù)及花序數(shù)，提前植株始花期[7]。Estanis等通過(guò)噴施高濃度乙烯利溶液，在生產(chǎn)中達(dá)到低成本疏花的目的[8]。Kongsuwan等運(yùn)用獼猴桃浸漬乙烯利溶液，促使果實(shí)軟化，改善果實(shí)糖酸比[9]。說(shuō)明一定濃度乙烯利溶液能夠?qū)崿F(xiàn)乙烯生理調(diào)控的作用，施用方法應(yīng)結(jié)合作物及生產(chǎn)特性進(jìn)行選擇。

茶樹(shù)鮮葉離體后，仍作為生命體進(jìn)行生理活動(dòng)，在酶失活前，與采后果蔬存在共性[10]。仍在進(jìn)行呼吸作用、水分散失、誘導(dǎo)激素釋放等活動(dòng)，水分散失導(dǎo)致細(xì)胞液濃度增加，細(xì)胞膜透性改變及內(nèi)含物質(zhì)分解與合成[11]。尤偉平運(yùn)用氣相色譜法檢測(cè)烏龍茶加工中不同搖青處理后樣品的內(nèi)源乙烯，檢測(cè)到試樣釋放乙烯含量順序?yàn)椋旱?次搖青葉＞第3次搖青葉＞第2次搖青葉＞第1次搖青葉＞曬青葉＞鮮葉，產(chǎn)生機(jī)械損傷的搖青工藝是烏龍茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵，說(shuō)明機(jī)械損傷誘導(dǎo)釋放的乙烯與烏龍茶品質(zhì)形成有關(guān)聯(lián)[12]。因茶類(lèi)加工工藝存在差異，其他工藝是否與之類(lèi)似有待進(jìn)一步研究。

游離氨基酸種類(lèi)、營(yíng)養(yǎng)豐富，且可被人體直接吸收，同時(shí)作為重要呈味物質(zhì)體現(xiàn)出鮮、甜、酸、苦及澀等味感，這些多樣味感形成食物豐富的味覺(jué)層次[13]。茶葉中游離氨基酸占氨基酸總質(zhì)量的70%，是組成茶湯鮮爽滋味的主要因子，在茶葉品質(zhì)評(píng)估、加工中是不得不考量的品質(zhì)因子。根據(jù)游離氨基酸所帶基團(tuán)不同，可將氨基酸分為鮮爽味氨基酸、甜味氨基酸及苦味氨基酸[14-16]。在乙烯處理下，活體狀態(tài)茶鮮葉游離氨基酸如何變化尚未探明，因此結(jié)合茶葉萎凋特性，采用噴施法對(duì)茶樹(shù)離體新梢進(jìn)行處理并定量檢測(cè)游離氨基酸，旨在探究乙烯利溶液對(duì)萎凋期茶葉中游離氨基酸組分的影響，探明茶葉萎凋中乙烯應(yīng)用的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以貴州省茶葉研究所自主培育品種“黔茶1號(hào)”為實(shí)驗(yàn)材料，2020年7月23日于貴州省茶葉研究所種質(zhì)資源圃采摘一芽二葉。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將采摘材料分為對(duì)照組、噴施乙烯利組及噴施乙烯抑制劑組，3個(gè)處理薄攤2～3 cm后進(jìn)行27℃恒溫萎凋。每個(gè)處理間隔4 h取一次樣，萎凋24 h。樣品裝入寫(xiě)好標(biāo)簽的密封袋，經(jīng)液氮處理后，轉(zhuǎn)存-80℃超低溫冰箱，經(jīng)真空冷凍干燥后磨粉待用。

乙烯利液體配制及施用方法：稱取0.5 g乙烯利，溶于500 mL純水制成乙烯利溶液，均勻噴灑于薄攤2～3 cm的茶葉表面，為使溶液均勻附著在葉片表面，可輕輕翻動(dòng)，噴灑直至液體均勻滴落。為保證樣品處理一致性，使用同樣方法處理乙烯抑制劑組。

1.2.1 水分含量檢測(cè)方法使用快速水分測(cè)干儀稱取0.2 g茶樣，在120℃條件下烘干，重復(fù)3次并記錄數(shù)顯屏數(shù)值。

1.2.2 游離氨基酸檢測(cè)方法樣品制備：參照文獻(xiàn)[17]的方法，適當(dāng)修改。稱取0.1 g茶樣，加入10 mL純水，100℃沸水提取45 min，每隔10 min振蕩一次。冷卻后經(jīng)0.45 μm水系濾頭過(guò)濾后，備用。取0.5 mL待測(cè)樣加入0.5 mL超純水，制成待測(cè)樣。

檢測(cè)方法：使用島津游離氨基酸試劑包，采用OPA、FMOC法進(jìn)行在線衍生。利用島津液相色譜儀，色譜柱采用Durashell-AA氨基酸分析專(zhuān)用柱（4.6 mm×150 mm，3 mm）；流動(dòng)相A：精確稱量4.5 g十二水磷酸氫二鈉、4.75 g十水四硼酸鈉，超純水溶解定容至1000 mL，加入1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)36%的鹽酸調(diào)節(jié)pH，過(guò)濾備用；流動(dòng)相B：乙腈、甲醇、水體積比為45∶45∶10。流動(dòng)相均超聲脫氣15 min。洗脫梯度及流量：0 min，5%B，1.6 mL/min；6 min，10%B，1.6 mL/min；8 min，10%B，1.6 mL/min；10 min，16%B，1.3 mL/min；23 min，40%B，1 mL/min；30 min，50%B，1.6 mL/min；31 min，100%B，1.6 mL/min；34 min，100%B，1.6 mL/min；35 min，5%B，1.6 mL/min；38 min，5%B，1.6 mL/min（均為體積分?jǐn)?shù)）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用ANOVA單因素方差進(jìn)行分析（P＜0.05）。采用Origin 2018 b繪圖軟件進(jìn)行圖表制作。所有檢測(cè)均進(jìn)行3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分含量及茶鮮葉物理變化

萎凋過(guò)程鮮葉感官特性見(jiàn)表1，水分含量（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）變化見(jiàn)圖1，外觀變化見(jiàn)圖2。對(duì)照組鮮葉色澤明亮、鮮綠，葉質(zhì)硬挺，品種香略帶青氣。4 h時(shí)兩個(gè)噴施處理組，葉片葉質(zhì)挺拔，色澤明亮、鮮綠，噴施乙烯利組有花香，而噴施乙烯抑制劑組呈青氣，對(duì)照組花香顯露，葉緣輕微背卷。隨著時(shí)間推移，鮮葉水分含量逐漸降低，葉色由富有光澤轉(zhuǎn)為暗淡，葉質(zhì)硬挺轉(zhuǎn)為柔軟，直至干邊。同一時(shí)段不同處理水分含量不同，3組處理水分含量隨時(shí)間推移而降低，樣品具有相同水分含量時(shí)，萎凋時(shí)長(zhǎng)最長(zhǎng)為噴施乙烯利組，噴施乙烯抑制劑組次之，對(duì)照組最短。同一萎凋時(shí)長(zhǎng)水分含量次序?yàn)椋簢娛┮蚁├M＞噴施乙烯抑制劑組＞對(duì)照組。

表1 萎凋過(guò)程中各處理組的感官特性變化Table 1 Changes of sensory characteristics of each treated group during withering

圖1 萎凋過(guò)程中各處理組的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Fig.1 Changes of water mass fraction of each treated group during withering

圖2 萎凋過(guò)程中樣品外觀變化Fig.2 Appearance change of samples during withering

2.2 游離氨基酸

茶湯中富含多種呈味物質(zhì)，各物質(zhì)間又存在交互作用，使得茶湯味覺(jué)呈現(xiàn)研究頗為復(fù)雜。因此，僅研究不同處理中呈現(xiàn)同一種味覺(jué)的游離氨基酸，及其各游離氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異。結(jié)果如圖3所示，對(duì)照組鮮爽味氨基酸隨時(shí)間推移略有降低，甜味氨基酸、苦味氨基酸均隨時(shí)間推移而增多。不同萎凋期各處理間，噴施乙烯利顯著提高鮮爽味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別在4 h和8 h呈現(xiàn)顯著差異，甜味氨基酸差異不顯著，噴施乙烯利及噴施乙烯抑制劑組可降低苦味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，差異不顯著。前人研究表明，氨基酸在萎凋期間隨萎凋時(shí)間延長(zhǎng)有所增加[18-19]，17種游離氨基酸中15種游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)經(jīng)萎凋有所提高[20]。作者研究結(jié)果與前人基本一致。原因可能在于，因萎凋前期酶活性提高，致使蛋白質(zhì)水解進(jìn)而提高了氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)[21]。

圖3 萎凋過(guò)程中呈味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Fig.3 Mass fraction changes of flavor amino acid during withering

2.2.1 鮮爽味氨基酸茶氨酸、天冬氨酸及谷氨酸構(gòu)成鮮爽味氨基酸。如圖4所示，茶氨酸為鮮爽味氨基酸主體，對(duì)照組中茶氨酸變化趨勢(shì)呈現(xiàn)波動(dòng)性，先降后升再降，噴施乙烯抑制劑組變化趨勢(shì)總體與對(duì)照組一致，兩組間無(wú)顯著差異。萎凋期間噴施乙烯利可提高茶氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別在4、8、12 h得到顯著提高。在整個(gè)萎凋期天冬氨酸先升后降，對(duì)照組和噴施乙烯抑制劑組無(wú)顯著差異，噴施乙烯利可顯著提高天冬氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以8、12、16 h最顯著。隨時(shí)間推移谷氨酸降低，噴施乙烯利組在萎凋4 h后谷氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著提高，20 h后噴施乙烯抑制劑組、噴施乙烯利組與對(duì)照組相比，谷氨酸略有提高，但差異不顯著。

圖4 萎凋過(guò)程中鮮爽味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Fig.4 Changes of umami and refreshing amino acid mass fraction during withering

2.2.2 甜味氨基酸由圖5可知，絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸及脯氨酸構(gòu)成甜味氨基酸。各氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)排序?yàn)椋航z氨酸＞蘇氨酸、丙氨酸＞脯氨酸＞甘氨酸。萎凋期間，對(duì)照組除蘇氨酸變化趨勢(shì)穩(wěn)定，其他均隨時(shí)間推移而增加。絲氨酸在8 h受兩種噴施處理顯著下調(diào)，其他萎凋期質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有不同，無(wú)顯著差異。噴施乙烯利處理組的甘氨酸高于對(duì)照組與噴施乙烯抑制劑組，在4 h后差異顯著，且對(duì)照組和噴施乙烯抑制劑組間無(wú)顯著差異。萎凋期間，對(duì)照組中蘇氨酸顯著低于噴施乙烯利組和噴施乙烯抑制劑組，4 h時(shí)，噴施乙烯利組蘇氨酸高于噴施乙烯抑制劑組及對(duì)照組；8 h和12 h時(shí)噴施乙烯利組和噴施乙烯抑制劑組無(wú)顯著差異；16、20、24 h時(shí)，噴施乙烯利組低于噴施乙烯抑制劑組。噴施乙烯利組降低了丙氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，對(duì)照組和噴施乙烯抑制劑組分別在8 h和12 h時(shí)差異顯著，其余萎凋期并不存在顯著差異。噴施乙烯利組在8 h顯著降低脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其余時(shí)間各處理間差異較小。

圖5 萎凋過(guò)程中甜味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Fig.5 Changes of sweet amino acid mass fraction during withering

2.2.3 苦味氨基酸由圖6可知，組氨酸、精氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸及亮氨酸組成苦味氨基酸。組氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸及亮氨酸隨著時(shí)間推移增高。4 h時(shí)噴施乙烯利與噴施乙烯抑制劑組均可提高組氨酸且顯著高于對(duì)照組，12 h和16 h對(duì)照組和噴施乙烯抑制劑組無(wú)顯著差異。在4 h時(shí)，噴施乙烯利組精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低，噴施乙烯抑制劑組和對(duì)照組無(wú)明顯差異；16 h時(shí)對(duì)照組降低，其余兩處理組顯著高于對(duì)照組，且噴施乙烯利組顯著低于噴施乙烯抑制劑組，16 h及以后對(duì)照組精氨酸保持較低水平，兩處理組均顯著高于對(duì)照組，但兩處理間不存在顯著差異。噴施乙烯抑制劑組和對(duì)照組酪氨酸較低，噴施乙烯利提高酪氨酸作用顯著。16、20、24 h時(shí)，噴施乙烯抑制劑組中纈氨酸略高于對(duì)照組，差異不顯著，噴施乙烯利組顯著高于其余組。在4 h和8 h時(shí)，對(duì)照組和噴施乙烯利組甲硫氨酸不存在顯著差異，12 h起存在顯著差異，在4～12 h，噴施乙烯抑制劑組顯著高于其余組。在4 h時(shí)各處理間異亮氨酸不存在顯著差異，8 h起噴施乙烯利組較其他組顯著增高。噴施乙烯利組中苯丙氨酸分別在20 h和24 h略高于其余組，其余萎凋時(shí)期，兩處理組顯著低于對(duì)照組。噴施乙烯抑制劑組中亮氨酸分別在4 h和8 h時(shí)顯著低于其余組，12 h起噴施乙烯利組顯著高于其余組，且其余組間無(wú)顯著差異。

圖6 萎凋過(guò)程中苦味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Fig.6 Changes of bitter amino acid mass fraction during withering

3 結(jié)語(yǔ)

研究表明適度萎凋?qū)Ω刹枧c茶湯色澤形成有益，同時(shí)葉質(zhì)變軟增加茶葉可塑性，可減少加工中斷碎葉的產(chǎn)生[22]。該研究表明，萎凋期間對(duì)照組、噴施乙烯利組及噴施乙烯抑制劑組葉色由亮綠轉(zhuǎn)為暗綠直至灰綠，葉質(zhì)由硬挺轉(zhuǎn)向柔軟直至干邊，對(duì)照組中萎凋葉于4 h開(kāi)始葉色轉(zhuǎn)暗，噴施處理補(bǔ)充水分使得萎凋葉持綠時(shí)間變長(zhǎng)，同時(shí)香氣呈現(xiàn)出“青草氣逐漸消失，花香漸顯轉(zhuǎn)向濃郁，直至轉(zhuǎn)低”的變化。噴施乙烯利組花香顯露時(shí)間早于對(duì)照組，噴施乙烯抑制劑組青氣持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)于對(duì)照組及噴施乙烯利組，8 h時(shí)仍帶有青氣，花香持續(xù)時(shí)間短。可依據(jù)這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象對(duì)綠茶、白茶等需要保持茶葉綠色的茶類(lèi)進(jìn)行加工。

鮮爽味氨基酸包括谷氨酸、天冬氨酸及茶氨酸，對(duì)照組中，其隨萎凋時(shí)間延長(zhǎng)略有減少，Li等研究表明茶氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與萎凋時(shí)間呈負(fù)相關(guān)[23]，該研究中對(duì)照組的變化趨勢(shì)與其研究結(jié)果一致，但噴施乙烯利組茶氨酸顯著上調(diào)。虞昕磊研究表明相較于鮮葉，攤放后谷氨酸明顯下降[24]。該研究對(duì)照組中谷氨酸隨時(shí)間推移下降，噴施乙烯利則提高了谷氨酸?？梢?jiàn)，噴施乙烯利可以顯著提高鮮爽味氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

甜味氨基酸隨時(shí)間推移呈上升趨勢(shì)。乙烯可顯著降低甜味氨基酸中脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，前人研究表明，脯氨酸參與細(xì)胞滲透壓調(diào)節(jié)來(lái)增強(qiáng)植物抗性[25]，脯氨酸高與提高植物抗逆性存在相關(guān)性。該研究可能由于噴施補(bǔ)充的水分，減少了茶鮮葉遭受的水分脅迫，使得其下降。乙烯可顯著提高甘氨酸、蘇氨酸，丙氨酸在不同萎凋時(shí)期對(duì)各處理響應(yīng)不同。脯氨酸不受乙烯調(diào)控，甘氨酸受乙烯誘導(dǎo)上調(diào)，丙氨酸不完全受乙烯調(diào)控。

總體而言，鮮爽味氨基酸和苦味氨基酸中的組氨酸、酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸及亮氨酸受乙烯誘導(dǎo)上調(diào)，據(jù)虞昕磊研究結(jié)果推測(cè)液施處理可補(bǔ)充茶鮮葉水分，延長(zhǎng)萎凋時(shí)間使蛋白質(zhì)水解反應(yīng)更為充分，從而提高游離氨基酸[24]。將噴施乙烯抑制劑組與噴施乙烯利組相比較，發(fā)現(xiàn)噴施乙烯利組對(duì)部分游離氨基酸發(fā)揮調(diào)控作用，結(jié)合前人研究可以理解為乙烯和水共同存在，一方面水使萎凋時(shí)間延長(zhǎng)，使蛋白質(zhì)水解更加充分，從而增加游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，另一方面乙烯發(fā)揮作用提高了游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，尤其是鮮爽味氨基酸。

食品安全成為人類(lèi)關(guān)注焦點(diǎn)，歐洲食品安全局基于農(nóng)業(yè)實(shí)踐報(bào)告稱乙烯利在烘焙、煮沸、釀造等過(guò)程中主要降解為乙烯氣體，對(duì)人體無(wú)毒害[26]。茶鮮葉萎凋是茶葉加工第一個(gè)環(huán)節(jié)，后續(xù)還需經(jīng)過(guò)高溫加工，因此茶鮮葉萎凋期間噴施乙烯利對(duì)人體健康無(wú)毒害。鮮葉采摘后，呼吸作用釋放熱量，茶葉生產(chǎn)高峰期，若不能及時(shí)投產(chǎn)會(huì)致使茶鮮葉品質(zhì)降低影響成茶品質(zhì)，噴施乙烯利可降低茶鮮葉葉溫，延長(zhǎng)茶葉萎凋時(shí)間，減緩茶廠生產(chǎn)壓力。顯著提高的游離氨基酸能中和夏秋茶苦澀口感，同時(shí)噴施乙烯利對(duì)葉色有保護(hù)作用。后續(xù)可在該研究基礎(chǔ)上進(jìn)行成茶加工，通過(guò)茶葉感官審評(píng)進(jìn)一步評(píng)估成茶品質(zhì)。另外，香氣是衡量茶葉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，茶樹(shù)鮮葉在采后的萎凋、做青過(guò)程中受到的高溫、機(jī)械損傷等非生物脅迫，誘導(dǎo)了不飽和脂肪酸的脂氧合酶代謝途徑從而產(chǎn)生脂肪族類(lèi)香氣物質(zhì)[27]。而萎凋期間噴施乙烯利，萎凋葉表現(xiàn)出良好的香氣品質(zhì)，其原因有待進(jìn)一步研究。