用于卡那霉素檢測(cè)的競(jìng)爭(zhēng)性比色傳感策略研究

趙婷婷， 陳 謙， 卞曉軍，2，3， 顏 娟*，2，3

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海），上海 201306）

卡那霉素（kanamycin，KAN）是一種氨基糖苷類抗生素[1]。由于它具有阻斷蛋白質(zhì)合成的能力，因此可廣泛用于治療細(xì)菌等微生物引起的感染[2]。但是，過度、過量使用抗生素會(huì)導(dǎo)致其殘留在肉、蛋、奶制品及其他動(dòng)物源性食品中，并最終通過人體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)累積到體內(nèi)，造成一系列的危害，如：腎毒性、耳毒性以及過敏反應(yīng)等[3]。許多國(guó)家、地區(qū)對(duì)KAN在牛奶中允許的最高殘留限量做了規(guī)定，例如，歐盟將殘留限量定為150 μg/kg[4]，中國(guó)則為200 μg/kg[5]。因此，建立一種靈敏的KAN檢測(cè)方法對(duì)食品、環(huán)境及人類健康都是至關(guān)重要的。

目前，常用的KAN檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)[6]、高效液相色譜[7-8]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[9-10]和毛細(xì)管電泳等，但其中有些方法依賴于抗原、抗體結(jié)合的穩(wěn)定性，如酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)；有的方法需要依賴大型儀器，需要專業(yè)的人員和煩瑣的操作，如高效液相色譜和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；有的方法本身響應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，如表面等離子共振法；而毛細(xì)管電泳法則存在靈敏度較低的問題。鑒于這些傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有各自的不足，因而開發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高的KAN檢測(cè)方法迫在眉睫。

適配體（aptamer，Apt）是一種從體外核酸分子文庫(kù)中通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)獲得的單鏈寡核苷酸序列[11-12]，它能夠與靶分子發(fā)生高特異性、高親和力結(jié)合[13-14]。與抗體相比，適配體具有熱穩(wěn)定性高、生產(chǎn)成本低、便于生產(chǎn)和修飾等諸多優(yōu)點(diǎn)[15]，因此基于適配體的生物傳感器得到了研究人員的廣泛重視[16-17]。自從Song等利用親和層析技術(shù)篩選出對(duì)KAN具有高特異性的適配體以來(lái)[18]，用于檢測(cè)KAN的適配體傳感器，如比色[19-20]、熒光[21-22]和電化學(xué)[23]傳感器等相繼涌出。在這些方法中，比色適配體傳感器因成本低、簡(jiǎn)單實(shí)用、無(wú)需任何精密儀器，肉眼就能夠觀察其顏色變化而得到廣泛應(yīng)用[24]。

近年來(lái)，基于磁性顆粒和碳納米管等磁性材料特性設(shè)計(jì)的納米結(jié)構(gòu)，用來(lái)分析抗生素殘留已經(jīng)得到了諸多研究[25-27]。磁性顆粒是一類可負(fù)載多種表面官能團(tuán)的粒子[28]，因其具有表面結(jié)合小分子穩(wěn)定性好、測(cè)定動(dòng)力學(xué)強(qiáng)、固定小分子定向改善等優(yōu)點(diǎn)，可以利用磁分離技術(shù)實(shí)現(xiàn)流體中靶標(biāo)分子的分離和富集，故在生物傳感器方面得到了廣泛應(yīng)用[29-31]。作者制備了磁珠-卡那霉素 （magnetic beadskanamycin，MBs-KAN）復(fù)合物，通過該復(fù)合物表面的KAN與溶液中待測(cè)KAN共同競(jìng)爭(zhēng)性地識(shí)別生物素修飾的適配體（biotin modified aptamer，Biotin-Apt），開發(fā)了一種檢測(cè)KAN的競(jìng)爭(zhēng)性比色適配體傳感器。隨著待測(cè)KAN含量增加，溶液中的適配體傾向于與其結(jié)合，所以磁珠表面的KAN競(jìng)爭(zhēng)性識(shí)別適配體的量減少，進(jìn)而導(dǎo)致鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶 （streptavidin-labeled horseradish peroxidase，SA-HRP）的量減少，從而影響HRP催化3，3’，5，5’-四 甲 基 聯(lián) 苯 胺 （3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine，TMB）的顯色反應(yīng)，使藍(lán)色發(fā)色物質(zhì)的量減少?；谠摫壬m配體傳感器的紫外-可見吸收光譜值與待測(cè)KAN的濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，從而可以對(duì)KAN進(jìn)行定量檢測(cè)。該傳感器操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好，可以通過替換相應(yīng)的磁性復(fù)合物和適配體來(lái)實(shí)現(xiàn)不同種類抗生素的檢測(cè)，具有良好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DNA序列（5′-Biotin-TTT TTT TTT TTG GGG GTT GAG GCT AAG CCG AGT CAC-3′），純度為HPLC級(jí)別：由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并純化；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS，20×，pH 7.4）、Tris-HCl緩沖液（20 mmol/L，pH 7.0）、Biotin-11-dUTP（1 mmol/L）、KAN、阿布拉霉素（apramycin，APM）、巴龍霉素（paromomycin，PAR）、鏈霉素（streptomycin，STR）、慶大霉素（gentamicin，GEN）和新霉素（neomycin，NEO）：生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；BioMag?Plus修飾的磁珠、磁分離器：美國(guó)Polysciences Inc公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品；TMB（含H2O2）：美國(guó)Neogen公司產(chǎn)品；SA-HRP：賽默飛科技有限公司（上海）產(chǎn)品；1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide，EDC）、2-（N-嗎 啉 代） 乙 磺 酸 （2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid hydrate，MES）：阿拉丁試劑有限公司（上海）產(chǎn)品；Millipore凈化系統(tǒng)的超純水：美國(guó)密理博公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

HCM100-Pro恒溫振蕩金屬浴、D1008手持式離心機(jī)：大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司產(chǎn)品；UV-2540紫外-可見分光光度計(jì)：日本島津公司產(chǎn)品；Hitachi S-3400N掃描電子顯微鏡：日本株式會(huì)社日立制作所產(chǎn)品；移液槍：德國(guó)Brand公司產(chǎn)品；Synergy2 SLFPTAD多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)伯騰儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MBs的活化磁珠的活化即對(duì)氨基磁珠進(jìn)行醛基化，具體步驟如下：用移液槍移取BioMag?Plus修飾的磁珠3 mL（150 mg）到50 mL離心管，加24 mL吡啶緩沖液（0.01 mol/L），在室溫下劇烈振蕩混合均勻后，進(jìn)行磁分離，棄去上清液，該過程重復(fù)3次；之后加入12 mL體積分?jǐn)?shù)5%的戊二醛溶液（用0.01 mol/L吡啶緩沖液稀釋配制），在非磁性混合設(shè)備即恒溫?fù)u床振蕩器中25℃避光振蕩3 h，以保證磁珠和戊二醛溶液充分混合；然后進(jìn)行磁分離去除未反應(yīng)完的戊二醛溶液，用24 mL吡啶緩沖液（0.01 mol/L）反復(fù)清洗3次，直至溶液澄清后進(jìn)行磁分離操作，移除上清液；最終，將磁珠加入15 mL的1×PBS中重懸，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 MBs-KAN的制備MBs-KAN采用碳二亞胺交聯(lián)法制備[32]，詳細(xì)的制備步驟如下：取2 mL（20 mg）醛基化磁珠于15 mL離心管中，離心丟棄上清液，加入2 mL 20 mmol/L MES偶聯(lián)液洗滌3次；之后分別加入2 mL 20 mmol/L MES偶聯(lián)液和20 g/L EDC溶液重懸磁珠，于恒溫?fù)u床振蕩器25℃下避光活化3 h；磁分離后，用2 mL 20 mmol/L MES偶聯(lián)液洗滌3次；加入100 g/L的硫酸卡那霉素，在25℃下放于恒溫?fù)u床振蕩器中避光孵育振蕩6 h，之后進(jìn)行磁分離，棄去上清液；最后將產(chǎn)物用4 mL的清洗緩沖液（1×PBS，1 mmol/L MgCl2，體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-20，PH 7.4）洗滌3次以除去未反應(yīng)的硫酸卡那霉素，將沉淀重懸于2 mL的1×PBS溶液中，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 競(jìng)爭(zhēng)性適配體傳感器的構(gòu)建取5 μL制備好的MBs-KAN復(fù)合物，磁分離去除上清液，加入50 μL體積分?jǐn)?shù)為2%的BSA溶液室溫下封閉40 min。封閉結(jié)束后，磁分離去除上清液，加入500 nmol/L的Biotin-Apt以及20 μL不同濃度的KAN溶液（0、0.05、0.5、5、50、500 nmol/L），將離心管放于旋渦振蕩器上振蕩混勻，之后放入金屬浴于37℃孵育1 h。孵育結(jié)束后，磁分離去除上清液，將產(chǎn)物用清洗緩沖液沖洗3次。

1.3.4 比色適配體傳感器的構(gòu)建將上述獲得的磁性復(fù)合物用50 μL體積分?jǐn)?shù)4%的BSA溶液進(jìn)行封閉，封閉時(shí)間40 min，結(jié)束后進(jìn)行磁分離操作以除去多余的BSA溶液。之后在離心管中加入2 μL稀釋1000倍的SA-HRP，避光反應(yīng)20 min后進(jìn)行磁分離。將磁分離后的沉淀部分加入50 μL 0.01 mol/L的PBS緩沖液清洗6次，直至溶液澄清，后進(jìn)行磁分離操作棄去上清液。在上述產(chǎn)物中加入50 μL TMB溶液（含H2O2），在避光狀態(tài)下反應(yīng)5 min，磁分離后，上清液被吸取到96孔板中，在酶標(biāo)儀中波長(zhǎng)652 nm處測(cè)量吸光度。

1.3.5 牛奶實(shí)際樣品中檢測(cè)KAN牛奶樣品購(gòu)自上海羅森超市，具體的處理步驟如下：2 mL牛奶樣品用PBS緩沖液稀釋10倍。將牛奶樣品在4 °C以11000 r/min離心25 min，除去沉淀后，用0.22 μm的濾膜過濾上清液，收集得到的濾液。將一系列不同濃度的KAN標(biāo)準(zhǔn)溶液加到牛奶濾液中，配成終濃度為0.5、1、5 nmol/L的KAN溶液用于檢測(cè)。另外將一組不加KAN的經(jīng)過預(yù)處理的牛奶樣品作為對(duì)照組。將加標(biāo)的樣品和對(duì)照組都進(jìn)行上述操作，測(cè)定652 nm處的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 競(jìng)爭(zhēng)性比色適配體傳感器的檢測(cè)原理

基于磁珠表面競(jìng)爭(zhēng)性生物識(shí)別的比色適配體傳感器用于檢測(cè)KAN的原理見圖1。該競(jìng)爭(zhēng)性適配體傳感器的構(gòu)建核心在于MBs-KAN與待測(cè)樣中的KAN共同競(jìng)爭(zhēng)識(shí)別Biotin-Apt。當(dāng)溶液中不存在游離的KAN時(shí)，由于適配體與靶標(biāo)會(huì)發(fā)生特異性識(shí)別，所以磁珠上共價(jià)交聯(lián)的KAN就會(huì)捕獲Biotin-Apt，從而使Biotin結(jié)合在磁性復(fù)合物的表面。當(dāng)體系中加入SA-HRP后，生物素與鏈霉親和素識(shí)別連接，辣根過氧化物酶（HRP）被間接連接到磁珠復(fù)合物的表 面。加 入TMB時(shí)，HRP催化H2O2介 導(dǎo) 的TMB發(fā)生還原反應(yīng)，生成藍(lán)色的氧化型TMB，從而在652 nm處出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰。而當(dāng)溶液中存在過量的待測(cè)KAN時(shí)，由于游離的KAN相較于磁珠上交聯(lián)的KAN有著更小的空間位阻，適配體會(huì)優(yōu)先結(jié)合待測(cè)樣中的KAN，這使得磁珠上結(jié)合的適配體以及HRP的量大大減少甚至沒有，因此催化TMB后溶液的吸光度降低。隨著待測(cè)樣中KAN濃度升高，該傳感器在652 nm處的吸光度降低，根據(jù)吸光度的差值對(duì)KAN進(jìn)行定量檢測(cè)。

圖1 基于磁珠表面競(jìng)爭(zhēng)性生物識(shí)別的比色適配體傳感器用于檢測(cè)KAN的示意圖Fig.1 Schematic illustration of a colorimetric aptasensor based on the competitive biological recognition on the surface of magnetic beads for detecting KAN

2.2 MBs-KAN的表征

首先采用掃描電子顯微鏡對(duì)預(yù)制備的MBs-KAN磁性復(fù)合物進(jìn)行表征（見圖2）。由于超順磁性結(jié)構(gòu)微域的存在，導(dǎo)致MBs會(huì)發(fā)生一定的團(tuán)聚[33]，因此圖2（a）中出現(xiàn)一些磁珠聚集體；然而當(dāng)其表面連接KAN之后，由于KAN的介導(dǎo)作用，使得更多磁珠聚集成團(tuán)，相比圖2（a）而言，圖2（b）中磁性聚集體的粒徑進(jìn)一步增大（紅色箭頭）。聚集體尺寸的變化一方面可反映KAN在磁珠表面的成功連接。并且，MBs-KAN復(fù)合物的制備也將進(jìn)一步通過KAN與適配體之間的識(shí)別進(jìn)行驗(yàn)證。另外，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，磁珠表面具有多孔結(jié)構(gòu)，經(jīng)過蛋白質(zhì)（如抗體）修飾及填充，磁珠的多孔表面變得順滑[34]，這也說明具備該結(jié)構(gòu)的磁珠具有更大的比表面積，更有利于如KAN等小分子的組裝。

圖2 掃描電子顯微鏡圖像Fig.2 Scanning electron microscope image

2.3 MBs-KAN識(shí)別Biotin-Apt的驗(yàn)證

該競(jìng)爭(zhēng)性適配體傳感器制備成功與否的關(guān)鍵在于適配體能否識(shí)別KAN?；诖?，進(jìn)一步驗(yàn)證了Biotin-Apt與KAN的生物識(shí)別。首先，將BSA封閉后的醛基化磁珠與Biotin-Apt孵育后收集上清液，測(cè)試孵育前后DNA的吸光度。結(jié)果如圖3（a）所示，DNA的吸光度無(wú)明顯變化；而當(dāng)Biotin-Apt與MBs-KAN相互作用后，結(jié)果如圖3（b）所示，其上清液中游離的Biotin-Apt即黑線所示的吸光度，較孵育前Biotin-Apt的吸光度明顯降低，表明一定量的適配體與KAN識(shí)別后結(jié)合在MBs-KAN復(fù)合物表面。該結(jié)果不但進(jìn)一步表明了MBs-KAN的成功制備也驗(yàn)證了適配體與KAN的特異性識(shí)別。

圖3 紫外吸收光譜圖Fig.3 Ultraviolet absorption spectrum

2.4 適配體傳感器用于檢測(cè)KAN的可行性驗(yàn)證

為了驗(yàn)證該競(jìng)爭(zhēng)性適配體傳感器的競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)，設(shè)計(jì)了兩組實(shí)驗(yàn)：第一組實(shí)驗(yàn)是將MBs-KAN與Biotin-Apt孵育（不加入待測(cè)物KAN）作為對(duì)照組，另一組則通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5 μmol/L及更高濃度KAN加入此競(jìng)爭(zhēng)體系時(shí)，吸光度保持在一個(gè)很低的數(shù)值并且不會(huì)隨著濃度升高而有所下降，因此將MBs-KAN與Biotin-Apt孵育后加入過量的KAN（5 μmol/L）作為實(shí)驗(yàn)組。兩組實(shí)驗(yàn)在相同條件下進(jìn)行。結(jié)果如圖4所示，實(shí)驗(yàn)組（過量的KAN）的吸光度明顯低于對(duì)照組（無(wú)KAN）。這很可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)組中過量的游離KAN具備更小空間位阻，因而更易與Biotin-Apt結(jié)合。MBs-KAN復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的適配體的量較對(duì)照組大大減少，進(jìn)而后續(xù)HRP催化TMB的呈色效應(yīng)大大降低。通過兩組吸光度的差值，可以清楚看到磁珠表面KAN與樣品中KAN對(duì)適配體的競(jìng)爭(zhēng)識(shí)別能力差異明顯，因此該競(jìng)爭(zhēng)性適配體傳感策略具有實(shí)施的可能性。

圖4 驗(yàn)證可行性的紫外-可見吸收光譜圖Fig.4 UV-vis absorption spectrum for the feasibility verification

2.5 性能分析

2.5.1 適配體傳感器靈敏度測(cè)試為了研究該競(jìng)爭(zhēng)性比色傳感體系的檢測(cè)靈敏度，將一系列不同濃度的KAN加入該傳感器體系中，可以發(fā)現(xiàn)：隨著KAN濃度的增加（0～500 nmol/L），自然光下可清晰觀察到顯色程度不同的藍(lán)色發(fā)色產(chǎn)物，這表明該適配體傳感器可用于裸眼檢測(cè)KAN（見圖5（a））。同時(shí)，隨著KAN濃度的增加，在652 nm處的吸光度逐漸降低（見圖5（b））。此外，ΔA652nm與KAN濃度的對(duì)數(shù)值在0.05～500 nmol/L之間存在良好的線性關(guān)系（ΔA652nm=0.0427 lg cKAN+0.0557，R2=0.9871）（見圖5（c））。其中652 nm處的吸光度變化值ΔA652nm的計(jì)算公式如下：

圖5 靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Results of sensitivity detection

式中：Ac為對(duì)照組，即在無(wú)游離KAN的情況下，該適配體傳感器在652 nm處的吸光度；Ae為實(shí)驗(yàn)組，即待測(cè)樣的吸光度。

通過使用LOD=3σ/S公式估算，該傳感器的檢出限為0.21 nmol/L，其中空白溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為σ，S是校正曲線的斜率。

依據(jù)濃度計(jì)算公式：

式中：c為濃度，mol/L；n為物質(zhì)的量，mol；V為體積，L；m為質(zhì)量，g；M為KAN的摩爾質(zhì)量，g/mol。

將該傳感器的檢測(cè)限按公式換算可得0.122 μg/kg，遠(yuǎn)低于中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)牛奶中KAN規(guī)定的最高殘留限量200 μg/kg。

將該競(jìng)爭(zhēng)性比色適配體傳感器與其他檢測(cè)KAN的方法相比較，如表1所示，該方法不需要大型儀器，具有更寬的檢測(cè)范圍和更低的檢測(cè)限，優(yōu)勢(shì)明顯，可以應(yīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域KAN的痕量分析。

表1 現(xiàn)有檢測(cè)KAN的傳感器檢測(cè)性能比較Table 1 Detection performance comparison of existing KAN detecting sensors

2.5.2 特異性檢測(cè)為了探究該適配體傳感器對(duì)KAN的選擇性，選取與KAN結(jié)構(gòu)相似的氨基糖苷類抗生素進(jìn)行比較驗(yàn)證。KAN濃度為500 nmol/L，其他氨基糖苷類抗生素濃度是5 μmol/L，均為KAN的10倍。對(duì)照組（Blank組）為不加KAN組，按照上述1.3.4的步驟應(yīng)用該適配體傳感器檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。首先裸眼即可觀察到，實(shí)驗(yàn)組（KAN組）溶液顏色明顯淺于對(duì)照組與其余組溶液顏色；而柱形圖結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，只有實(shí)驗(yàn)組具有明顯的吸光度變化，而其他氨基糖苷類抗生素的吸光度變化與實(shí)驗(yàn)組相比，幾乎可忽略。該結(jié)果表明，該競(jìng)爭(zhēng)性生物識(shí)別的比色適配體傳感器對(duì)KAN具有良好的選擇性。

圖6 競(jìng)爭(zhēng)性比色適配體傳感器對(duì)KAN的選擇性Fig.6 Selectivity of competitive colorimetric aptamer sensors for KAN

2.5.3 實(shí)際樣品檢測(cè)為了進(jìn)一步驗(yàn)證該檢測(cè)方法在實(shí)際樣品分析中的適用性，將不同濃度的KAN加到牛奶樣品中，如表2所示，回收率為93.8%～102.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～6.3%，可以看出該策略在牛奶實(shí)際樣品中有較好的精確性和重現(xiàn)性，說明該比色適配體傳感器可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

表2 牛奶樣品中加標(biāo)的KAN檢測(cè)Table 2 Detection of KAN spiked in milk samples

3 結(jié)語(yǔ)

作者開發(fā)了一種基于磁珠表面競(jìng)爭(zhēng)性生物識(shí)別的比色適配體傳感器，通過磁珠表面連接的KAN以及檢測(cè)樣本中的KAN與適配體的競(jìng)爭(zhēng)性生物識(shí)別性能的差異來(lái)構(gòu)建應(yīng)用于檢測(cè)KAN的比色傳感策略。該生物傳感器的設(shè)計(jì)核心在于利用磁珠、KAN與適配體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)體系的構(gòu)建。首先磁珠和KAN的共價(jià)交聯(lián)，保證了競(jìng)爭(zhēng)體系的穩(wěn)定性；另外由于磁珠的存在，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作的同時(shí)也有利于降低實(shí)驗(yàn)背景，提高檢測(cè)靈敏度；最后KAN與適配體的生物識(shí)別也確保了該方法的特異性檢測(cè)?？傊?，該方法操作簡(jiǎn)便、快速，擁有較寬的檢測(cè)范圍和較低的檢測(cè)限，在抗生素檢測(cè)方面具備良好的應(yīng)用前景，同時(shí)也為食品安全領(lǐng)域其他污染物的快速檢測(cè)提供了良好思路。