結(jié)球甘藍(lán)SET 基因家族鑒定與表達(dá)分析

王麗芳，潘 飛，宋江華

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，合肥 230036)

SET（Su(var)3-9，Enhancer of zeste和Trithorax，SET）基因家族廣泛存在于動(dòng)物、植物和真菌等真核生物細(xì)胞中，是一組含有SET 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)統(tǒng)稱，在生物進(jìn)化過程中具有高度的保守性。SET 結(jié)構(gòu)域是由大約130 個(gè)氨基酸殘基組成的保守序列，因其最初在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）的3 個(gè)調(diào)節(jié)因子Su(var)3-9[1]、Enhancer of zeste[2]和Triohoarx[3]中發(fā)現(xiàn)而得名[4-7]。

植物SET基因功能復(fù)雜，參與染色體的包裝和分離、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)以及DNA 的復(fù)制和修復(fù)等，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[8-9]。目前，在模式植物擬南芥（Arabidopsisthaliana）和水稻（Oryza sativa）中已對(duì)SET基因家族的保守性及系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了研究[10]。 SET 蛋白特異性修飾組蛋白的不同位點(diǎn)，進(jìn)而修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和調(diào)控基因的表達(dá)，因此SET 蛋白表達(dá)失調(diào)，將影響植物各種發(fā)育和生理過程[11-14]。

結(jié)球甘藍(lán)(Brassica oleraceavar.capitata)為十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)植物，具有高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、適應(yīng)性強(qiáng)、易貯耐運(yùn)等特點(diǎn)，是世界廣泛栽培的蔬菜作物[15]。植物中SET基因數(shù)量較其他物種偏多，SET 蛋白在不同植物各組織中表達(dá)差異較大，因此對(duì)結(jié)球甘藍(lán)SET基因家族進(jìn)行系統(tǒng)鑒定和表達(dá)分析十分必要，有助于為結(jié)球甘藍(lán)SET基因家族功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜育種工程實(shí)驗(yàn)室選育的結(jié)球甘藍(lán)（B.oleracea）“Bo01-12B”品種為試驗(yàn)材料，于溫室中常規(guī)栽培管理，采集健康植株蓮座期的根、莖、葉和開花期的花蕾、花，液氮速凍，并迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。結(jié)球甘藍(lán)花蕾按大小分級(jí)取材，對(duì)應(yīng)于花粉發(fā)育的不同時(shí)期（S1花粉母細(xì)胞時(shí)期：0～1 mm；S2 四分體時(shí)期：1～2 mm；S3 單核花粉期：2～3.5 mm； S4 雙核花粉期：3.5～5 mm；S5 成熟花粉期：＞ 5 mm；P: 不同花粉發(fā)育時(shí)期混合花蕾）。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)球甘藍(lán)SET基因家族的鑒定及生物信息學(xué)分析 SET 蛋白 (PF00856) 的隱馬爾可夫模型(hidden Markov model，HMM)文件從Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得。利用SET 蛋白的HMM 序列文件，在BrassicaDatabase (http://brassicadb.org/brad)中以B.oleracea全基因組為數(shù)據(jù)庫(kù)，通過 BLASTp 和tBLASTn 搜索出結(jié)球甘藍(lán)SET 蛋白序列和相關(guān)基因注釋文件。利用Pfam[16]和SMART[17]兩個(gè)在線網(wǎng)站對(duì)SET 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行識(shí)別，刪除不含SET 結(jié)構(gòu)域的基因。利用MEGA 7.0 軟件的Clustal W 程序進(jìn)行序列比對(duì)。

利用 MEGA 7.0 軟件， 采用鄰接法(neighbor-joining method)并進(jìn)行1 000 次重復(fù)構(gòu)建結(jié)球甘藍(lán)SET基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。利用ExPASy (http://www.expasy.org/tools/protparam)在線分析SET基因的理化性質(zhì)。利用GSDS(Gene Structure Display Server)(http://gsds1.cbi.pku.edu. cn/)繪制候選SET基因結(jié)構(gòu)圖。利用MEME(http：//meme-suite.org/)分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域（保守結(jié)構(gòu)域最大基序數(shù)量設(shè)置為10 個(gè)，其余參數(shù)默認(rèn)）。由結(jié)球甘藍(lán)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得基因的染色體位置，采用 MG2C 在線網(wǎng)站(http:/mg2c.iask.in/mg2c_v2.0)對(duì)SET基因進(jìn)行染色體定位。

1.2.2SET基因在結(jié)球甘藍(lán)不同器官的qRT-PCR 分析 根據(jù)結(jié)球甘藍(lán)SET基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果，從7 個(gè)亞家族中分別隨機(jī)選擇1 個(gè)SET基因，用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)PCR 引物(表1)。利用Trizol 法分別提取根、莖、葉、花蕾、花等不同樣本RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，利用KOD SYBR qPCR Mix(TOYOBO)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR），對(duì)各基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。結(jié)球甘藍(lán)SET基因的相對(duì)表達(dá)量采用 2-ΔΔCT法計(jì)算。

表1 結(jié)球甘藍(lán)SET 基因的qRT-PCR 引物序列Table 1 Real-time quantitative PCR primer sequences of SET domain-containing genes in B. oleracea

1.2.3SET基因在結(jié)球甘藍(lán)花蕾發(fā)育不同時(shí)期的RT-PCR 分析 為進(jìn)一步探究SET基因在結(jié)球甘藍(lán)花蕾不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，通過半定量PCR（RT-PCR）方法進(jìn)一步分析結(jié)球甘藍(lán)花蕾發(fā)育5 個(gè)不同時(shí)期（S1、S2、S3、S4和S5）SET基因的差異表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)球甘藍(lán)SET 結(jié)構(gòu)域基因的鑒定和理化性質(zhì)分析

利用 HMMER 軟件及 SMART 等網(wǎng)站在結(jié)球甘藍(lán)中鑒定出28 個(gè)SET基因家族成員(表2)，對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)球甘藍(lán)SET基因開放閱讀框在765 (Bol024624)～5 088 (Bol027564) bp 之間，編碼254～1 695 個(gè)氨基酸。相對(duì)分子質(zhì)量在29.20～185.16 kDa 之間，差異較大。此外，結(jié)球甘藍(lán)SET結(jié)構(gòu)域蛋白等電點(diǎn)預(yù)測(cè)值在5.02 ～ 9.06 之間，其中13 個(gè)SET 蛋白的等電點(diǎn)低于7.0。結(jié)球甘藍(lán)28 個(gè)SET基因不均勻分布在8 條染色體上。6 號(hào)染色體上分布的數(shù)量最多，為5 個(gè)；而1 號(hào)染色體上不含有SET基因。

表2 結(jié)球甘藍(lán)SET 基因的理化性質(zhì)Table 2 Physical and chemical properties of B. oleracea SET domain-containing genes

2.2 結(jié)球甘藍(lán)SET 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

為研究分析結(jié)球甘藍(lán)SET基因之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，將鑒定獲得的28 個(gè)SET 蛋白序列，利用軟件MEGA7.0 通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，結(jié)球甘藍(lán)28個(gè)SET結(jié)構(gòu)域基因分為7個(gè)亞家族(圖1)。

圖1 結(jié)球甘藍(lán)SET 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 1 Phylogenetic tree of SET domain-containing genes in B. oleracea

亞家族I 包括3 個(gè)基因，包含pre-SETCXC、SET 兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。其中Bol018423和Bol040761親緣關(guān)系較近，屬于同一分支，Bol011402單獨(dú)分為一支。亞家族II 包括6 個(gè)基因，基本保守結(jié)構(gòu)域模型為AWS-SET-Post-SET，其中AWS 為SET 相關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域，Post-SET 為后-SET 結(jié)構(gòu)域，Bol023819、Bol044511、Bol030053和Bol029500均為此結(jié)構(gòu)，

親緣關(guān)系較近，屬同一分支，而Bol012978和Bol027564親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，屬不同分支。亞家族III包括 4 個(gè)基因，保守結(jié)構(gòu)域模型為 PWWPPHD-PHD-SET-Post-SET。其中 PWWP 為PWWP保守結(jié)構(gòu)域，PHD 為PHD 鋅指。亞家族IV 包含PHD-SET 兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，共有 4 個(gè)基因，其中Bol022437、Bol024624和Bol043727親緣關(guān)系較近，屬于同一分支。亞家族V 包括6 個(gè)基因，分為2 個(gè)分支，Bol024169單獨(dú)成一個(gè)分支，其余基因聚為另一分支。根據(jù)是否含有Post-SET 結(jié)構(gòu)域?qū)⒘硪环种Ъ?xì)分為兩個(gè)亞支。第一亞支包含2 個(gè)基因，保守結(jié)構(gòu)域模型為SRA-YDG-Pre-SET-SET-Post-SET，其中SRA-YDG 為SET 和RING finger 關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域，Pre-SET 是位于N 末端的前-SET 結(jié)構(gòu)域；第二亞支包含 3 個(gè)基因，結(jié)構(gòu)域模型為 SRA-YDGPre-SET-SET。亞家族VI 的結(jié)構(gòu)域模型為SET-Post-SET，包括2 個(gè)基因。亞家族VII 只含有SET 一個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括3 個(gè)成員。

2.3 結(jié)球甘藍(lán)SET 蛋白保守基序分析

保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和排列方式可以反映基因家族不同成員間序列和結(jié)構(gòu)上的差異程度。結(jié)球甘藍(lán)SET 蛋白包含多個(gè)保守基序，這些基序可能對(duì)激活SET基因進(jìn)行特殊表達(dá)具有重要作用。為識(shí)別結(jié)球甘藍(lán)SET基因家族成員的潛在保守基序，利用在線保守基序分析軟件MEME 進(jìn)行預(yù)測(cè)性分析。從結(jié)球甘藍(lán)SET 蛋白中檢測(cè)到10 個(gè)不同的保守基序(圖2)。同一亞家族的SET 蛋白含有的保守基序的類別、數(shù)量和排列方式大體一致，不同亞家族之間保守基序的種類和排列位置差異較大。Motif 6 為SET 結(jié)構(gòu)域，28 個(gè)SET 蛋白均含有該結(jié)構(gòu)域，Motif 3 和Motif 4緊密相連，主要存在于第I、II 和V 亞家族SET 蛋白中。在第II 亞家族中，Motif10 和Motif 2、Motif 1和Motif 7 以及Motif 4 和Motif 3 分別緊密相連且按照一定順序排列。Motif 5 主要存在于亞家族I 和II 中。

圖2 結(jié)球甘藍(lán)SET 基因保守基序組成Figure 2 Motifs compositions of SET domain-containing genes in B. oleracea

2.4 結(jié)球甘藍(lán)SET 基因結(jié)構(gòu)分析

通過GSDS 分析結(jié)球甘藍(lán)SET基因的內(nèi)含子和外顯子，發(fā)現(xiàn)其一級(jí)結(jié)構(gòu)差異明顯(圖3)，表明結(jié)球甘藍(lán)SET基因家族成員結(jié)構(gòu)的多樣性。在基因長(zhǎng)度方面，第IV 分支所包含基因的基因長(zhǎng)度差異最大，Bol013303基因長(zhǎng)度為所有基因中最長(zhǎng)，Bol024624基因長(zhǎng)度為最短。所有基因中內(nèi)含子數(shù)目差異明顯，其中Bol027418、Bol027257和Bol037943 基因不含內(nèi)含子，而Bol018289、Bol010867和Bol042363基因內(nèi)含子數(shù)目超過20 個(gè)。每個(gè)SET基因的CDS 被不同數(shù)量?jī)?nèi)含子分割，并且同一分支的基因在基因結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)一定的相似性。同一亞家族內(nèi)基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守基序的相似性證實(shí)了在同一亞家族內(nèi)的成員之間具有較近的同源關(guān)系。

圖3 結(jié)球甘藍(lán)SET 基因的基因結(jié)構(gòu)圖Figure 3 Gene structure map of SET domain-containing genes in B. oleracea

2.5 結(jié)球甘藍(lán)SET 基因的組織特異表達(dá)分析

對(duì)不同亞家族中7 個(gè)SET基因在結(jié)球甘藍(lán)各組織器官中的qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)，7 個(gè)基因在甘藍(lán)花蕾中均有較高的表達(dá)，而在葉片中不表達(dá)，在根、莖和花中均有不同程度的表達(dá)（圖4）。其中，Bol040761、Bol027607和Bol043727這3 個(gè)基因在不同組織中表達(dá)模式相似，均在花蕾中表達(dá)量最高，根中次之，莖和花中表達(dá)量持平。Bol025176基因在花蕾中表達(dá)量最高，花中次之，根和莖中表達(dá)量較低。Bol011910基因在花蕾中超高表達(dá)，在根、莖和花中表達(dá)量較弱。Bol042363基因在根中表達(dá)量略高，花蕾中表達(dá)量也較高。而Bol030053基因在各組織中的表達(dá)量均較低，在花蕾中表達(dá)相對(duì)較高。

圖4 結(jié)球甘藍(lán)SET 結(jié)構(gòu)域基因家族表達(dá)模式分析Figure 4 Expression profiles of SET domain genes in B. oleracea

2.6 結(jié)球甘藍(lán)SET 基因在花蕾不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

由于qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)7 個(gè)SET基因在結(jié)球甘藍(lán)花蕾中表達(dá)量均較高，我們進(jìn)一步利用RT-PCR方法對(duì)SET基因在結(jié)球甘藍(lán)花粉發(fā)育的5 個(gè)不同時(shí)期的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。 結(jié)果表明，7 個(gè)SET基因均在S1 期即花粉母細(xì)胞時(shí)期表達(dá)，Bol030053和Bol025176基因在花蕾S2 期即四分體時(shí)期也有表達(dá)。而在結(jié)球甘藍(lán)花粉發(fā)育的S3—S5（即單核花粉期、雙核花粉期和成熟花粉期）沒有發(fā)現(xiàn)SET基因的表達(dá)（圖5）。

圖5 SET 結(jié)構(gòu)域基因在結(jié)球甘藍(lán)花蕾發(fā)育不同時(shí)期中表達(dá)Figure 5 Expression analysis of SET domain genes in different developmental stages of flower buds in B. oleracea

3 討論與結(jié)論

SET 蛋白作為調(diào)控蛋白或蛋白復(fù)合體的結(jié)合位點(diǎn)，參與染色體的濃縮和分離，基因的轉(zhuǎn)錄，以及DNA 的復(fù)制和修復(fù)等。大量包含SET 結(jié)構(gòu)域蛋白的發(fā)現(xiàn)，及其對(duì)于組蛋白賴氨酸甲基化的作用，為我們深入了解組蛋白密碼的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了重要的信息[18]。本研究利用生物信息學(xué)方法首次在甘藍(lán)中鑒定得到28個(gè)SET基因家族成員, 數(shù)量上低于擬南芥、水稻、和谷子(Setaria italica)等作物中已分別鑒定的47、43 和53 個(gè)SET 蛋白[19-21]，可能是由于不同作物基因組大小有差異，且基因組中發(fā)生大規(guī)模的基因片段復(fù)制事件的概率不同等原因造成的。

通過進(jìn)化分析，將結(jié)球甘藍(lán)的28 個(gè)SET基因分為7 個(gè)亞族。這與擬南芥、水稻、玉米、雷蒙德氏棉中SET基因分類相似[10,21-22]。在同一個(gè)亞族內(nèi)，SET基因家族成員的外顯子-內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)特征較為接近。第V 亞家族成員基本不含有內(nèi)含子，外顯子序列較長(zhǎng)；第I 和III 亞家族成員所含內(nèi)含子數(shù)目較多；第II 亞家族SET基因上內(nèi)含子基本均勻分布。對(duì)保守結(jié)構(gòu)域的分析表明，結(jié)球甘藍(lán)中SET基因的絕大多數(shù)保守域和擬南芥的相同，如第II 亞族Bol012978在AWS 結(jié)構(gòu)域的上游還存在一個(gè)PHD結(jié)構(gòu)域，與擬南芥ASHR3和SDG736蛋白結(jié)構(gòu)相似。第V 亞族Bol024169不包含YDG 結(jié)構(gòu)域，但在N末端存在一個(gè)WIYLD 保守結(jié)構(gòu)域，而該結(jié)構(gòu)域是植物特有的，在擬南芥SUVR1、SUVR2、SUVR4基因以及其他植物品種的SUVR同源基因中均發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域[23]。然而，在第I 亞族Bol011402和Bol040761基因中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)CXC 結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)CXC 結(jié)構(gòu)域是水稻SET結(jié)構(gòu)域基因特有的，并不存在于擬南芥中[24]。由此推斷SET 蛋白在進(jìn)化的過程中，可能通過產(chǎn)生新的結(jié)構(gòu)域來適應(yīng)環(huán)境變化。

為探究SET基因在結(jié)球甘藍(lán)不同組織中的表達(dá)模式，通過qRT-PCR 對(duì)7 個(gè)SET基因的表達(dá)圖譜進(jìn)行分析。結(jié)果表明，7 個(gè)SET基因在除了葉以外的器官普遍表達(dá)，尤其在花蕾中的表達(dá)量較高，與Thakur 等在水稻不同組織中的研究結(jié)果[25]相似。但Yadav 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，約75%SET基因在谷子葉中有所表達(dá)。這表明SET基因在不同作物的不同組織中表達(dá)存在差異。SET基因?qū)Y(jié)球甘藍(lán)葉片的生長(zhǎng)發(fā)育影響較小，但是對(duì)根和花蕾的生長(zhǎng)發(fā)育有一定影響，尤其是花蕾。

為進(jìn)一步揭示SET基因?qū)Ω仕{(lán)花蕾發(fā)育各個(gè)時(shí)期的影響，通過RT-PCR 對(duì)SET基因在結(jié)球甘藍(lán)花蕾不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)7 個(gè)SET基因均在S1 期即花粉母細(xì)胞時(shí)期表達(dá)，而隨著花蕾的發(fā)育，SET結(jié)構(gòu)域基因的表達(dá)逐漸減弱。這表明SET基因可能參與調(diào)控了結(jié)球甘藍(lán)花粉發(fā)育的早期過程。張亮生[24]發(fā)現(xiàn)SET基因家族在擬南芥花發(fā)育過程中表達(dá)較高。ATXI基因通過激活花的同源異型基因來參與花的發(fā)育[26-27]。水稻OsSDG724通過甲基化OsMADS50染色質(zhì)調(diào)節(jié)開花[28]。Liu 等研究發(fā)現(xiàn)水稻OsSDG708控制水稻開花時(shí)間并參與許多生物過程[29]。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)球甘藍(lán)SET基因在花粉發(fā)育初期表達(dá)，可能參與調(diào)控花粉母細(xì)胞的生成及花粉四分體的發(fā)育，為深入探究結(jié)球甘藍(lán)SET基因家族在花粉發(fā)育過程中的功能奠定基礎(chǔ)。

本研究通過生物信息學(xué)分析鑒定出28 個(gè)結(jié)球甘藍(lán)SET家族基因，共分7 個(gè)亞家族，其基因結(jié)構(gòu)保守，亞家族各成員保守基序類別和排列方面具有相似性。同時(shí)分析了7 個(gè)選取SET基因在甘藍(lán)不同組織中的表達(dá)模式，qRT-PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)SET基因在結(jié)球甘藍(lán)花蕾中表達(dá)量較高，RT-PCR 分析進(jìn)一步表明它們?cè)诟仕{(lán)花粉發(fā)育早期高表達(dá)，而花粉發(fā)育晚期表達(dá)減弱。推測(cè)結(jié)球甘藍(lán)SET基因家族可能在結(jié)球甘藍(lán)花粉發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果將為進(jìn)一步深入探索SET蛋白對(duì)結(jié)球甘藍(lán)花粉發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。本研究中，我們并未對(duì)所有的28 個(gè)SET基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。其他SET基因家族成員的組織表達(dá)情況有待今后深入研究。