超聲輔助提取-反相高效液相色譜法測(cè)定蝦中三磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的含量

周漪波,王和平,胡雪玉,鄧遠(yuǎn)強(qiáng),阮奇珺,張 飛

(廣東省科學(xué)院測(cè)試分析研究所(中國(guó)廣州分析測(cè)試中心),廣東省化學(xué)測(cè)量與應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省保健食品功效成分檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)快速篩查工程技術(shù)研究中心,廣州 510070)

蝦是常見的水產(chǎn)品,其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美,富含蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等[1-2]。蝦死后,蝦肉會(huì)發(fā)生一系列生化反應(yīng),最終影響蝦的品質(zhì)[3-4]。鮮度是衡量蝦肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,直接決定了產(chǎn)品的食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5]。一般采用電子鼻、色差儀和質(zhì)構(gòu)儀分析蝦的氣味、色澤和質(zhì)構(gòu)等,從而對(duì)蝦的鮮度進(jìn)行評(píng)價(jià)。然而,這些方法對(duì)儀器要求較高,檢測(cè)結(jié)果易受樣品影響,且不適合大批量樣品的檢測(cè)。在多種酶的催化下,魚肉中的三磷酸腺苷(ATP)依次降解為二磷酸腺苷(ADP)、腺苷酸(AMP)、肌苷酸(IMP)、肌苷(Hx R)和次黃嘌呤(Hx)[6]。文獻(xiàn)[7]將Hx R、Hx的總和與ATP及其關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的總和的百分比定義為K值。而且已有學(xué)者將K值用于蝦鮮度的評(píng)估[8-9]。

ATP及其關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[9]、濾紙電泳分析法[10]和可視化嗅覺技術(shù)-高效液相色譜法[11]等,相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法為SC/T 3048-2014《魚類新鮮度指標(biāo)K值的測(cè)定 高效液相色譜法》。但該標(biāo)準(zhǔn)方法存在以下問題:①可能存在基質(zhì)效應(yīng),造成干擾;②流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液,不含有機(jī)溶劑,容易造成部分雜質(zhì)殘留在色譜柱內(nèi);③色譜分離時(shí)間較長(zhǎng),容易造成緩沖溶液鹽析。鑒于此,本工作提出了超聲輔助提取-反相高效液相色譜法快速測(cè)定蝦中ATP及其關(guān)聯(lián)產(chǎn)物含量的方法,采用該方法考察了貯藏條件對(duì)K值的影響,為蝦的保鮮技術(shù)和其他水產(chǎn)品的K值測(cè)定提供數(shù)據(jù)支持和技術(shù)借鑒。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀,配紫外檢測(cè)器;BT125D型電子天平;T18 digital ULTRATURRAX?型均質(zhì)機(jī);FB15067型超聲波清洗器;Eutech PH700型臺(tái)式pH計(jì);MILLI-Q超純水系統(tǒng)。

ATP、ADP、IMP單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:分別稱取一定量的ATP、ADP、IMP標(biāo)準(zhǔn)品,用水溶解,配制成質(zhì)量濃度為1.000 g·L-1的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于4℃冰箱中保存,保存期不超過7 d。

AMP、Hx R、Hx單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:分別稱取一定量的AMP、Hx R、Hx標(biāo)準(zhǔn)品,用水溶解并定容至10 mL(其中AMP和Hx先加5 mL水,再加2滴鹽酸助溶,最后用水定容),配制成質(zhì)量濃度為5.000×10-1g·L-1的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于4℃冰箱中保存,保存期不超過7 d。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:移取適量的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用水逐級(jí)稀釋,配制成ATP、ADP、IMP質(zhì)量濃度 為1.250×10-1,2.500,5.000,2.500×10,5.000×10,1.000×102mg·L-1,AMP、Hx R、Hx質(zhì)量濃度為6.250×10-2,1.250,2.500,1.250×10,2.500×10,5.000×10 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,現(xiàn)配現(xiàn)用。

ATP、ADP、AMP、IMP、Hx R、Hx標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不小于97%;甲醇為色譜純;磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、高氯酸、鹽酸均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

Ultimate?XB-C4反相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱溫30℃;流動(dòng)相A為0.048 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(pH 5.7),流動(dòng)相B為甲醇;流量1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量20μL;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。梯度洗脫程序:0～4.0 min時(shí),B為0;4.0～7.0 min時(shí),B由0升 至16.2%,保 持1.0 min;8.0～8.1 min時(shí),B由16.2%跳轉(zhuǎn)至0,保持4.9 min。

1.3 試驗(yàn)方法

蝦樣品購于超市,充氧后迅速送至實(shí)驗(yàn)室,去頭、去殼、去蝦線后,用水清洗,瀝干表面水分,用粉碎機(jī)粉碎均勻后立即進(jìn)行試驗(yàn)。

稱取2.0 g(精確至0.001 g)粉碎后的蝦肉于50 mL具塞離心管中,加入10%(體積分?jǐn)?shù),下同)高氯酸溶液20 mL,在冰水浴中以10 000 r·min-1轉(zhuǎn)速均質(zhì)1 min,超聲提取5 min,于4℃以8 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心2 min,取上清液。移取5%(體積分?jǐn)?shù),下同)高氯酸溶液20 mL,清洗均質(zhì)機(jī)刀頭后轉(zhuǎn)移至殘?jiān)?重復(fù)上述操作,合并兩次上清液,用水定容至50 mL。分取5 mL于比色管中,用5.0 mol·L-1和2.5 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液酸度至pH 6.0～6.4,再用0.048 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(pH 5.7)定容至10 mL,按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(ATP、ADP、IMP的質(zhì)量濃度為50.00 mg·L-1,AMP、Hx R、Hx的質(zhì)量濃度為25.00 mg·L-1)和基圍蝦樣品溶液,所得色譜圖見圖1。

圖1 色譜圖Fig.1 Chromatograms

由圖1可見:11 min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)6種目標(biāo)物的快速分離,而且峰形良好,分離度較高。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱

ATP及其關(guān)聯(lián)產(chǎn)物均為極性化合物,而且結(jié)構(gòu)相似,因此需要選擇合適的反相色譜柱才能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的快速分離[12]。反相色譜柱固定相的碳鏈越長(zhǎng),疏水性越強(qiáng),目標(biāo)物的保留時(shí)間越長(zhǎng)。為了縮短分析時(shí)間,本工作選擇Ultimate?XB-C4、Venusil ASB-C8、Ultimate?XB-C18等3種反相色譜柱進(jìn)行比較。

結(jié)果表明,在其他色譜條件一致的情況下,Ultimate?XB-C4反相色譜柱可實(shí)現(xiàn)6種目標(biāo)物的快速分離,而且峰形良好,與理論預(yù)期相符[13]。因此,試驗(yàn)選擇Ultimate?XB-C4反相色譜柱。

2.2.2 流動(dòng)相

流動(dòng)相中添加鹽溶液,可抑制目標(biāo)物解離,確保色譜峰峰形良好。試驗(yàn)選擇乙酸銨溶液和磷酸二氫鉀溶液進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明:選用乙酸銨溶液時(shí),ATP和ADP色譜峰拖尾嚴(yán)重,這是由于二者均含有堿性氨基,容易與鍵合相表面殘余的硅醇基相互作用,并且儀器中的鋼組件表面涂有金屬氧化物,這些金屬氧化物的活性位點(diǎn)易與活性分子相結(jié)合,而磷酸二氫鉀溶液可有效降低上述兩種作用力;進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)磷酸二氫鉀溶液濃度為0.048 mol·L-1時(shí),各目標(biāo)物均可實(shí)現(xiàn)良好分離,不需要再添加磷酸氫二鉀[14]。因此,試驗(yàn)選擇流動(dòng)相中的鹽溶液為0.048 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液。

流動(dòng)相中常用的有機(jī)溶劑為乙腈和甲醇,添加有機(jī)溶劑可縮短分析時(shí)間。與甲醇相比,在流動(dòng)相中添加乙腈時(shí),產(chǎn)生的鬼峰多、干擾大,而且乙腈成本高,毒性較大;并且本方法的檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm,甲醇的末端吸收不影響檢測(cè)。綜合考慮,試驗(yàn)選擇流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑為甲醇。

2.3 前處理方法的選擇

加入10%高氯酸溶液提取溶劑后,樣品會(huì)出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象,試驗(yàn)分別采用渦旋振蕩法[14]和超聲輔助提取法對(duì)樣品進(jìn)行處理,結(jié)果見圖2。

圖2 不同前處理方法對(duì)比Fig.2 Comparison of different pretreatment methods

由圖2可知,采用超聲輔助提取法時(shí),ATP及其關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的測(cè)定值較高,并且超聲波特殊的物理性質(zhì)可有效破壞蝦肉細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的快速充分提取[15]。因此,試驗(yàn)選擇的前處理方法為超聲輔助提取法。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

按照儀器工作條件對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定,以各目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性參數(shù)見表1。

分別以信噪比為3和10時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為檢出限和測(cè)定下限,結(jié)果見表1。

表1 線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab.1 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度試驗(yàn)

2.5.1 儀器精密度

對(duì)ATP、ADP、IMP質(zhì)量濃度為25.00 mg·L-1,AMP、Hx R、Hx質(zhì)量濃度為12.50 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算得6種目標(biāo)物峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.28%～1.4%,表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性

取同一批樣品,平行制備6份供試品溶液,按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算得6種目標(biāo)物測(cè)定值的RSD為3.5%～8.7%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)新鮮對(duì)蝦樣品進(jìn)行低、中、高等3個(gè)濃度水平的回收試驗(yàn),結(jié)果見表2。對(duì)于超出線性范圍的樣品,稀釋后再進(jìn)樣分析。

由表2可知,6種目標(biāo)物的回收率為75.3%～114%,滿足試驗(yàn)要求。

表2 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of test for recovery

2.7 貯藏條件對(duì)K值的影響

按照試驗(yàn)方法測(cè)定不同貯藏溫度和貯藏時(shí)間下對(duì)蝦中ATP、ADP、AMP、IMP、Hx R、Hx的含量,按照公式(1)計(jì)算K值,結(jié)果見圖3。

圖3 貯藏條件對(duì)K值的影響Fig.3 Effect of the storage condition on the K value

式中:XATP、XADP、XAMP、XIMP、XHxR、XHx為樣品中ATP、ADP、AMP、IMP、Hx R、Hx的質(zhì)量摩爾濃度,mmol·kg-1。

由圖3可知:隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)蝦的K值逐漸增大;并且貯藏時(shí)間一定時(shí),貯藏溫度越低,K值增大速率越慢,說明溫度越低,越有利于對(duì)蝦的保鮮。

本工作以C4反相色譜柱為固定相,提出了超聲輔助提取-反相高效液相色譜法測(cè)定蝦中ATP、ADP、AMP、IMP、Hx R、Hx含量的方法,并以此計(jì)算對(duì)蝦的K值。該方法操作簡(jiǎn)便、分析時(shí)間短、靈敏度高,適用于大批量樣品分析。目前,關(guān)于C4色譜柱的應(yīng)用報(bào)道較少,本工作研究表明C4色譜柱適用于核苷酸類化合物的快速分析,可為相關(guān)項(xiàng)目分析提供借鑒,同時(shí)為其他水產(chǎn)品的檢測(cè)提供方法參考。