禽腺病毒血清4型QHD2021株的分離鑒定和全基因序列分析

陳 玥,何云鳳,劉優(yōu)優(yōu),吳同壘,李佩國,李蘊(yùn)玉,張建文

(河北科技師范學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 秦皇島 066604)

心包積水-肝炎綜合征(hydropericardium hepatitis syndrome,HHS)是由Ⅰ群腺病毒血清4型(fowl adenovirus 4,FAdV-4)引起雞的一種具有高傳染性的傳染病。1987年，HHS在巴基斯坦安卡拉地區(qū)首次報(bào)道，所以本病也稱為“安卡拉病”(Angara disease)[1]，隨后在澳大利亞、日本、韓國等地相繼報(bào)道[2-3]。該病主要危害肉雞，典型癥狀是3～5 周齡肉雞突然死亡，并伴隨有心包積水和肝炎，死亡率為30%～70%，最高可達(dá)80%，死亡高峰持續(xù)4～8 d[4]。自2015年以來，F(xiàn)AdV-4在中國許多肉雞場暴發(fā),包括山東、河南、江蘇、安徽、湖北、江西等[5]，嚴(yán)重地阻礙我國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。

目前，已經(jīng)鑒定的Ⅰ群腺病毒有A、B、C、D、E共5個(gè)種，12個(gè)血清型[6]，引起HHS的病原主要為FAdV-4，其余血清型均能引起包涵體肝炎。我國目前FAdV主要流行株為C、D、E 3個(gè)種，其中C種FAdV以血清4型為主[7]。FAdV是二十面體無囊膜的雙鏈DNA病毒，F(xiàn)AdV-4的主要結(jié)構(gòu)蛋白為纖維蛋白(Fiber)、五鄰體蛋白(Penton)和六鄰體蛋白(Hexon)[8]。研究表明，Hexon蛋白攜帶主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇和次要的種特異性抗原決定簇，可以引起極強(qiáng)的中和反應(yīng)，能被中和抗體識(shí)別表位，且Hexon 基因高度保守，因此Hexon蛋白能夠準(zhǔn)確區(qū)分FAdV的血清型[9-10]。Hexon基因編碼的氨基酸差異會(huì)影響FAdV的致病性[11]。Penton蛋白可與其他蛋白結(jié)合幫助病毒滲透和進(jìn)入細(xì)胞[12]。Fiber蛋白包括長纖突蛋白(Fiber-1)和短纖突蛋白(Fiber-2)，纖突蛋白可識(shí)別細(xì)胞膜上的特異性受體,病毒粒子通過纖突蛋白與細(xì)胞膜受體結(jié)合并侵入細(xì)胞[13]。

為了解河北省FAdV-4基因組的特征和致病性，本試驗(yàn)對(duì)河北秦皇島養(yǎng)殖場疑似感染FAdV-4的病死雞樣品進(jìn)行病原的分離與鑒定遺傳進(jìn)化分析和致病性試驗(yàn)，為我國FAdV-4的致病機(jī)理的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料來源和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病料來源于河北秦皇島某養(yǎng)殖場有明顯心包積液和肝臟腫大、出血等疑似FAdV-4癥狀的病死雞。無菌采集其心臟、肝臟等組織，—80℃保存?zhèn)溆茫籗PF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，由本實(shí)驗(yàn)室孵育，飼養(yǎng)至3周齡。

1.2 主要試劑雞肝癌細(xì)胞(LMH)購自北京北納生物公司，由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；病毒DNA提取試劑盒購自天根生物有限公司；2×Taq PCR Mix、Gold View核酸染液、DL2000 DNA Marker均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；青鏈霉素、0.25%胰蛋白酶、DMSO購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)及合成根據(jù)GenBank中的FAdV-4標(biāo)準(zhǔn)毒株ON1株(登錄號(hào)：GU188428)Hexon基因序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)檢測(cè)引物Hexon-R和Hexon-F(表1)，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為945 bp。設(shè)計(jì)FAdV-4全基因檢測(cè)引物39對(duì)(表2)。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 Hexon基因引物序列信息

表2 全基因測(cè)序引物

1.4 FAdV-4的PCR鑒定將病死雞心臟和肝臟剪碎，加入滅菌生理鹽水，再加入終濃度為100 U/mL 的青鏈霉素，使用組織勻漿機(jī)將組織磨成勻漿。放入-80℃反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心10 min。按照病毒DNA提取試劑盒說明書提取病毒DNA。以提取的DNA為模板，根據(jù)設(shè)計(jì)的檢測(cè)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系20 μL：2×Premix Taq mix 10 μL，DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足體系。PCR的反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 30 s，46℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 FAdV-4的細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定取PCR鑒定為陽性的病死雞的肝臟、心臟勻漿上清液，過濾除菌后，接種到已長成單層LMH上，使病毒吸附2 h，棄掉病毒液，加入細(xì)胞維持液(DMEM/F12+2%FBS)，37℃、5%CO2培養(yǎng)2～3 d，每12 h觀察1次。出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變(CPE)則可收集病毒液。若沒有出現(xiàn)CPE，在培養(yǎng)72 h后收集上清，提取DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，若為陽性則盲傳下一代，若為陰性則棄掉。收集有病變的細(xì)胞上清液，提取DNA，進(jìn)行PCR鑒定。

1.6 純化病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)測(cè)定取1.5中純化的細(xì)胞病毒液，用細(xì)胞維持液將病毒液從10-1～10-10進(jìn)行10倍梯度稀釋。取長滿單層LMH的96孔板，棄掉培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗2～3遍，將稀釋好的病毒液加入到96孔板，每個(gè)稀釋度重復(fù)8個(gè)孔，每孔100 μL,同時(shí)設(shè)對(duì)照孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育，連續(xù)觀察5～7 d，記錄CPE孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench方法計(jì)算出病毒的TCID50。

1.7 病毒全基因組測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析取細(xì)胞分離純化的病毒基因組DNA為模板，應(yīng)用設(shè)計(jì)的39對(duì)引物，擴(kuò)增出全基因組序列。用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物膠回收?；厥债a(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，并利用DNAStar軟件對(duì)所得的多個(gè)基因片段進(jìn)行拼接，使用 MEGA7.0 軟件對(duì)全基因組與GenBank上公布的國內(nèi)外參考毒株進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)分析，基因分型所用的參考毒株信息見表3。

表3 參考毒株信息

1.8 雛雞感染試驗(yàn)將21日齡SPF雛雞分為攻毒組和對(duì)照組，每組10只，攻毒組腿部肌肉注射純化的病毒液(0.5 mL/只)，對(duì)照組注射等量生理鹽水。試驗(yàn)雞自由采食和飲水，逐日觀察試驗(yàn)雞的精神狀況，記錄臨床表現(xiàn)。剖檢死亡雛雞，觀察器官病變情況。采取攻毒組病死雞的心臟、肝臟、腎臟制作組織病理切片，經(jīng)甲醛固定24 h后，做常規(guī)石蠟切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(H.E)染色，中性樹膠封片后，觀察病變并拍照。

2 結(jié)果

2.1 病料的PCR檢測(cè)以Hexon基因鑒定引物對(duì)疑似樣品提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果顯示均在945 bp處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期片段大小一致(圖1)。初步判斷肝臟、心臟樣品為FAdV-4陽性。

M.DL2000 DNA Marker；1.肝臟勻漿上清液；2.心臟勻漿上清液；3.陽性對(duì)照；4.陰性對(duì)照

2.2 病毒的LMH純化培養(yǎng)與鑒定經(jīng)LMH盲傳5代后，出現(xiàn)明顯的CPE，表現(xiàn)為接毒24 h后細(xì)胞開始皺縮逐漸變圓、折光性增強(qiáng)、細(xì)胞間距增大、突觸消失、有的多個(gè)細(xì)胞聚集在一起，隨后成簇或成葡萄串狀。48 h后幾乎所有的細(xì)胞變圓腫脹，部分細(xì)胞開始死亡，72 h后大部分細(xì)胞死亡崩解(圖2)。

A.接毒24 h后；B.接毒48 h后；C.接毒72 h后；D.正常LMH細(xì)胞

病毒連續(xù)穩(wěn)定傳代，將第5代細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，擴(kuò)增條帶長約945 bp(圖3)，與預(yù)期片段大小相符。因此確定此次分離株為FAdV-4 QHD2021。

M.DL2000 DNA Marker；1.接種FAdV-4的細(xì)胞培養(yǎng)物；2.陽性對(duì)照；3.陰性對(duì)照

2.3 病毒TCID50測(cè)定結(jié)果將純化的病毒液10倍比稀釋后，接種已長成單層的96孔板LMH細(xì)胞上，根據(jù)Reed-Muench方法計(jì)算病毒滴度為1×105TCID50/mL。

2.4 病毒的全基因測(cè)序分析

2.4.1全基因測(cè)序結(jié)果 對(duì)FAdV-4 QHD2021株進(jìn)行全基因測(cè)序，對(duì)測(cè)序的結(jié)果使用DNAStar軟件進(jìn)行拼接，結(jié)果表明，該株全基因大小為44 225 bp，基因組G+C的含量為54.75%，A+T的含量為45.24%，共編碼14 741個(gè)氨基酸。與FAdV-4國內(nèi)外毒株比對(duì)結(jié)果顯示，F(xiàn)AdV-4 QHD2021株全基因組比經(jīng)典毒株FAdV-4 ON1株短1 445 bp，比高致病性MX-SHP95株短1 421 bp，比非致病性的KR5毒株短1 588 bp，但比國內(nèi)的SD1501株長587 bp，比CH/HNJZ株長494 bp。結(jié)果提示QHD2021株與國外的FAdV-4毒株相比存在基因片段缺失，但比國內(nèi)的毒株長500 bp左右，說明QHD2021株相比于國內(nèi)外毒株存在遺傳進(jìn)化與變異。

2.4.2全基因核苷酸同源性比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析 采用MEGA7.0軟件的Clustal W方法將FAdV-4 QHD2021株與GenBank公布的FAdV-4國外經(jīng)典毒株和國內(nèi)流行毒株進(jìn)行同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AdV-4 QHD2021株的全基因組核苷酸序列與表2所列的19株的核苷酸為47.1%～94.3%，其中與Ⅰ群C種FAdV-4參考株的同源性較高，為88.8%～94.3%，與A、B、D、E型的同源性(52.4%～46.8%)較低。FAdV-4 QHD2021株與國內(nèi)分離株SD1601株和HB1501株的同源性最高，達(dá)94.3%，F(xiàn)AdV-4 QHD2021株與國外高致病性MX-SHP95分離株的同源性高達(dá)89.5%，與非致病性經(jīng)典毒株ON1的同源性為88.6%(圖4)與國外的經(jīng)典毒株略有差異。結(jié)果提示，F(xiàn)AdV-4 QHD2021分離株可能發(fā)生了進(jìn)化和變異，但并未影響其血清型。

圖4 FAdV-4 QHD2021株全基因核苷酸序列同源性分析

將FAdV-4 QHD2021分離株全基因組進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AdV-4 QHD2021株與國內(nèi)外的FAdV-4分離株同屬于FAdV-C分支，與近幾年分離的FAdV-4 SD1601株和HB1501株親緣關(guān)系更近，而與FAdV-A、FAdV-B、FAdV-D、FAdV-E距離較遠(yuǎn)(圖5)。確定FAdV-4 QHD2021分離株屬于Ⅰ群C種FAdV-4。

圖5 FAdV-4 QHD2021株全基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4.3序列比對(duì)分析 核苷酸序列分析顯示，與國外的經(jīng)典毒株(ON1、MX-SHP95、KR5)毒株相比，QHD2021株與我國流行的FAdV-4毒株在35 000～40 000 nt處有1段長1 966 bp的基因片段缺失，這導(dǎo)致基因組中的ORF19、ORF27、ORF48這3個(gè)編碼蛋白的缺失(圖6)。與我國首次分離的高致病株JSJ13的ORF29基因序列相比，國內(nèi)近幾年流行株SD1601、JSJ13、HB1501、HNJZ的ORF29基因序列出現(xiàn)了33個(gè)堿基缺失，墨西哥高致病株MX-SHP95也缺失了相同的堿基，而非致病株ON1的ORF29基因序列的堿基缺失更多，比上述毒株多缺失33個(gè)堿基(圖7)，說明FAdV-4在中國的流行過程中發(fā)生了變異，這很有可能導(dǎo)致了FAdV-4毒力增強(qiáng)。

中國分離株缺失部分

加拿大分離株ON1的缺失部分；.中國分離株、澳大利亞分離株KR5和墨西哥分離株MX-SH95的缺失部分

2.5 雛雞感染試驗(yàn)對(duì)21日齡的SPF雛雞注射病毒滴度為1×105TCID50/mL的FAdV-4 QHD2021株0.5 mL/只，感染的劑量為0.5×105/mL/只，感染后24 h開始出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，雛雞表現(xiàn)精神沉郁、食欲減退、羽毛蓬松、閉目呆立、拉黃綠色稀糞。48 h后雛雞全部發(fā)病，開始出現(xiàn)死亡，雛雞表現(xiàn)出畏寒聚集、食欲廢絕，72 h 后全部死亡。對(duì)病死雞剖檢可見肝臟變黃、質(zhì)地易碎、有明顯的心包積液、腎臟出血、腺胃和肌胃交界處出血、肌胃糜爛(圖8)。對(duì)照組雞精神、食欲無異常表現(xiàn)，無死亡。

圖8 FAdV-4 QHD2021株感染SPF雞的病理變化

對(duì)QHD2021株攻毒后72 h的病死雞的病變器官進(jìn)行病理組織學(xué)觀察(圖9)，結(jié)果顯示肝臟可見局部壞死灶，肝細(xì)胞脂肪變性、壞死，肝細(xì)胞可見嗜堿性核內(nèi)包涵體；腎臟出血，腎小管上皮細(xì)胞壞死；心臟心肌纖維水腫、稀疏、斷裂、細(xì)胞間見單核細(xì)胞浸潤。

圖9 FAdV-4 QHD2021株感染雞不同組織的病理學(xué)變化

3 討論

近年來河北地區(qū)養(yǎng)雞場發(fā)生多起感染FAdV-4病例，死亡率較高，但尚未發(fā)布FAdV-4的全基因組序列，所以FAdV-4高致病性的關(guān)鍵位點(diǎn)不明確[14-15]。為了分析河北地區(qū)FAdV-4毒株的變異性和致病性，本試驗(yàn)從秦皇島某發(fā)病養(yǎng)殖場采集到具有明顯的膠凍樣心包積液和肝出血壞死等典型的病理變化的病死雞肝和心臟進(jìn)行病毒檢測(cè)和分離，成功使用LMH細(xì)胞分離培養(yǎng)了FAdV-4，命名為FAdV-4 QHD2021株。將此毒株進(jìn)行全基因組測(cè)序并和國內(nèi)外毒株進(jìn)行序列比對(duì)，分析該病毒的分子遺傳特征和變異程度。QHD2021株對(duì)SPF雞進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)，雛雞死亡率為100%，證明該毒株是較強(qiáng)致病株。

本研究序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，和國外FAdV-4的經(jīng)典毒株(ON1、KR5、MX-SHP95)相比，QHD2021株與國內(nèi)近幾年流行毒株均在ORF42～ORF43存在一段長為1 966 bp堿基缺失，這與SLAINEI等[16]發(fā)現(xiàn)是一致的，該缺失導(dǎo)致了ORF19、ORF27、ORF48的缺失，有猜測(cè)這一段缺失可能是導(dǎo)致我國近幾年流行毒株毒力增強(qiáng)的原因[17]，但在PAN等[18]進(jìn)一步的研究中否認(rèn)了這一猜測(cè)，其發(fā)現(xiàn)1 966 bp的缺失并不會(huì)影響病毒的復(fù)制，這種缺失是否影響病毒的毒力還需進(jìn)一步研究。近期也有研究發(fā)現(xiàn)ORF19缺失毒株比未發(fā)生缺失的毒株毒力更強(qiáng)，ORF19可能會(huì)影響病毒的毒力，這就解釋了目前中國各省份FAdV-4死亡率較高的現(xiàn)狀[19]。本研究還發(fā)現(xiàn)，與國內(nèi)首次分離株JSJ13相比，QHD2021株與國內(nèi)其他流行株在ORF29處缺失了33個(gè)堿基，經(jīng)典株ON1缺失了66個(gè)堿基。在中國近幾年FAdV-4流行株大多數(shù)為高致病性毒株，而ON1株為非致病株，因此推測(cè)該缺失部分可能會(huì)導(dǎo)致FAdV-4的高致病性。但是該部分的生物學(xué)功能尚不明確，這一基因缺失對(duì)FAdV-4毒株復(fù)制和致病力的具體影響還有待進(jìn)一步研究。據(jù)此可知，國內(nèi)報(bào)道的FAdV-4毒株存在不同程度的變異，這種變異也導(dǎo)致了不同的致病性。同源性分析發(fā)現(xiàn)QHD2021株與SD1501、HB150株有較高的同源性，但又存在一些差異，說明我國的FAdV-4在不斷的進(jìn)化過程中。因此對(duì)該病毒的分子流行病學(xué)的研究急需開展。深入分析的這些基因變異對(duì)FAdV-4毒力增強(qiáng)的影響，是研發(fā)FAdV疫苗的關(guān)鍵[20]。本試驗(yàn)進(jìn)一步闡明了河北地區(qū)FAdV-4的流行情況，為今后掌握FAdV-4致病機(jī)理的研究奠定理論基礎(chǔ)。