槲皮素緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)介導(dǎo)的水牛顆粒細(xì)胞凋亡

楊濰菡，劉潤(rùn)峰，張俊俊，黃星晨，張鵬飛，黃良鳳，張 明

(廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530004)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)做為細(xì)胞內(nèi)最大的Ca2+儲(chǔ)存場(chǎng)所，同時(shí)也是蛋白質(zhì)合成、加工的場(chǎng)所。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，對(duì)機(jī)體維持正常的生理活動(dòng)至關(guān)重要[1]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)，便會(huì)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)，使蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，此時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)開啟未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protien response,UPR)，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重回穩(wěn)態(tài)[2]。而持續(xù)的ERS便會(huì)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上存在的3種UPR受體蛋白PERK、ATF6、IRE1[3]，分別通過 PERK激活下游CHOP基因，CHOP基因促進(jìn)BAX(促凋亡基因)的表達(dá)，抑制BCL-2(抗凋亡基因)的表達(dá)，介導(dǎo)凋亡的發(fā)生[4]。IRE1激活JNK基因，以及激活Caspase家族級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使凋亡的發(fā)生[5]。

ERS在疾病的發(fā)生發(fā)展中起著很重要的作用，近年研究發(fā)現(xiàn)ERS是誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡的關(guān)鍵途徑之一。小鼠試驗(yàn)表明ERS在促使小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[6]。而顆粒細(xì)胞的凋亡是卵泡閉鎖的主要誘因，在生產(chǎn)上極大地制約著優(yōu)良品種的利用，造成優(yōu)良母畜資源的浪費(fèi)。因此，抑制顆粒細(xì)胞凋亡，對(duì)延長(zhǎng)雌性動(dòng)物的使用年限至關(guān)重要。

槲皮素(quercetin,QC)，又被稱為槲黃酮，是植物源性的黃酮類化合物，易溶于甲醇、冰醋酸等有機(jī)溶劑，不溶于水[7]。廣泛存在于蔬果中，具有抗菌、抗病毒、降血糖、抗氧化等作用[8]。奶牛乳腺上皮細(xì)胞的探究試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，QC可提升細(xì)胞的抗氧化能力，同時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖也有著促進(jìn)作用[9]；還有研究顯示，QC能修復(fù)因鎘損傷雞的顆粒細(xì)胞功能，保護(hù)蛋雞的生產(chǎn)性能[10]；此外，QC還能降低山羊精子和植入前胚胎中鎘離子的含量，提高山羊精子體外保存品質(zhì)，促進(jìn)植入前胚胎的發(fā)育[11]；QC在牛的精液中可作為活性氧基團(tuán)(ROS)清除劑和金屬螯合劑，防止牛精液質(zhì)量發(fā)生變化，保持精液正常的生殖功能[12]；QC還能緩解仔豬在運(yùn)輸過程中應(yīng)激而造成得腸道損傷，保證其正常的生長(zhǎng)性能[13]。上述研究均表明，QC在養(yǎng)殖業(yè)中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

本試驗(yàn)以水牛的顆粒細(xì)胞做為研究對(duì)象，分析QC對(duì)水牛顆粒細(xì)胞的保護(hù)作用。通過衣霉素(tunicamycin，TM)構(gòu)建ERS模型，探究QC對(duì)模型條件下水牛顆粒細(xì)胞凋亡的影響，為延長(zhǎng)母畜使用年限提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣本水牛卵巢取自南寧市肉聯(lián)廠屠宰分廠。

1.2 主要試劑CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、Annexin-V/FITC細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；qPCR酶,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa;TM購(gòu)自索萊寶科技有限公司(北京)；QC購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司；水牛多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋有限公司。

1.3 溶液的配制取1 g TM，將其溶于1 L DMSO中，配制成40 g/L的母液，用完全培養(yǎng)基將其稀釋至所需濃度；取1 g QC，將其溶于1 L DMSO中，配制成50 g/L的母液，再用完全培養(yǎng)基將其稀釋至所需濃度。

1.4 卵巢顆粒細(xì)胞的收集取預(yù)熱的生理鹽水清洗水牛卵巢，而后用一次性注射器抽吸水牛卵巢上的卵泡，將抽取到的卵泡液1 500 r/min，離心5 min，收集水牛顆粒細(xì)胞沉淀，D-PBS清洗細(xì)胞沉淀，過40 μm細(xì)胞篩，反復(fù)2次，用完全培養(yǎng)液將顆粒細(xì)胞沉淀吹打混勻，進(jìn)行鋪板。6 h后更換完全培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞貼壁情況。

1.5 細(xì)胞免疫熒光在培養(yǎng)板中將已爬好顆粒細(xì)胞的玻片用D-PBS浸洗，用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，0.5%Triton X-100室溫通透20 min D-PBS浸洗，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；吸取封閉液，玻片上滴加足夠量的FSHR一抗放入濕盒，4℃孵育過夜；D-PBS清洗，避光添加熒光二抗，濕盒中室溫孵育1 h，D-PBS清洗后滴加DAPI避光孵育5 min，熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.6 提高細(xì)胞活力取96孔板，每孔加入100 μL，2 000個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁完全后，添加QC到培養(yǎng)基中，使其終質(zhì)量濃度為1.0，1.5，2.0，2.5，5.0，10.0，20.0 mg/L，37℃培養(yǎng)24,48，72 h。使用CCK-8試劑，按照說明書，進(jìn)行操作，37℃孵育1 h，測(cè)定D450值，檢測(cè)細(xì)胞活力情況，篩選出QC的最佳濃度。細(xì)胞活力(%)=(加藥組-空白對(duì)照組)/(未加藥組-空白對(duì)照組)×100%。

1.7 構(gòu)建體外ERS模型使用TM構(gòu)建ERS模型，將TM加入到培養(yǎng)基中，使其終質(zhì)量濃度為1.0，1.5，2.0，2.5，5.0，10.0 mg/L，37℃培養(yǎng)48 h。使用Annexin-V/FITC凋亡試劑盒，通過流式細(xì)胞技術(shù)分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，篩選出體外ERS模型的最佳濃度。

1.8 QC緩解ERS將篩選出的最佳QC濃度預(yù)處理水牛顆粒細(xì)胞8 h，而后添加TM構(gòu)建ERS模型，37℃培養(yǎng)40 h，觀察細(xì)胞情況。取1×106個(gè)處理后的細(xì)胞，制備成水牛顆粒細(xì)胞懸液，使用Annexin-V/FITC凋亡試劑盒，按照說明書進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

表1 引物序列

1.10 Western blot檢測(cè)收集處理后的水牛顆粒細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。以內(nèi)參蛋白Actin做為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜封閉，4℃孵育一抗過夜，TBST清洗3次，室溫孵育二抗1 h，避光顯色，圖像分析。

2 結(jié)果

2.1 水牛原代顆粒細(xì)胞的收集與鑒定在體視顯微鏡下觀察水牛顆粒細(xì)胞，細(xì)胞體積較大，輪廓清楚，細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)紡錘形(圖1A)；使用顆粒細(xì)胞上的特異性受體蛋白FSHR進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR受體均表達(dá)在所培養(yǎng)的原代細(xì)胞的胞核及膜上(圖1B)，證實(shí)本試驗(yàn)所提取、培養(yǎng)的細(xì)胞確系水牛顆粒細(xì)胞。

A.體視顯微鏡下觀察水牛顆粒細(xì)胞的形態(tài);B.熒光顯微鏡觀察結(jié)果(綠光為顆粒細(xì)胞特異性受體蛋白FSHR;藍(lán)光為DPAI)

2.2 QC對(duì)細(xì)胞活力的影響QC能提高水牛顆粒細(xì)胞的活力，在不同的處理時(shí)間中，QC處理細(xì)胞48 h，細(xì)胞活力最好；當(dāng)QC質(zhì)量濃度為1.0～2.5 mg/L 時(shí)，細(xì)胞活力有明顯的提高，其中QC質(zhì)量濃度為1.5，2.0 mg/L時(shí)(P<0.01)，細(xì)胞活力提高最為顯著；而當(dāng)QC質(zhì)量濃度為5～20 mg/L時(shí)，細(xì)胞活力降低。表明，低質(zhì)量濃度的QC能提高細(xì)胞活力，高質(zhì)量濃度的QC降低細(xì)胞活力(圖2)。

*P<0.05；**P<0.01。下同

2.3 體外ERS模型的構(gòu)建TM是常用的ERS誘導(dǎo)劑，不同質(zhì)量濃度的TM處理水牛顆粒細(xì)胞，使用Annexin-V/FITC檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況(圖3A，B)。隨著TM質(zhì)量濃度的升高，凋亡細(xì)胞的數(shù)量上升。當(dāng)TM質(zhì)量濃度為2.5 mg/L時(shí)，凋亡細(xì)胞的數(shù)量與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。因此，選用TM質(zhì)量濃度為2.5 mg/L構(gòu)建體外ERS模型。TM處理后，檢測(cè)細(xì)胞中ERS相關(guān)基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)TM能促使ERS基因升高。表明TM能誘導(dǎo)ERS的發(fā)生。

A.不同質(zhì)量濃度TM處理48 h,流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;B.不同質(zhì)量濃度TM處理24 h細(xì)胞凋亡情況統(tǒng)計(jì)圖;C.TM處理后，ERS基因的表達(dá)情況

2.4 QC緩解ERSQC預(yù)處理之后水牛顆粒細(xì)胞凋亡情況如圖4A,B所示。1.5，2.0 mg/L的QC預(yù)處理8 h之后，細(xì)胞凋亡情況與TM組相比顯著降低，但未能完全恢復(fù)至正常水平。表明QC能緩解ERS而造成的細(xì)胞凋亡。

2.5 qPCR檢測(cè)ERS和凋亡基因的表達(dá)qPCR檢測(cè)ERS和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(圖5)。結(jié)果顯示，添加QC能降低ERS相關(guān)基因的表達(dá)(圖5A)，其中PERK-ATF4-CHOP信號(hào)通路中的PERK、ATF4、CHOP基因的表達(dá)均極顯著降低(P<0.01)，IRE-1A、ATF6基因的表達(dá)也降低(P<0.05)。隨后對(duì)凋亡相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)(圖5B)，結(jié)果表明，添加QC能顯著降低凋亡基因的表達(dá)。因此證明，QC能緩解因ERS而引起的細(xì)胞凋亡。

A.QC預(yù)處理后ERS相關(guān)基因的表達(dá)情況;B.QC預(yù)處理后細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況

2.6 Western blot檢測(cè)ERS和凋亡蛋白的表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果證明(圖6A，B)，TM能使Bax、Caspase 9等蛋白的表達(dá)水平升高，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平降低，QC能促使BCL-2的表達(dá)升高，BAX、Caspase 9的表達(dá)降低。此外，對(duì)ERS中ATF4、Chop蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)QC能緩解TM造成的蛋白表達(dá)水平升高。表明，添加QC能緩解因ERS而造成的細(xì)胞凋亡。

A.QC預(yù)處理后，ERS和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況；B.蛋白表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)圖

3 討論

ERS在疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，如阿爾茨海默綜合征、高血壓等。此外，ERS還發(fā)生在卵巢組織的細(xì)胞中，參與卵子的成熟、卵泡的形成。顆粒細(xì)胞的凋亡是卵泡閉鎖的主要誘因[14]，卵泡閉鎖又將導(dǎo)致卵巢早衰，而ERS在其中起著關(guān)鍵作用。

QC是一種植物源性的黃酮類化合物，具有抗氧，抗炎等多種生物活性。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的QC能促進(jìn)細(xì)胞的增殖，提高細(xì)胞的活力，這與QC在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用是相一致的[9]，為了探究QC能否緩解ERS引起的細(xì)胞凋亡，本試驗(yàn)在體外構(gòu)建ERS模型，通過QC預(yù)處理發(fā)現(xiàn)，QC能緩解ERS誘導(dǎo)劑引發(fā)的細(xì)胞凋亡，這與QC通過ERS通路，作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，使細(xì)胞的凋亡率降低，同時(shí)提高細(xì)胞活力的研究是相一致的[15]。GUO等[16]研究中發(fā)現(xiàn)，QC能通過ERS，緩解二甲基精氨酸誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，因此推斷，QC可能通過ERS緩解水牛顆粒細(xì)胞凋亡，但具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

ERS信號(hào)通路參與細(xì)胞凋亡主要通過調(diào)控Bax家族、caspase家族和Juk基因，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)QC預(yù)處理后，促凋亡基因Bax、Caspase3、Caspase 9的表達(dá)顯著降低，抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)顯著升高，蛋白表達(dá)情況與mRNA的表達(dá)相一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)QC預(yù)處理后，ERS中PERK-ATF4-CHOP信號(hào)通路的表達(dá)與未用QC預(yù)處理組相比差異極顯著，這與HU等[17]研究1，25-二羥基維生素D3通過抑制PERK-ATF4-CHOP信號(hào)通路緩解胰腺細(xì)胞凋亡一致。因此，判斷QC緩解ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能主要通過PERK-ATF4-CHOP信號(hào)通路，但其具體的功能機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。由上述可知，QC能緩解ERS引起的水牛顆粒細(xì)胞凋亡，對(duì)QC在生產(chǎn)上的使用提供理論依據(jù)。