牛源嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的分離鑒定、毒力、耐藥基因及生物學(xué)特性分析

任雨龍，李暢洋，孫 愉，張 昊，魏 笑，高炳南，王秋菊

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia,SMA)，屬于黃單胞菌科，寡養(yǎng)單胞菌屬，是一種嚴(yán)格需氧，能夠感染人和動(dòng)物的致病菌。該菌通常能夠引起奶牛的呼吸道感染、敗血癥、心內(nèi)膜炎和菌血癥等[1]。臨床表現(xiàn)為采食量、產(chǎn)奶量下降，高熱，呼吸急促同時(shí)伴有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，嚴(yán)重的會(huì)引發(fā)多器官衰竭，甚至死亡[2-3]。

隨著抗生素在畜牧養(yǎng)殖中的廣泛應(yīng)用，SMA的耐藥性給感染后的治療帶來(lái)了極大的困難。由于該菌在動(dòng)物臨床上的致病性不如其他病原體，故對(duì)其生物學(xué)特性、存在的毒力和耐藥基因，以及耐藥表型的研究報(bào)道少見(jiàn)[4]。目前，關(guān)于豬源、人源和魚(yú)源SMA的研究均有報(bào)道，但關(guān)于牛源SMA的試驗(yàn)研究較少[5-7]，且并未對(duì)該菌的毒力、耐藥等特性進(jìn)行系統(tǒng)分析，臨床上參照豬源或人源等分離菌株的生長(zhǎng)特性以及耐藥特性等信息，對(duì)奶牛SMA感染進(jìn)行防治，不具有充分的指導(dǎo)意義。

因此，為進(jìn)一步了解牛源SMA的生化特性、毒力和耐藥特征，本試驗(yàn)通過(guò)從荷斯坦奶牛瘤胃內(nèi)分離出目標(biāo)菌株，并對(duì)其生長(zhǎng)特性和耐藥表型等信息進(jìn)行分析，旨在豐富牛源SMA的生物學(xué)信息特征，為科學(xué)防治SMA的感染以及合理用藥提供幫助，以期減少SMA感染所帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失，增加奶牛養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)效益。

1 材料與方法

1.1 樣品采集在黑龍江省大慶市某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)選取12頭荷斯坦奶牛，其中高產(chǎn)奶牛6頭，健康狀況良好，采食量正常。低產(chǎn)奶牛6頭，呼吸急促，采食量相對(duì)較少。一共采集12份瘤胃內(nèi)容物，置于37℃泡沫保溫箱中保存，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，采樣奶牛信息如表1所示。

表1 采樣奶牛信息

1.2 主要試劑與儀器血瓊脂基礎(chǔ)2號(hào)(HB6230)、MH肉湯(NB6231)、MH瓊脂(HB6232)、LB肉湯(HB0128)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(HB0177-1)購(gòu)自青島海博公司；Taq Master Mix、DL2000 DNA Marker、瓊脂糖購(gòu)自TaKaRa公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；氨芐西林、紅霉素、克拉霉素等14種藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；質(zhì)控菌株嗜酸乳桿菌ATCC4356購(gòu)自廣東微生物菌種保藏中心。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)將瘤胃內(nèi)容物使用無(wú)菌醫(yī)用紗布過(guò)濾掉飼料殘?jiān)?，為了后期方便挑取菌落，用生理鹽水稀釋至不同的濃度(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8)，取10-6，10-7，10-83個(gè)濃度在血平板上均勻涂布，置于37℃常規(guī)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組3個(gè)重復(fù)。每隔12 h進(jìn)行挑菌操作，將菌落用劃線法接到新培養(yǎng)基平皿中，重復(fù)此步驟4～5次，直至平皿中菌落完全相同，沒(méi)有雜菌。

1.4 DNA提取及測(cè)序取分離純化后的菌液，利用DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，添加細(xì)菌通用引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中上游引物序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物序列：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物目的基因大小為1 500 bp左右，引物由上海生物工程公司完成[8]。

25 μL反應(yīng)體系：Premix Taq 12.5 μL、上下游引物各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 5.5 μL。反應(yīng)程序：95℃ 3 min;95℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 延伸30 s，30個(gè)循環(huán);最后72℃ 延伸5 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將符合預(yù)期基因大小的樣品送至上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序，再將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已經(jīng)登錄的菌株進(jìn)行同源性比對(duì)分析，使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 生化特性試驗(yàn)將所有分離的純化菌株接種到硝酸鹽還原、甲基紅、靛基質(zhì)、硫化氫、尿素酶等生化特性培養(yǎng)基中，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基的配制以及鑒定方法主要參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第九版和《微生物學(xué)及檢驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》。

1.6 溫度特性結(jié)合序列比對(duì)與生化特性試驗(yàn)結(jié)果，從分離的17株菌中挑出4株SMA進(jìn)行生化特性分析。從各菌株培養(yǎng)液中抽取20 μL菌液于980 μL LB液體培養(yǎng)基中，以LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，置于搖床內(nèi)150 r/min，分別在32，34，36，37，38，40℃下培養(yǎng)24 h，每個(gè)溫度做3個(gè)重復(fù)，利用酶標(biāo)儀測(cè)定D600值，以溫度(℃)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制溫度曲線。

1.7 耐酸堿特性同1.3接菌方法，在pH值分別為3，4，5，6，7，8，9的LB培養(yǎng)基中接菌，每個(gè)酸堿度做3個(gè)重復(fù)，置于搖床內(nèi)150 r/min，培養(yǎng)24 h，測(cè)定D600值。以pH值為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制耐酸耐堿特性曲線。

1.8 耐膽鹽特性將接種菌液的無(wú)膽鹽LB培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，膽鹽濃度分別為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%為試驗(yàn)組，每個(gè)膽鹽濃度3個(gè)重復(fù)，置于搖床內(nèi)150 r/min，37℃，培養(yǎng)24 h后，測(cè)定D600值，并以膽鹽濃度作為橫坐標(biāo)，培養(yǎng)液吸光度值為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.9 藥敏試驗(yàn)本試驗(yàn)以嗜酸乳桿菌ATCC4356為質(zhì)控菌株，將各菌株接種到MH肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后，抽取100 μL菌液置于MH瓊脂培養(yǎng)基上，均勻涂布。將各類(lèi)藥敏紙片緊密貼于平皿中，倒置培養(yǎng)24 h后，記錄抑菌圈直徑。藥敏結(jié)果參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)NCCLS(2013)公布的標(biāo)準(zhǔn)，做出耐藥(R)、中介(I)、敏感(S)的判定[9-10]。

1.10 毒力基因測(cè)定選擇與奶牛常見(jiàn)疾病關(guān)系較為密切的毒力基因mrkD、fimH和wabG為檢測(cè)基因，以添加特異性引物的菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物為樣品，檢測(cè)菌株中存在毒力基因的種類(lèi)[11](表2)。

表2 毒力基因引物信息

1.11 耐藥基因的檢測(cè)參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]，并根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，從GenBank中檢索到有關(guān)耐藥基因的序列，獲得鏈霉素類(lèi)、碳青霉烯類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)等耐藥基因序列信息，利用DNAStar Lasergene 11.0 查找出各基因序列中的保守序列，在NCBI上設(shè)計(jì)引物，得到6類(lèi)7種耐藥基因的引物序列(表3)。

表3 耐藥基因引物信息

1.12 菌株致病性檢測(cè)選取健康BALB/c小鼠35只，SPF級(jí)，4周齡，體質(zhì)量21～24 g，分為5組，每組7只。對(duì)照組小鼠灌喂LB液體培養(yǎng)基，剩余4組分別灌喂?jié)舛葹?×1011CFU/mL的SMA PMIK-2-a、PMIK-2-b、PMIK-2-c、PMIK-2-d菌液，灌喂量為300 μL/只，持續(xù)灌喂7 d，自由飲水，觀察小鼠健康狀況[13]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)如圖1所示，分離菌株在TSA瓊脂培養(yǎng)基上呈灰白色，略凸起，圓形的點(diǎn)狀菌落。鏡檢觀察，菌體為直或者略彎曲的桿狀形態(tài)，為革蘭陰性桿菌。

圖1 分離株在TSA瓊脂培養(yǎng)基上的形態(tài)(A)及革蘭染色結(jié)果(B)

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)提取菌株DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)目的基因片段大小為1 500 bp左右，與預(yù)測(cè)基因片段大小相符(圖2)。

M.DL2000 DNA Marker;1～5.16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 基因序列比對(duì)將測(cè)序結(jié)果在NCBI的GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)所有分離菌株的同源性均在99%以上，初步確定分離菌株為SMA PMIK-2。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)利用MEGA7.0軟件將測(cè)序結(jié)果建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)一步證明試驗(yàn)所篩選出來(lái)的菌與GenBank比對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性，同源性達(dá)到100%(圖3)。

K7為目標(biāo)菌株序列；發(fā)育樹(shù)節(jié)點(diǎn)的數(shù)值代表Bookstrap值；編號(hào)數(shù)值為GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的登錄號(hào)

2.5 生化特性鑒定本研究主要對(duì)所分離的17株菌進(jìn)行革蘭染色、硝酸還原、靛基質(zhì)(吲哚)、產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、尿素酶、接觸酶以及發(fā)酵葡萄糖、產(chǎn)硫化氫等特性鑒定(表4)。參照伯吉氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)第9版，檢測(cè)結(jié)果基本符合SMA的生化特性。

表4 分離菌株生化特性鑒定

2.6 溫度特性在不同溫度條件下，4株SMA PMIK-2的生長(zhǎng)狀況相似，均在培養(yǎng)溫度為38℃時(shí)，吸光度值達(dá)到最高，即菌群數(shù)量達(dá)到最大。而隨著溫度繼續(xù)升高，菌群數(shù)量開(kāi)始迅速下降，即38℃為PMIK-2的最佳生長(zhǎng)溫度(圖4)。

圖4 SMA PMIK-2溫度曲線

2.7 耐酸堿特性不同的培養(yǎng)基酸堿度對(duì)SMA PMIK-2的生長(zhǎng)影響是不同的。當(dāng)培養(yǎng)基pH在3.0～7.0之間時(shí)，PMIK-2的生長(zhǎng)數(shù)量處于穩(wěn)定上升的狀態(tài)。當(dāng)pH=7.0時(shí)，SMA PMIK-2菌群數(shù)量達(dá)到峰值，若培養(yǎng)基pH值繼續(xù)增加，菌群數(shù)量開(kāi)始快速降低，說(shuō)明PMIK-2的最佳生長(zhǎng)pH值為7.0(圖5)。

圖5 SMA PMIK-2耐酸堿特性曲線

2.8 耐膽鹽特性隨著膽鹽濃度的增加，SMA PMIK-2的數(shù)量開(kāi)始下降，當(dāng)膽鹽濃度在0.5%～1.5%時(shí)，菌群數(shù)量下降較為迅速，繼續(xù)增加膽鹽濃度，菌群數(shù)量繼續(xù)下降。但當(dāng)膽鹽濃度達(dá)到2%時(shí)，菌群數(shù)量依然大于對(duì)照組的50%，說(shuō)明SMA PMIK-2具有較強(qiáng)的膽鹽耐受能力(圖6)。

圖6 SMA PMIK-2耐膽鹽曲線

2.9 藥敏試驗(yàn)SMA PMIK-2在所使用的14種抗菌藥物中，對(duì)卡那霉素、頭孢氨芐、頭孢唑啉、克拉霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星高度敏感，對(duì)多西環(huán)素中度敏感，對(duì)鏈霉素、氨芐西林、四環(huán)素、亞胺培南、慶大霉素等藥物不敏感(表5)。

表5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.10 毒力基因檢測(cè)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)SMA PMIK-2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)fimH、mrkD和wabG3種毒力基因在PMIK-2菌株均被檢出(圖7)。

M.DL2000 DNA Marker;1.mrkD基因;2.fimH基因;3.wabG基因

2.11 耐藥基因檢測(cè)同2.9檢測(cè)方法，檢測(cè)SMA PMIK-2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在PMIK-2的基因中檢測(cè)到鏈霉素、碳青霉烯類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)耐藥基因，與藥敏試驗(yàn)結(jié)果相符(圖8)。

M.DL2000 Marker;1.AadA1基因;2.BlaSHV-1基因;3.ErmF基因;4.TetD基因;5.TetA基因;6.Sul 1基因;7:GyrA基因

2.12 菌株致病性檢測(cè)隨著灌喂天數(shù)以及菌液濃度的增加，小鼠死亡率出現(xiàn)不同程度的上升，灌喂1.0×107,1.0×109,1.0×1011CFU/mL組濃度的死亡率分別為28.6%～42.9%，42.9%～57.1%，71.4%～85.7%。剖檢死亡小鼠發(fā)現(xiàn)胸腔，肝臟、胃腸道均存在不同程度的出血現(xiàn)象。除LB組外，各組剩余存活小鼠體質(zhì)量、采食量和飲水量均較灌喂前下降，且精神萎靡，運(yùn)動(dòng)能力大幅度下降，出現(xiàn)畏寒扎堆的現(xiàn)象(表6)。

表6 SMA PMIK-2致病性檢測(cè)

3 討論

本研究從荷斯坦奶牛的瘤胃內(nèi)分離到17株SMA PMIK-2，其中高產(chǎn)奶牛組4株，低產(chǎn)奶牛組13株。從中挑選出4株同源性存在差異的PMIK-2，對(duì)其生物學(xué)特性、耐藥性、耐藥基因和毒力基因等進(jìn)行檢測(cè)分析。

參照伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)第9版，分離菌株P(guān)MIK-2的生化特性鑒定結(jié)果與菌種屬基本一致。在本試驗(yàn)中甲基紅特性檢測(cè)結(jié)果為陰性，與其他報(bào)道結(jié)果不一致，說(shuō)明PMIK-2的生長(zhǎng)繁殖不能以葡萄糖為營(yíng)養(yǎng)原料，這可能是由于菌株來(lái)源不同導(dǎo)致的[14-15]。

目前諸多對(duì)SMA的研究中，少見(jiàn)對(duì)其溫度、耐酸堿以及耐膽鹽特性的報(bào)道。而在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PMIK-2的最適生長(zhǎng)溫度為38℃，最佳生長(zhǎng)pH為7.0，具有較強(qiáng)的耐膽鹽能力。當(dāng)膽鹽濃度增加到2.0%時(shí)，菌群生長(zhǎng)數(shù)量在對(duì)照組的50%以上，說(shuō)明SMA PMIK-2具有較強(qiáng)的耐受能力，能夠通過(guò)奶牛瘤胃并在腸道中存活。

有研究發(fā)現(xiàn)豬源和人源SMA的耐藥檢出種類(lèi)具有相似性，對(duì)慶大霉素、氧氟沙星、四環(huán)素和氨芐西林均呈現(xiàn)高度耐藥性[16]。這可能是因?yàn)?種來(lái)源的SMA均為革蘭陰性菌，且在一些相同種類(lèi)的抗生素藥物的長(zhǎng)期作用下，形成了較為相似的耐藥譜型[17]。豬源SMA呈現(xiàn)多種藥物耐藥性是由于養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)廣泛使用一些磺胺類(lèi)等藥物作為飼料添加劑導(dǎo)致的，而人源SMA的多種耐藥性可能是人醫(yī)臨床上對(duì)該菌感染的治療，長(zhǎng)期使用多種抗生素藥物引起的[18]。人源和豬源SMA的耐藥表型與本試驗(yàn)結(jié)果略有差異。本試驗(yàn)中SMA PMIK-2僅對(duì)鏈霉素、氨芐西林、四環(huán)素、亞胺培南、慶大霉素等藥物存在高度耐藥性，而對(duì)卡那霉素、頭孢氨芐、頭孢唑啉、克拉霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星等抗生素藥物高度敏感，這可能是由于奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)長(zhǎng)期使用的藥物與其他地點(diǎn)不同造成的。

在PMIK-2中檢出的AadA1、BlaSHV-1和TetD3種耐藥基因與藥敏試驗(yàn)結(jié)果相符。還有研究在SMA的基因中檢測(cè)到了fim、mrkD毒力基因以及BlaSHV-1和TetD耐藥基因，這與本試驗(yàn)結(jié)果相同[19]。此外，在PMIK-2的基因中還檢出了wabG毒力基因，結(jié)合小鼠灌喂試驗(yàn)結(jié)果，表明SMA PMIK-2對(duì)BALB/c小鼠有較強(qiáng)的致病性。因此，在本試驗(yàn)中，分離PMIK-2菌株數(shù)量的差異有可能是2組奶牛生產(chǎn)狀況不同的原因之一。

在臨床治療中，通常針對(duì)菌株所具有的毒力，以及攜帶的耐藥基因來(lái)決定使用藥物的種類(lèi)[20]。因此，在治療SMA PMIK-2引起的疾病時(shí)，使用鏈霉素、碳青霉烯類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)藥物的治療效果可能不是十分理想。

此外，還有研究發(fā)現(xiàn)在SMA的耐藥性與耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果之間存在差異，可能是除基因耐藥以外的其他耐藥機(jī)制引起，比如細(xì)菌細(xì)胞壁通透性的改變、細(xì)菌表達(dá)外排泵造成藥物的外排等原因[21]。在PCR試驗(yàn)中，模板、試劑和焦磷酸鹽分子的聚集等因素也會(huì)導(dǎo)致在定量方面結(jié)果不夠準(zhǔn)確，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，從而出現(xiàn)耐藥基因與耐藥表型不一致的情況[16]。

綜上所述，SMA PMIK-2的最適生長(zhǎng)為38℃，最佳生長(zhǎng)pH為7.0，具有較強(qiáng)的耐膽鹽能力。其基因中攜帶毒力基因fimH、mrkD和wabG，以及耐藥基因AadA1、BlaSHV-1和TetD。PMIK-2對(duì)鏈霉素、氨芐西林、四環(huán)素、亞胺培南、慶大霉素等藥物高度耐受，且具有較強(qiáng)的致病性。在奶牛的養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)當(dāng)注意SMA PMIK-2的預(yù)防以及治療，在臨床治療時(shí)應(yīng)該避免使用具有耐受性的藥物，同時(shí)還要注意多種藥物合理搭配使用，這樣才能避免更多耐藥菌株的產(chǎn)生，從而減少SMA感染所帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。