致貉流產(chǎn)死胎腸外致病性大腸桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性

張召興，賈青輝，張艷英，高桂生 史秋梅*

(1.河北旅游職業(yè)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)系，河北 承德 067000；2.河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066604)

近幾年，河北地區(qū)毛皮動(dòng)物(貉、狐、貂)養(yǎng)殖數(shù)量增加，在養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)死胎、流產(chǎn)成為臨床中常見的疾病，給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)相關(guān)研究表明犬瘟熱病毒、阿留申病毒、偽狂犬病病毒、加德納氏菌、布氏桿菌、大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌等多種病原均可以引起貉、狐、貂死胎、流產(chǎn)[1-2]。大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)是臨床中重要人畜共患的病原菌之一，該菌根據(jù)發(fā)病的臨床癥狀及遺傳學(xué)可以分為3個(gè)菌群類型，其中，腸外致病性大腸桿(extraintestinal pathogenicEscherichiacoli，ExPEC)是可以引起腸道以外組織感染的一類E.coli，主要引起人和動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)及泌尿生殖系統(tǒng)感染等，嚴(yán)重者可以導(dǎo)致其急性死亡。該菌抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有多種致病性血清型且無交出保護(hù)性，也無有效疫苗保護(hù)，因此導(dǎo)致E.coli病在不同的地區(qū)廣泛發(fā)生與流行，對人和動(dòng)物危害性很大[3-6]。該菌基因組中編碼許多毒力基因，毒力基因的在對宿主致病過程中起著重要的作用，其中毒力ExPEC至少有2種以上基因[7]。細(xì)菌生物被膜(bacterial biofilm,BBF)是組成結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落的主要物質(zhì)，且在自然界中能形成BF。許多研究表明細(xì)菌的BF形成能力與其毒力及耐藥性具有一定相關(guān)性[8]。臨床中主要用抗生素進(jìn)行治療，抗生素的濫用，致使耐藥性嚴(yán)重，且出現(xiàn)多重耐藥菌株，加大了該病的治療難度，同時(shí)耐藥性和藥物殘留威脅著人類健康[9]。

本試驗(yàn)2017—2020年采集河北地區(qū)養(yǎng)殖場中流產(chǎn)貉陰道分泌物、死胎等病料組織243份進(jìn)行ExPEC分離并對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為該地區(qū)致貉流產(chǎn)、死胎綜合防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源2018—2020年河北地區(qū)養(yǎng)殖場中，妊娠25～40日齡的貉，出現(xiàn)死胎、流產(chǎn)情況，采集貉陰道分泌物、死胎等病料組織243份進(jìn)行病原檢測。

1.2 主要試驗(yàn)材料麥康凱培養(yǎng)基、96孔細(xì)菌培養(yǎng)板、顯色培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯，購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制備科技公司；藥物紙片購自杭州天和微生物制劑有限公司；細(xì)菌生化試紙條，購自上海研晶生物科技有限公司；DL2000 DNA Marker購自中科瑞泰生物科技有限公司；2×Taq Marker Mix購自寶生物工程(大連)有限公司；病毒基因組DNA、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒均購自O(shè)mega Bio-Tek公司；O抗原鑒定因子購自中國食品藥品監(jiān)察所;35～40 g健康妊娠14日齡的昆明系小鼠610只購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)。

1.3 病毒性病原檢測參考文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道阿留申病毒、偽狂犬病病毒、犬瘟熱病毒鑒定引物，按照說明提取病料中DNA和 RNA，進(jìn)行 PCR檢測。

1.4 細(xì)菌的分離鑒定對采集流產(chǎn)貉陰道分泌物、死胎等病料組織樣品處理后，無菌條件下接種于麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行鑒別培養(yǎng)。37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，挑取單個(gè)菌落接種于顯色培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)12～18 h，挑顯色培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落接種于營養(yǎng)肉湯純化培養(yǎng)后進(jìn)行鏡檢和生化試驗(yàn)。

1.5 細(xì)菌的PCR檢測根據(jù)細(xì)菌16S rRNA 基因序列，設(shè)計(jì)細(xì)菌通用的16S rRNA鑒定引物，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1429R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，目的片段約為 1 500 bp。按照提取試劑盒說明書提取分離菌基因組DNA,用 16S rRNA 基因序列對分離菌株進(jìn)行PCR鑒定。

1.6 致病性試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道的方法，將分離菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，每1株分離菌株陰道注射妊娠期昆明系小鼠5只，0.25 mL/只(108CFU/mL)，對照組給予等量的無菌生理鹽水，攻毒12 h后，試驗(yàn)期為7 d，試驗(yàn)期間觀察其發(fā)病情況，對發(fā)病的小鼠進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.7 細(xì)菌血清型檢測參考文獻(xiàn)[13]，采用玻板凝集試驗(yàn)對分離菌株進(jìn)行血清型檢測。

1.8 細(xì)菌毒力基因的檢測參照文獻(xiàn)[14-15]的報(bào)道ExPEC 的特異性毒力基因(papA/papC、sfa/foc、afa/dra、iutA、kpsMTⅡ)和其他毒力基因(fyuA、irp1、fimH、hlyA、yjaA、ibeA、iss、iroN、ompTchuA、fimC、gafD、tsh、nfaE)引物序列，對分離菌株進(jìn)行 PCR 檢測。

1.9 細(xì)菌的BF 檢測參考文獻(xiàn)[3]所報(bào)道的方法，對分離菌株進(jìn)行 BF形成能力測定，判定標(biāo)準(zhǔn)以陰性對照孔D值的2倍作為判斷能否形成 BF 的臨界點(diǎn) ODc，當(dāng)D≤ODc 時(shí)，表示BF形成 能力為零；當(dāng) ODc

1.10 藥敏試驗(yàn)分離菌參照藥物紙片法進(jìn)行操作，根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果判斷。

2 結(jié)果

2.1 病毒性病原檢測結(jié)果采集的貉陰道分泌物、死胎等病料組織243份中犬瘟熱病毒、偽狂犬病病毒、阿留申病毒PCR檢測均為陰性。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果疑似分離菌株在麥糠凱培養(yǎng)基、E.coli顯色培養(yǎng)基長出的菌落形態(tài)、鏡檢形態(tài)學(xué)及生化特性與報(bào)道的E.coli的培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)及生化特性基本一致。經(jīng)統(tǒng)計(jì)采集的243份樣品中121株分離菌株初步鑒定為E.coli。

2.3 細(xì)菌的PCR檢測結(jié)果對初步鑒定為E.coli分離株用16S rRNA 通用引物對其分離菌株進(jìn)行 PCR進(jìn)一步鑒定。結(jié)果顯示，分離菌株的目的條帶約為 1 500 bp，與預(yù)期結(jié)果相符(圖 1)。分離菌株測序后與 NCBI 中報(bào)道的E.coli16S rRNA 序列同源均≥99.9%，測序比對結(jié)果表明分離株均為E.coli。

M.DL2000 DNA Marker；1～8.分離菌株;9.空白對照

2.4 致病性檢測結(jié)果攻毒組的小鼠在攻毒后的2～4 d出現(xiàn)采食量減少、嗜睡及流產(chǎn)等不同的發(fā)病情況，且個(gè)別小鼠出現(xiàn)急性死亡，從發(fā)病剖檢死亡的小鼠分離得到E.coli。對照組的小鼠健康存活。通過統(tǒng)計(jì)87株E.coli對妊娠小鼠具有不同致病性，致小鼠死亡5只菌株有25株、致小白鼠死亡4只菌株有32株、致小鼠死亡3只菌株有16株、致小鼠死亡2只菌株有14株，以致小鼠死亡4或5只菌株最多，分別占分離菌株的36.9%，28.7%。

2.5 細(xì)菌的血清型檢測結(jié)果用玻板凝集試驗(yàn)對分離的87株ExPEC進(jìn)行血清鑒定。結(jié)果顯示，所分離的87株ExPEC屬于14種不同的血清型，其中以O(shè)101(18.4%)、O38(17.2%),和O142(14.9%)為主要流行的血清型(表1)。

表1 致病性菌株的血清型檢測結(jié)果

2.6 細(xì)菌毒力基因的檢測結(jié)果對分離的87株ExPEC進(jìn)行毒力基因檢測，其中ExPEC 的特異性毒力基因papA/papC、sfa/foc、afa/dra、iutA、kpsMⅡ的檢出率為34.5%～82.3%，其他毒力基因fyuA、irp1、fimH、hlyA、yjaA、ibeA、iss、iroN、ompT、fimC、tsh的檢出率為5.7%～98.9%，毒力基因chuA、gafD、nfaE未檢測到(表2)。分離的87株致病菌株，攜帶多種毒力基因型，至少攜帶3種特異性毒力基因和5種其他毒力基因(表3)。

表2 致病性菌株的毒力基因檢測結(jié)果

表3 致病性菌株與毒力基因相關(guān)性分析結(jié)果

2.7 BF 形成能力分離的87株ExPEC中，強(qiáng)形成膜能力菌株有 24株(26.6%)、中形成膜能力菌株有34株(43.6%)、弱形成膜能力菌株有17株(19.5%)、不形成BF菌株的有12株(15.4%)。

2.8 耐藥性分析分離的87株ExPEC耐藥性嚴(yán)重，對阿莫西林、氨芐西林、鏈霉素等10種藥物的耐藥率較高，耐藥率為49.4%～98.9%，對頭孢噻呋、頭孢噻肟、氟苯尼考等7種藥物的耐藥率為9.2%～26.4%；分離的87株ExPEC呈現(xiàn)多重耐藥性，耐 16，3種藥物各有 1 株、耐 15，6，4 種藥物各3株，耐 14，7種藥物各8 株，耐13種藥物有 8株，耐9種藥物有7株，耐8，5種藥物各有 4株，耐10，11，12種藥物的分離菌株最多，分別占分離菌株的18.4%，16.1%和14.9 %(表4)。

表4 藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果

2.9 BF 形成能力與耐藥性相關(guān)性分析結(jié)果顯示，分離的87株ExPEC的BF形成能力與頭孢噻肟、林可霉素、慶大霉素、氟苯尼考、磺胺間甲氧嘧啶、紅霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、大觀霉素、新霉素10種抗生素的耐藥性符合率在90.1%～100.0%之間；與頭孢噻呋、阿莫西林、氨芐西林、鏈霉素、多西環(huán)素、多黏菌素6種生素的耐藥性符合率在87.2%～89.1%之間，說明分離的87株ExPEC的BF形成能力與耐藥性相關(guān)(表5)。

表5 BF 形成能力與耐藥性相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

ExPEC是臨床重要的人畜共患病原菌，對人和動(dòng)物危害較大，可以引起人和動(dòng)物一系列臨床癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[16]。許多研究表明ExPEC可以引起種成年母畜死胎與流產(chǎn)。本研究從2017—2020年采集243份流產(chǎn)貉陰道分泌物、死胎等病料組織中分離出單一病原菌E.coli，且對妊娠小鼠具有不同的致病性，同時(shí)犬瘟熱、阿留申、偽狂犬等病毒性疾病感染檢測為陰性。說明分離得到ExPEC可能是引起貉死胎、流產(chǎn)等生殖道疾病的主要病原菌之一。前期本課題組在2018年從死胎流產(chǎn)的藍(lán)狐體內(nèi)檢出ExPEC[12]。說明ExPEC對母貉具有潛在的危害，應(yīng)該注意該病的綜合防控。根據(jù)國內(nèi)報(bào)道的不同動(dòng)物源ExPEC具有不同血清型，不同地區(qū)，其血清型也存在一定的差異性[7]。本試驗(yàn)研究表明分離的87株ExPEC 以O(shè)38、O101和O142為主要流行優(yōu)勢血清型，國內(nèi)未見報(bào)道。國內(nèi)O38、O101和O142在豬源ExPEC中流行較多[17]?？赡茉诤训幕A(chǔ)日糧中添加的豬貨下腳料，污染病原菌，從而導(dǎo)致母貉流產(chǎn)、死胎。與前期本課題組在2018年從死胎流產(chǎn)的藍(lán)狐體內(nèi)檢出的ExPEC血清型存在差異性，可能與感染的宿主及飼料組成與來源有關(guān)。O38、O101和O142代表菌株可以作為研制多價(jià)疫苗的候選株，為進(jìn)一步研究該菌疫苗奠定基礎(chǔ)。

國外學(xué)者研究報(bào)道腸道ExPEC基因組中編碼了許多的毒力基因，毒力基因的攜帶及表達(dá)與其ExPEC的致病性具有一定的相關(guān)性，ExPEC分離菌株攜帶特定毒力基因papA/papC、sfa/foc、afa/dra、iutA、kpsMTⅡ中的2種及以上基因[15-17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，分離的87株ExPEC攜帶5種ExPEC 的特異性毒力基因和11種其他毒力基因，至少攜帶3種特異性毒力基因和5種他毒力基因；說明特異性毒力基因和其他毒力基因在ExPEC對宿主致病性過程中起著重要作用，其致病性與攜帶毒力基因相關(guān)。與芮萍等[4]、許騰林等[7]分離的不同動(dòng)物源ExPEC攜帶多種毒力基因一致。ExPEC編碼的毒力基因通過多種途徑分布于宿主的體內(nèi)并進(jìn)行表達(dá)，在多種毒力基因共同作用下導(dǎo)致宿主發(fā)病[18]。ExPEC在宿主體內(nèi)器官繁殖并產(chǎn)生內(nèi)毒素，通過宿主器官內(nèi)血液循環(huán)，引起菌、毒血癥，同時(shí)在毒素作用下可以促進(jìn)炎性因子的釋放，降低機(jī)體免疫力，導(dǎo)致子宮異常收縮，從而導(dǎo)致孕畜的死胎、流產(chǎn)。其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

國內(nèi)許多研究表明細(xì)菌形成BF可以抵抗外界不利環(huán)境因素的影響,是一種自我保護(hù)機(jī)制[7-9]。本試驗(yàn)研究表明，分離的87株ExPEC以強(qiáng)、中形成BF能力致病菌株為主，與張召興等[3]報(bào)道河北地區(qū)蛋雞源E.coli具有BF形成能力一致。李金朋等[7]報(bào)道從河南分離的豬源E.coli具有BF形成能力，與上述報(bào)道的一致。細(xì)菌BF形成能力是適應(yīng)外界環(huán)境的一種自我保護(hù)形式，其BF形成能力與其毒力及耐藥性具有一定相關(guān)性?？股厥桥R床中防治E.coli病的主要手段，不合理使用抗菌藥物，可導(dǎo)致很強(qiáng)的耐藥性，且E.coli的耐藥性可在不同菌株之間傳播[14]。本試驗(yàn)研究表明分離的87株ExPEC耐藥性嚴(yán)重，呈現(xiàn)多重耐藥性，其BF形成能力增強(qiáng)細(xì)菌耐藥性的機(jī)理尚未明確，有待進(jìn)一步研究。因此，在臨床中防治ExPEC應(yīng)該選擇敏感藥物，交替使用降低耐藥性，提高治療效果。E.coli廣泛存于環(huán)境中，可以通過多種途徑進(jìn)入體內(nèi)，尤其在母貉配種前、后應(yīng)該使用抗生素對細(xì)菌性疾病進(jìn)行凈化，配種過程中應(yīng)該注意環(huán)境的消毒，減少外界病原通過陰道入侵體內(nèi)，同時(shí)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，防止食源性感染。本研究為該地區(qū)致貉流產(chǎn)、死胎E.coli綜合防控提供參考依據(jù)。