1株同時攜帶tet(X6)和tet(X3)的禽源印地不動桿菌比較基因組學分析

李垠樹，趙 冰，孫華潤，何 坤，許 慧，梁玉蕾，胡功政，苑 麗

(河南農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，河南 鄭州 450046)

不動桿菌屬(Acinetobacter)是條件致病菌，當機體抵抗力降低時易引起機體感染，是引起醫(yī)院感染和暴發(fā)的重要致病菌之一，可引起呼吸道感染、腦膜炎、泌尿生殖道感染、皮膚及軟組織感染等，重癥者可導致死亡，多見于老年人和嬰幼兒[1-2]。主要包括鮑曼不動桿菌、醋酸鈣不動桿菌、洛菲不動桿菌、溶血不動桿菌、瓊氏不動桿菌、約翰遜不動桿菌和抗輻射不動桿菌等。2012年,MALHOTRA等[3]首次從印度一個垃圾場分離鑒定出印地不動桿菌(Acinetobacterindicus)，盡管其屬于非鮑曼不動桿菌屬，但是也是重要的條件致病菌。2016年，杜慧竟等[4]在核對中國醫(yī)學細菌保藏管理中心庫藏的1株卡他布朗漢姆菌時，發(fā)現(xiàn)該菌株實為印地不動桿菌，表明2012年前我國已有印地不動桿菌的存在。

四環(huán)素類抗生素被廣泛應用于農業(yè)植物、水產養(yǎng)殖和動物生產的細菌感染治療[5]，包括土霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素等，近年來由于細菌對本類藥物的耐藥日趨嚴重，臨床應用受到一定的限制。替加環(huán)素是一種新的四環(huán)素類藥物，于2005年6月被美國食品和藥物管理局(FDA)批準用于復雜的腹腔內感染、復雜的皮膚及軟組織感染(cSSSLs),2008年批準用于治療社區(qū)獲得性肺炎，也被視作治療碳青霉烯類多重耐藥革蘭陰性菌嚴重感染的最后藥物之一[6-7]。1984年，GUINEY等[8]在專性厭氧脆弱擬桿菌攜帶的質粒上發(fā)現(xiàn)新型四環(huán)素耐藥基因tet(X)，可以在有氧環(huán)境培養(yǎng)的大腸埃希菌中表達抗性，但是在原宿主中不表達。伴隨著耐藥基因tet(X)的出現(xiàn)，說明革蘭陰性菌的最后一道防線已被攻破。與外排泵基因和核糖體保護基因的作用機理不同，tet(X)編碼合成的氧化還原酶可通過化學修飾改變四環(huán)素類的分子結構，從而使其失活[9]，因此弄清tet(X)的傳播機制，為臨床控制替加環(huán)素耐藥菌的傳播具有重要意義。

近年來，一些動物園為招攬游客(尤其是未成年人)，專門在園內設置禽類散養(yǎng)場。游客在散養(yǎng)場可以與動物進行親密接觸、飼喂等互動，以增加游園的趣味性。但是，人與動物的直接或間接接觸，可能會增加人獸共患病病原體從動物傳播給人的機會，并引起游客的感染，尤其是免疫力低下的人群，如老年人和兒童[10]。本研究從某市動物園的禽類散養(yǎng)場分離獲得1株印地不動桿菌，該菌株同時攜帶2種tet(X)的變異體：tet(X6)和tet(X3)，經藥敏試驗、全基因組測序及比較基因組學分析，探究動物園散養(yǎng)場在人畜共患病原菌散播中的作用，并為臨床控制替加環(huán)素耐藥基因的散播提供部分依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源2019年7月在某市動物園內的禽類散養(yǎng)場采集42份樣品(包括新鮮糞便和肛門拭子)，從其中1只健康珍珠雞糞便樣品中分離到菌株LYS68A。

1.2 抗菌藥物氟苯尼考、多西環(huán)素、土霉素、替加環(huán)素、慶大霉素、新霉素、阿米卡星、復方磺胺二甲嘧啶(磺胺二甲嘧啶∶甲氧芐啶=5∶1)均由河南牧翔動物藥業(yè)有限公司提供，所有藥物均在有效期內使用。

1.3 培養(yǎng)基LB肉湯培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基均購于北京路橋技術有限公司，使用前都在有效期內，使用時嚴格按照說明書配置好并高壓滅菌保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細菌分離鑒定使用LB肉湯、LB瓊脂對LYS68A進行純化，挑取單菌落通過革蘭染色鏡檢和全自動細菌鑒定儀(VITEK COMPACT 2，法國生物梅里埃公司)初步鑒定種屬，經全基因組測序進一步確定種屬。

1.5 藥物敏感性測定采用微量肉湯稀釋法[11]測定9種抗菌藥物對菌株LYS68A的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，藥敏結果根據(jù)美國臨床試驗室標準化協(xié)會(CLSI)標準判讀[11]，質量控制菌株為大腸埃希菌ATCCR25922。

1.6 耐藥基因檢測通過煮沸法提取菌株LYS68A的基因組，采用PCR方法對替加環(huán)素耐藥基因tet(X)進行檢測，引物tet(X)-F：5′-CGAAAGAGACAA-CGACCGAGAGGCA-3′；tet(X)-R：5′-AGGAAA-TTTCCTTGTGGGCAAGCAT-3′)由本實驗室設計，目的片段長750 bp，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR反應體系為20 μL：2×Taq Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL，模板1 μL。取5 μL PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA片段長度，選取特異性強的PCR產物送至北京擎科生物技術有限公司進行單向測序，結果與NCBI數(shù)據(jù)庫相關序列進行比對。

1.7 全基因組測序使用天根全基因組提取試劑盒提取菌株LYS68A的基因組DNA；全基因組測序由武漢貝納科技服務有限公司完成；采用Illumina Nextseq 500和ONT(Oxford Nanopore Technologies)MinION平臺進行測序；使用unicycler(0.4.8)軟件對短讀長序列和長讀長序列進行組裝[12]，染色體序列先在RAST網站(http://rast.nmpdr.org)進行注釋，然后利用BLASTn和BLASTp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast)對序列進行比對分析；使用CGE服務器(https://cge.cbs.dtu.dk/services/)和綜合抗菌素耐藥性數(shù)據(jù)庫(https://card.mcmaster.ca/)對耐藥基因進行檢索、分析；使用ISfinder(https://isfinder.biotoul.fr/)對插入元件(IS)進行識別、鑒定；序列的線性化分析比較使用Easyfig 2.2.3，而環(huán)形結構圖譜繪制使用BRIG進行分析[13-14]。將LYS68A基因組序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得的序列號為CP070997。

2 結果

2.1 菌株的鑒定革蘭陰性菌LYS68A經全自動細菌鑒定儀鑒定為洛菲不動桿菌(Acinetobacterlwoffii)，盡管有不吻合的典型生化譜，但仍屬于極好鑒定(概率為98%)(表1)。由于全自動細菌鑒定儀鑒定不動桿菌的菌屬有限，僅能檢出8種(鮑曼不動桿菌復合菌、溶血不動桿菌、瓊氏不動桿菌、魯氏不動桿菌、醫(yī)院不動桿菌、皮氏不動桿菌、抗放射不動桿菌、烏爾辛不動桿菌)，因此經第3代全基因組測序，并將LYS68A的16S rRNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對后最終確定該菌株其實屬于印地不動桿菌(Acinetobacterindicus)。

表1 菌株LYS68A的生化試驗詳情

2.2 藥物敏感性檢測結果藥敏結果表明菌株LYS68A對氟苯尼考(MIC=32 mg/L)、土霉素(MIC=16 mg/L)和復方磺胺二甲嘧啶(MIC≥512 mg/L)呈現(xiàn)耐藥；而對慶大霉素、新霉素、阿米卡星、多西環(huán)素和替加環(huán)素(MIC≤1 mg/L)高度敏感。

2.3tet(X)檢測結果經PCR擴增、純化及測序比對表明菌株LYS68A攜帶有tet(X)的變異體，其與HE等[15]上傳的tet(X3)(MK134375)的同源性為100%。

2.4 比較基因組學分析菌株LYS68A基因組全長3 212 811 bp，GC含量45.72%，預測有3 042個基因，2 936個潛在CDS，81個tRNA，21個rRNA操縱子，4個ncRNA，11個基因島，1個crispr和89個IS插入序列。將菌株LYS68A基因組在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索后，發(fā)現(xiàn)了4條覆蓋率和同源性較高的序列，均為印地不動桿菌，分別是TQ18(CP045131)、B18(CP044455)、TQ23(CP045198)和TQ04(CP04-5129)。比較這5個菌的染色體可以發(fā)現(xiàn)(圖1)，它們均具有類似的骨架結構，且菌株LYS68A與TQ18、B18、TQ23和TQ04的同源性分別為98.66%，98.15%，98.56%,98.56%，其中菌株LYS68A的基因組在ribBA(106 735～107 805 bp)與tRNA-Gly(167 481～167 556 bp)之間插入了1段長為59 630 bp 的區(qū)域；在tRNA-Ile(1 309 968～1 310 044 bp)與intS(1 390 140～1 390 739 bp)之間插入了1段長度為80 095 bp的區(qū)域，說明tRNA-Gly和tRNA-Ile的周圍是潛在的熱點區(qū)域，外源DNA可通過同源重組或者插入的方式整合到基因組上。

圖1 印地不動桿菌菌株LYS68A與TQ18、B18、TQ23、TQ04的染色體比較圖

菌株LYS68A染色體上共攜帶9個耐藥基因(tet(X6)、tet(X3)、floR、sul1、aadA2、dfrA12、aph(3’)-I、mphE和sul2)，它們構成了一個由3部分組成的總長為29 252 bp(111 391～140 642 bp)的多重耐藥區(qū)(圖2)，此多重耐藥區(qū)位于插入片段(107 805～167 481 bp)內，即位于染色體tRNA-Gly的上游，推測是以一個整體直接插入菌株LYS68A染色體的熱點區(qū)域，即該多重耐藥區(qū)是以整體形式經同源重組完成水平轉移。

圖2 菌株LYS68A染色體上多重耐藥區(qū)的線性比較圖

左側部分是長度為8 634 bp(109 429～118 062 bp)的片段，包含了2個耐藥基因(tet(X6)和floR)。經比對后發(fā)現(xiàn)，本部分與HE等[15]在2020年報道的1株奇異變形桿菌染色體上的ICEPgs6Chn1(MN507533)元件內的多重耐藥區(qū)相似度較高。HE等[16]也證實該ICE元件可以形成環(huán)狀中間體而進行整體水平轉移，但并未研究ICE元件內的各部分能否獨立進行水平轉移。耐藥基因floR兩側含有2個方向相同的插入序列ISVsa3，但由于左側的ISVsa3部分缺失，故不能獨立成環(huán)完成水平轉移。耐藥基因tet(X6)的上、下游結構(hp-tet(X6)-α/β hydrolase-GMP synthase)與HE等[16]報道的tet(X6)的環(huán)境基因同源性高達99%，推測菌株 LYS68A通過ISVsa3和假定蛋白(hp)之間的熱點區(qū)域(TCTTCC)經同源重組獲得了tet(X6)基因。

中間部分(118 174～126 810 bp)經序列比對發(fā)現(xiàn)與質粒p1_085039(CP043007)的21 411～29 608 bp區(qū)域具有100%的同源性。片段左側由插入序列IS26介導，與p1_085039相比右側缺少1個IS1R，中間包含1個缺失了3’保守區(qū)的Ⅰ類整合子，該整合子的可變區(qū)包含了3個耐藥基因的耐藥基因盒dfrA12-duf1010-aadA2，該基因盒主要對磺胺類和氨基糖苷類耐藥。熊明華等[17]發(fā)現(xiàn)Ⅰ類整合子對氨基糖苷類耐藥基因的捕獲最多，其次是磺胺類耐藥基因。將這段長度為1 697 bp的耐藥基因盒序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對后發(fā)現(xiàn)，該結構在腸桿菌屬細菌中最為常見，在印地不動桿菌中較為少見。已經證實，Ⅰ類整合子不僅可捕獲外源性耐藥基因，而且可以在不同菌屬間進行水平傳播[18]，即該部分耐藥基因是經Ⅰ類整合子介導整合至印地不動桿菌菌株LYS68A的染色體中。

右側部分(129 813～141 822 bp)在NCBI數(shù)據(jù)庫中比較后發(fā)現(xiàn)，本片段包含了tet(X3)、aph(3’)-I、mphE和sul2等4個耐藥基因，其中tet(X3)上、下游基因環(huán)境(IS26-xerD-tet(X3)-res-hp-ISVsa3)與2019年HE等[15]報道質粒p34AB(MK134375)中的5 319～10 151 bp片段(ISVsa3-xerD-tet(X3)-res-hp-ISVsa3)的覆蓋率為86%，同源性達99%。HE等[15]發(fā)現(xiàn)tet(X3)基因在質粒中有3個相同的拷貝，且可以由相鄰的插入序列ISVsa3介導形成環(huán)狀中間體完成水平轉移。本試驗中菌株LYS68A的tet(X3)基因僅有1個拷貝，且僅一側含有ISVsa3，推測另一側的插入序列在同源重組后發(fā)生了缺失，結果導致tet(X3)不能獨立成環(huán)并完成水平傳播。

3 討論

替加環(huán)素是一種新的四環(huán)素類藥物，是治療多重耐藥病原菌的最后手段之一，可以克服外排泵和核糖體保護機制介導的四環(huán)素抗性。tet(X)最早是在1984年由GUINEY等[8]在專性厭氧脆弱擬桿菌攜帶的質粒上發(fā)現(xiàn)。YANG等[5]通過測定土霉素降解過程中的吸收峰，說明tet(X)是通過編碼一種黃素依賴的單加氧酶使四環(huán)素類抗生素失活。此后，人們陸續(xù)在動物源臨床分離株中鑒定出tet(X)或其變異體[19-20]，尤其是腸桿菌科細菌和不動桿菌[21-22]。2021年，UMAR等[23]在鴨疫里默桿菌中發(fā)現(xiàn)了一系列新型變異體tet(X18)至tet(X44)，預示tet(X)變異體的種類日趨復雜多樣。同時，攜帶2種tet(X)變異體的菌株也不斷被發(fā)現(xiàn)。2020年，CHENG等[24]檢出同時攜帶tet(X14)和tet(X2)豬源穩(wěn)桿菌，而本試驗首次在1株印地不動桿菌中同時檢出tet(X6)和tet(X3)，說明臨床菌株中攜帶多個tet(X)變異體的的現(xiàn)象日趨增多，對研究替加環(huán)素耐藥基因的水平傳播機制造成較大的困難和挑戰(zhàn)。

根據(jù)全基因組測序，本試驗在染色體上發(fā)現(xiàn)了2個tet(X)變異體：tet(X6)和tet(X3)。2020年，本實驗室曾從豬肉源奇異變形桿菌T60中分離鑒定了1個新型tet(X)變異體，稱為tet(X6)[16]，且奇異變形桿菌T60對替加環(huán)素(MIC=32 mg/L)耐藥。同樣的，質粒介導的tet(X3)最初是在2019年HE等[15]從豬源的耐替加環(huán)素鮑曼不動桿菌和大腸埃希菌中分離鑒定，隨后又從奶牛源糞便中分離到了攜帶tet(X3)的印地不動桿菌，且發(fā)現(xiàn)tet(X3)既可由染色體介導，又可由質粒介導，在奶牛場內既可克隆垂直傳播，又可經質粒接合水平傳播[25]。同時發(fā)現(xiàn)攜帶tet(X3)的分離菌均對替加環(huán)素(MIC≥8 mg/L)耐藥。經比對后發(fā)現(xiàn)本次分離獲得的印地不動桿菌菌株LYS68A攜帶的tet(X6)和tet(X3)與上述分離菌的tet(X)變異體同源性均很高，且上、下游的基因環(huán)境也高度相似。不同的是，本試驗中分離獲得的印地不動桿菌菌株LYS68A對替加環(huán)素高度敏感(MIC=1 mg/L)。此現(xiàn)象與2020年CHENG等[24]在豬源穩(wěn)桿菌中檢出的攜帶tet(X14)菌株對替加環(huán)素的敏感性相類似。GUINEY等[8]在專性厭氧脆弱擬桿菌攜帶的質粒上發(fā)現(xiàn)tet(X)時就已發(fā)現(xiàn)該基因在原宿主中不表達對四環(huán)素的抗性，但是卻在有氧環(huán)境培養(yǎng)的大腸埃希菌中表現(xiàn)出四環(huán)素抗性，猜測tet(X)是否表達主要與O2的是否存在有關。2007年，GHOSH等[26]首次在土壤中分離到1株攜帶tet(X)的好氧鞘氨醇桿菌，進一步證實tet(X)需要有O2才能表達四環(huán)素降解特性。MOORE等[27]發(fā)現(xiàn)，當TetX在O2和NADPH同時存在時會降解替加環(huán)素，結果導致攜帶tet(X)的宿主菌對替加環(huán)素表達抗性。本實驗室分離獲得的印地不動桿菌為專性好氧菌，但其攜帶的tet(X)仍未表達對替加環(huán)素的抗性，具體原因尚須進一步研究。同時，該印地不動桿菌是從某市動物園禽類散養(yǎng)場健康禽類的糞便中分離獲得，盡管暫時未對替加環(huán)素表達耐藥，但是并不影響tet(X)的變異體在菌屬間或不同動物間的傳播，再加上動物園禽類散養(yǎng)場中人與動物的互動較多，所以該基因通過人與動物密切接觸有很大機會傳播至人，尤其是抵抗力較差的老年人和嬰幼兒，同時，本試驗發(fā)現(xiàn)動物園禽類散養(yǎng)場是人畜共患病傳播的重要中間媒介和貯庫，應引起人們的重視。