環(huán)介導等溫擴增技術檢測柔嫩艾美耳球蟲二氫蝶酸合酶N377D突變

耿天天,王雅樂,羅莉妍,申 邦,,方 瑞,胡 敏,,趙俊龍,,周艷琴,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院 農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢 430070；2.湖北省預防獸醫(yī)學重點實驗室，湖北 武漢 430070)

目前，環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術已開發(fā)出用于檢測單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)的創(chuàng)新應用[1]。在對疾病進行臨床診斷和經(jīng)驗治療時，正確識別病原體基因型的某些特征對疾病的控制和治療有很大幫助[2]。雞球蟲病是一種嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的家禽疾病，臨床上常由多種不同類型的雞球蟲病病原體引起[3]。近年來，對雞球蟲病流行情況進行了大量研究，而柔嫩艾美耳球蟲常被認為是分布更廣、致病性更強的物種[4]。由于預防和治療費用相對較低，因此在預防方面更常使用抗球蟲藥，然而，隨著抗球蟲藥物的廣泛使用，雞球蟲逐漸產(chǎn)生耐藥性[5]?；前奉愃幬锸且活愂苣退幮杂绊憞乐氐呐R床常用藥物。在1948年，發(fā)現(xiàn)球蟲對磺胺類藥物具有抗藥性[6]。此后，許多學者將注意力集中在磺胺類藥物耐藥性檢測方法的研究上。傳統(tǒng)的磺胺類藥物耐藥性是通過耐藥性相關的雞體籠養(yǎng)試驗來檢測得以實現(xiàn)[7]。盡管這是檢測抗球蟲藥物的主流方法，但耐藥性檢測工作量大，檢測周期長。因此，采用分子檢測方法快速檢測磺胺類藥物耐藥性對家禽業(yè)大有裨益，而這可以通過LAMP方法實現(xiàn)。

在頂復門原蟲中，對磺胺耐藥性堿基突變的研究很少。據(jù)報道，其二氫葉酸合酶(dihydrofolate synthase,DHFS)407 位的氨基酸突變與弓形蟲的磺胺抗性有關，該位點的氨基酸從天冬酰胺突變?yōu)樘於彼?，即N407D[8]。在雞球蟲磺胺耐藥性的研究中，龔振興等[9]推測耐磺胺類藥物的柔嫩艾美耳球蟲的焦磷酸激酶-二氫蝶酸合酶(PPPK-DHPS)的第403位可能與耐藥有關，該位點的氨基酸由天冬酰胺突變?yōu)樘於彼?，即N403D。結(jié)合前人的相關研究，本試驗選取含有突變二氫蝶酸合酶(DHPS)的柔嫩艾美耳球蟲基因片段，即DHPS的部分基因片段(2 713 bp)。通過焦磷酸測序比對，發(fā)現(xiàn)1 129位的堿基突變，即A～G(第1 129位)，代表第377位氨基酸由天冬酰胺突變?yōu)樘於彼?，即N377D。因此，突變位點引起的氨基酸置換(N377D)極有可能與柔嫩艾美耳球蟲的磺胺抗性有關，因此該方法的建立為快速篩選含有單核苷酸多態(tài)性(SNP)(A1129G)的艾美球蟲提供了可能。在本研究開發(fā)并優(yōu)化了一種LAMP方法，可以準確地鑒別柔嫩艾美耳球蟲DHPS基因上N377D氨基酸取代的SNP(A1129G)。

1 材料與方法

1.1 試驗用蟲株和基因組從中國湖北省和河南省的8個不同地理區(qū)域收集新鮮雞糞便。從糞便樣品中獲得的雞球蟲卵囊通過飽和食鹽水漂浮法進行純化，而后將孢子化的卵囊4℃保存。提取基因組DNA，孢子化的卵囊用去離子水洗滌 3 次，在帶有裂解珠的快速樣品制備裝置(美國MP公司產(chǎn)品)中渦旋卵囊壁 3 次以釋放孢子體，加入 20 μL(20 g/L)蛋白酶 K。隨后，將混合物在 56°C 下孵育 8 h，并按照制造商的說明使用基因組 DNA 試劑盒(天根生化科技北京有限公司產(chǎn)品)提取 DNA。最后，將基因組DNA樣品-20℃保存。Eimeriaacervulina、Eimerianecatrix和Eimeriamaxima的 gDNA 來自中國農(nóng)業(yè)大學。

1.2 引物設計野生蟲株中編碼DHPS基因的核苷酸在位點 1 127～1 129的 N377WT 的氨基酸序列由 AAC 密碼子編碼，而 N377D 由突變分離株中的 GAC(N377D)密碼子編碼。LAMP引物組主要設計用于靶向特定核苷酸 N377WT?；谌崮郯蓝蛳x的DHPS基因(GenBank登錄號XM_013372551.1)，使用Primer explorer V4軟件程序(http://primer explorer.jp/e)設計4個特異性LAMP引物(2個內(nèi)部引物和2個外部引物)。有關引物名稱和序列信息見表1，圖1。

表1 LAMP中用于檢測柔嫩艾美耳球蟲DHPS基因N407D突變的引物序列

圖1 LAMP引物的靶序列

1.3 LAMP反應體系LAMP檢測為25 μL體系，含有10×Buffer 2.5 μL、MgSO41.5 μL、dNTPs 3.5 μL、甜菜堿4.0 μL，每個內(nèi)引物(FIP/BIP)4.0 μL、每個外部引物(F3/B3)0.5 μL、Bst DNA聚合酶(New England Biolabs公司產(chǎn)品)1.0 μL、模板DNA 1.0 μL和ddH2O 2.5 μL。反應液(Bst DNA聚合酶除外)95℃變性10 min，冰上冷卻1 min，加入Bst DNA聚合酶，68℃孵育60 min，80℃加熱10 min終止反應。最后，反應產(chǎn)物用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4 LAMP的優(yōu)化LAMP在不同MgSO4濃度(1.0～2.5 mmol/L)、溫度(60～69℃)、反應時間(10～60 min)和內(nèi)/外引物濃度比(1∶1～16∶1)下進行優(yōu)化。最后，通過凝膠電泳評估LAMP產(chǎn)品。

1.5 LAMP基因型的特異性檢測在優(yōu)化的LAMP反應條件下，以N377D突變株和N377WT的DNA為模板，測試LAMP引物的基因型特異性。

1.6 LAMP檢測臨床樣品以中國兩個不同種群的46份雞球蟲樣本進行可行性評估，這些樣本在本課題組之前的研究中已有報道[3,7]。

2 結(jié)果

2.1 LAMP反應的結(jié)果凝膠電泳顯示出典型的階梯型圖案，證明反應特異性良好(圖2)。

M.DL2000 DNA Marker;1.N377D突變株;2.陰性對照

2.2 引物的特異性從球蟲gD中擴增LAM產(chǎn)物，但未從Eimeria.acervulian、E.necatrix、E.maximaToxoplasmaGondii.-me49、TgRH△HX或ddH2O中擴增出產(chǎn)物(圖3)。此外,序列分析顯示在N377D突變株(G)或N377WT柔嫩艾美耳球蟲(A)的預期位置處有1個單峰，而在N377D突變株和N377WT柔嫩艾美耳球蟲混合株中的同一位置有2個峰(A和G)(圖 4)。這些觀察結(jié)果表明，擴增產(chǎn)物是柔嫩艾美耳球蟲的DHPS靶區(qū)，LAMP法具有良好的特異性。

M.DL5000 DNA Marker；1.具有點突變 N377D的基因組DNA;2.堆形艾美耳球蟲-gDNA;3.毒害艾美耳球蟲-gDNA;4.巨型艾美耳球蟲-gDNA;5.弓形蟲-me49-gDNA;6.弓形蟲RH△HX-gDNA;7.dH2O

G.具有點突變N377D的基因組DNA;A.點突變N377W的基因組DNA;G&A.基因組 DNA 與點突變 N377D 和 N377WT(A 和 G)的混合;ETH00013125.柔嫩艾美耳球蟲的DHPS基因(ToxoDB登錄號ETH00013125)

2.3 LAMP反應優(yōu)化的結(jié)果最佳反應條件顯示為1.5 mmol/L MgSO4，內(nèi)/外引物比為 8∶1，反應溫度為68℃，反應時間為 60 min(圖 5～8)。

M.DL5000 DNA Marker；1～5.1.0,1.5,2.0,2.5 mmol/L;5.具有點突變 N377WT的基因組DNA;6.ddH2O

M.DL5000 DNA Marker；1～5.1∶1～16∶1;6.具有點突變 N377WT的基因組DNA;7.ddH2O

M.DL5000 DNA Marker；1～6.64～69℃;7.ddH2O

M.DL5000 DNA Marker；1～6.10～60 min；7.陰性對照

2.4 LAMP反應的特異性通過上述最佳條件下的反應證實LAMP方法的特異性，用以區(qū)分 N377D 突變株與 N377WT 株(圖 9)。

M.DL5000 DNA Marker；1.陰性對照;2.具有點突變N377WT的基因組DNA;3.具有點突變 N377D基因組DNA

2.5 LAMP反應的靈敏度結(jié)果顯示，對耐藥蟲株的最低檢測限達40 μg/L(圖10)。

M.DL5000 DNA Marker；1.40 mg/L;2.4 mg/L;3.400 μg/L;4.40 μg/L;5.4 μg/L;6.400 ng/L;7.40 ng/L

2.6 應用LAMP反應檢測臨床樣品通過測試艾美球蟲田間樣品驗證所建立的LAMP方法可行性。在測試46個現(xiàn)場樣品中有43個被確定為陽性(表 2)。

表2 河南、湖北兩省田間樣品的柔嫩艾美耳球蟲二氫蝶酸合酶(DHPS)基因N377D SNP突變檢測結(jié)果 個

3 討論

LAMP方法常用于檢測SNP[10]，由于其分析速度快、操作簡單、成本低，但與簡單的 PCR 相比，它需要更多的條件優(yōu)化，也在一定程度上限制了其應用。LAMP方法使用Bst DNA 聚合酶，該酶缺乏3′→5′ 實時校正活性來區(qū)分堿基A～G(第 1 129個)進行基因分型。因此，該方法的關鍵在于引物設計和靶基因大小的選擇性控制。本研究在300 bp大小靶基因片段經(jīng)過多次探索后發(fā)現(xiàn)，在引物FIP堿基突變位點的前2個位置引入G和T錯配可以提高方法的特異性。

同時，還評估了該方法的其他變量。由于退火溫度對方法建立的影響較大,先探討退火溫度，然后再探討合適的退火溫度下的其他反應條件，如內(nèi)、外引物的最佳濃度比。本研究嘗試了多組引物梯度，發(fā)現(xiàn)在8∶1的工作濃度比下特異性達到最強。LAMP方法的靈敏度通過多重稀釋法進行評估，其對耐藥蟲株的最低檢測限達到40 μg/L，可以滿足臨床樣品檢測的靈敏度要求。

DHPS基因中的N377D的SNP 很可能與磺胺類藥物抗性有關[9]。在本研究中結(jié)構(gòu)模型揭示了耐磺胺突變N377D和N377WT 之間的明顯差異，這可能為宿主特異性提供分子解釋。該模型顯示含有 N377D 的蛋白的活性口袋相對N377WT的口袋是“封閉的”(圖 11)。

圖11 柔嫩艾美耳球蟲 DHPS 野生型(A)和抗性突變體中氨基酸 377(B)的關鍵結(jié)構(gòu)變異

本研究推測Asn-377殘基可能在DHPS催化和蛋白結(jié)構(gòu)中起關鍵作用，這也得到了DHPS蛋白活性測試的很好支持。因此，該方法的建立為篩選突變株提供了極大的便利，也為后續(xù)研究該突變與磺胺耐藥性的相關性創(chuàng)造了更好的條件。綜上所述，所建立的LAMP方法具有特異性高、靈敏度高、簡便易行等優(yōu)點，可用于我國柔嫩艾美球蟲N377D突變株的檢測。雖然該方法目前只針對引起氨基酸取代(N377D)的SNP(A1129G)進行檢測，但該SNP 極有可能與柔嫩艾美耳球蟲對磺胺類藥物的耐藥性有關，因此該方法為后續(xù)篩查含有單核苷酸多態(tài)性SNP(A1129G)的柔嫩艾美耳球蟲提供了良好的條件。