柔嫩艾美耳球蟲EtMIC2蛋白重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建與鑒定

劉嘉韻，陳學(xué)秋，陽毅敏，吳 飛，潘靈韜，趙明秀，王 釗，杜愛芳

(浙江大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院 浙江省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室，浙江 杭州 310012)

雞球蟲病(coccidiosis)是艾美耳球蟲寄生于雞腸道所引起的一種原蟲病，可導(dǎo)致家禽生長不良、生產(chǎn)性能下降，甚至死亡，對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。在世界公認(rèn)的9種危害雞的艾美耳球蟲中，柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)最為常見，致病力最強，可導(dǎo)致雛雞高病死率[2]。目前球蟲病防控主要依靠預(yù)防性抗球蟲藥，但耐藥性和藥物殘留問題日益突出，而活疫苗存在制作工藝繁瑣、穩(wěn)定性差且有散毒風(fēng)險等問題[3]。因此，家禽養(yǎng)殖業(yè)亟需開發(fā)安全有效的新型抗球蟲疫苗。

枯草芽孢桿菌作為腸道微生態(tài)平衡中的重要益生菌，可促進(jìn)腸道有益菌生長，減少病原菌定植，維護(hù)腸道健康[4-5]。其在營養(yǎng)缺乏或其他脅迫條件下所形成的芽孢抗逆性極強且具免疫學(xué)特性[6]。目前，以芽孢為載體，通過芽孢表面展示技術(shù)研制新型口服重組蛋白疫苗是研究的熱點。

微線體蛋白EtMIC2在球蟲黏附入侵宿主過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[7]，可作為阻斷蟲體入侵宿主細(xì)胞的候選抗原。已有研究表明，EtMIC2能作為抗原引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，減輕雞球蟲感染后的盲腸損傷，減少卵囊排出量，具有良好的免疫保護(hù)效果[8-9]。

基于芽孢表面展示技術(shù)，構(gòu)建表面展示雞球蟲抗原蛋白的重組枯草芽孢桿菌可為球蟲病防控提供新的更加安全穩(wěn)定有效的途徑，因此本研究擬以CotB為錨定蛋白，通過同源雙交叉重組實現(xiàn)柔嫩艾美耳球蟲抗原EtMIC2在枯草芽孢桿菌芽孢表面的展示，以期為新型雞球蟲疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、菌株、質(zhì)粒及卵囊TOP10感受態(tài)細(xì)胞、枯草芽孢桿菌WB800N菌株以及pDG364載體均為本實驗室保存；柔嫩艾美耳球蟲卵囊(豪頓株)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)索勛教授惠贈，傳代復(fù)壯后保存于本實驗室。

1.2 主要試劑LA Taq酶體系、DNA Marker、各種限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；溶菌酶和氯霉素購自生工生物工程(上海)股份有限公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購自索萊寶公司；FLAG兔單抗購自Cell Signaling Technology；山羊抗兔IgG(H+L)-HRP、山羊抗兔IgG(H+L)-FITC和蛋白Marker購自弗德生物科技有限公司；2.5%戊二醛、緩沖液、乙醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；餓酸購自SPI-CHEM公司。

1.3 引物設(shè)計根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的EtMIC2基因序列(登錄號：AF111839.1)和枯草芽孢桿菌168基因組(登錄號：CP053102.1)中CotB及其啟動子區(qū)的基因序列，設(shè)計特異性擴(kuò)增引物，其中EtMIC2基因去掉信號肽序列并在下游引入1×FLAG標(biāo)簽和EcoR Ⅰ酶切位點，在CotB啟動子區(qū)上游引入BamH Ⅰ酶切位點，并根據(jù)同源臂兩側(cè)序列設(shè)計特異性鑒定引物amyE-F和amyE-R，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列信息見表1。

表1 引物序列

1.4 目的基因EtMIC2的擴(kuò)增以柔嫩艾美耳球蟲子孢子cDNA為模板，以EtMIC2-F和EtMIC2-R為引物，PCR擴(kuò)增EtMIC2基因。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)擴(kuò)增30次；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后，按照DNA凝膠回收試劑盒操作說明書回收純化EtMIC2基因。

1.5 表達(dá)EtMIC2基因的整合型重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定提取枯草芽孢桿菌WB800N菌株基因組，以基因組為模板，利用引物CotB-F和CotB-R通過PCR擴(kuò)增芽孢衣殼蛋白基因CotB片段，其中包括263 bp的啟動子和825 bp的部分N端編碼序列。將其與目的基因EtMIC2通過重疊PCR技術(shù)，得到融合基因片段CotB-EtMIC2，最后通過無縫克隆技術(shù)將其與載體pDG364進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化至E.coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞。次日挑取陽性克隆進(jìn)行PCR檢測、質(zhì)粒雙酶切鑒定和基因測序驗證，將鑒定正確的整合型重組質(zhì)粒命名為pDG364-CotB-EtMIC2。

1.6 重組枯草芽孢桿菌rBSCotB-EtMIC2的構(gòu)建及基因組PCR鑒定將提前制備好的枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，融化后加入經(jīng)Kpn Ⅰ單酶切的線性化重組質(zhì)粒pDG364-CotB-EtMIC2，充分混勻后冰浴10 min，再轉(zhuǎn)入預(yù)冷的1 mm電轉(zhuǎn)杯中，電轉(zhuǎn)電壓設(shè)為2 400 V，電轉(zhuǎn)時間為4.6～5.0 ms，電擊1次后，立即加入1 mL RM培養(yǎng)基，置于37℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 h，隨后涂布于含氯霉素抗性的LB平板，37℃條件下倒置培養(yǎng)過夜。挑選單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提取基因組為模板，同時以枯草芽孢桿菌WB800N基因組為陰性對照，用鑒定引物amyE-F和amyE-R擴(kuò)增驗證正確后送至測序，將鑒定正確的重組菌命名為rBSCotB-EtMIC2。

1.7 重組芽孢的制備與純化將PCR鑒定正確的重組菌rBSCotB-EtMIC2單克隆于LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，再以1∶100轉(zhuǎn)接入DSM培養(yǎng)基，在37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中200 r/min培養(yǎng)72 h。將菌體離心去上清，用無菌去離子水洗滌沉淀3次，并用去離子水重懸。加入終質(zhì)量濃度為0.002 g/L的溶菌酶，37℃水浴2 h，再用1 mol/L無菌氯化鈉和1 mol/L無菌氯化鉀各洗滌1次，最后用無菌去離子水重懸，得到芽孢懸浮液。

1.8 重組芽孢Western blot鑒定將芽孢懸浮液以8 000 r/min，離心10 min，棄上清，用1 mL SDS-DTT溶液重懸，37℃水浴2 h后，以8 000 r/min，4℃離心10 min，用0.05 mol/L Tris-HCl洗滌3次，最后用裂解液(0.05 mol/L Tris-HCl，0.5 mol/L EDTA)懸浮，置于冰上超聲破碎(功率300 W，工作2 s，間隔4 s)15 min，以8 000 r/min，4℃離心10 min，上清即為芽孢衣殼蛋白提取液。吸取上清制樣，以FLAG兔單抗(工作濃度1∶2 000)為一抗，以HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(工作濃度1∶5 000)為二抗，進(jìn)行Western blot鑒定。

1.9 重組芽孢免疫熒光檢測收集培養(yǎng)好的重組芽孢rBSCotB-EtMIC2和WB800N芽孢，固定于載玻片上，滴加含1%BSA的封閉液，37℃封閉1 h。以FLAG兔單抗(工作濃度1∶500)為一抗，4℃孵育過夜，用PBS洗3次后，以FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(工作濃度1∶1 000)為二抗，37℃避光孵育1 h，用PBS洗3次后，利用免疫熒光顯微鏡觀察芽孢表面的熒光情況。

1.10 掃描電鏡分析收集芽孢置于1 mL 2.5%戊二醛中，4℃固定過夜后，棄去固定液，用0.1 mol/L PBS漂洗3次，再用1%餓酸固定1～2 h，PBS漂洗3次后，依次用梯度濃度30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%的乙醇溶液進(jìn)行脫水處理，在臨界點干燥，鍍膜后，掃描電子顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 目的基因EtMIC2與CotB的擴(kuò)增從柔嫩艾美耳球蟲和枯草芽孢桿菌基因組中分別擴(kuò)增EtMIC2基因和芽孢衣殼蛋白編碼基因CotB及其啟動子區(qū)的基因序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析可見在約993 和1 088 bp處有清晰條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。

M.DL5000 DNA Marker；1.CotB基因片段；2.EtMIC2基因片段

2.2 整合型重組質(zhì)粒pDG364-CotB-EtMIC2的鑒定用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ對重組質(zhì)粒pDG364-CotB-EtMIC2進(jìn)行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析可觀察到約6 268 bp的pDG364條帶與2 081 bp的CotB-EtMIC2融合基因條帶(圖2)，與理論值相符，序列測定結(jié)果顯示無基因突變和移碼，說明融合基因已成功克隆至表達(dá)載體中。

M.DL5000 DNA Marker；1.pDG364對照；2.pDG364-CotB-EtMIC2酶切產(chǎn)物

2.3 重組枯草芽孢桿菌基因組PCR驗證以重組菌rBSCotB-EtMIC2基因組為模板，用特異性鑒定引物進(jìn)行PCR驗證，產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示，WB800N陰性對照組出現(xiàn)了與理論值2 556 bp 大小相似的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，而重組枯草芽孢桿菌由于CotB-EtMIC2融合基因以及氯霉素抗性基因的插入，得到約5 674 bp的特異性條帶(圖3)，測序結(jié)果顯示融合基因無突變且正確整合于amyE基因位點。

M.DL10000 DNA Marker；1.WB800N；2.重組菌rBSCotB-EtMIC2

2.4 Western blot 分析提取重組芽孢rBSCotB-EtMIC2芽孢蛋白，以WB800N芽孢蛋白為陰性對照，進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果顯示重組芽孢rBSCotB-EtMIC2在約65 kDa處有特異性條帶(圖4)，與目的大小相符，而WB800N無條帶，表明重組芽孢成功表達(dá)CotB-EtMIC2融合蛋白。

M.蛋白Marker；1.重組芽孢rBSCotB-EtMIC2；2.WB800N芽孢

2.5 間接免疫熒光檢測對純化后的重組芽孢rBSCotB-EtMIC2進(jìn)行免疫熒光分析，利用熒光顯微鏡觀察CotB-EtMIC2蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與陰性對照WB800N相比，重組芽孢表面可檢測到明顯的特異性綠色熒光信號(圖5)，表明融合蛋白成功表達(dá)并可展示于芽孢表面。

BF.白光圖；IF.熒光圖

2.6 掃描電鏡分析為確定CotB-EtMIC2蛋白的表達(dá)是否影響芽孢結(jié)構(gòu)，用掃描電鏡觀察重組芽孢表面形態(tài)，結(jié)果顯示，與WB800N芽孢相比，重組芽孢rBSCotB-EtMIC2外殼、褶皺、形態(tài)和大小均無明顯表觀形態(tài)學(xué)變化(圖6)。

圖6 重組芽孢rBSCotB-EtMIC2掃描電鏡分析

3 討論

EtMIC2蛋白作為球蟲入侵過程中的關(guān)鍵蛋白，常被用為雞球蟲疫苗研究的免疫靶點。目前已有眾多研究表明，利用EtMIC2抗原制備的疫苗能刺激機(jī)體免疫應(yīng)答，對雞球蟲病感染起到良好的免疫保護(hù)效果。李蘊玉等[8]構(gòu)建的重組IL-2-EtMIC2 DNA疫苗可顯著提高機(jī)體的細(xì)胞與體液免疫水平及抗氧化能力，具有抗球蟲的效果。DING等[9]構(gòu)建的pcDNA-EtMIC2 DNA疫苗還能產(chǎn)生對堆型艾美耳球蟲的交叉免疫力，有效減輕雞腸道病變、減少盲腸卵囊數(shù)、提高相對體質(zhì)量增率等。HUANG等[10]將EtMIC2蛋白錨定在植物乳桿菌NC8菌株的表面，免疫雞群后結(jié)果顯示，該重組菌株增加了CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的百分比，IL-2細(xì)胞因子、IgG及SIgA抗體水平均顯著上升。由此可見，EtMIC2是極具應(yīng)用前景的候選抗原，可以作為雞球蟲疫苗研發(fā)的候選基因。

枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)因其在分泌和表達(dá)蛋白上的優(yōu)勢，已被廣泛用作黏膜疫苗載體。余東游等[11]研究表明，表達(dá)3-1E抗原基因的重組枯草芽孢桿菌對肉雞抗球蟲病具有一定的保護(hù)效果。近年來，由于其芽孢獨特的結(jié)構(gòu)和生理特性，芽孢表面展示技術(shù)迅猛發(fā)展，以枯草桿菌芽孢載體為基礎(chǔ)的呈遞型疫苗已經(jīng)成為研究的熱點。ISTICATO等[12]首次利用芽孢外衣殼蛋白CotB作為錨定蛋白，將破傷風(fēng)毒素的C片段(TTFC)成功地展示在芽孢表面。SUN等[13]以CotC為錨定蛋白在芽孢表面成功展示CsPmy華支睪吸蟲副肌球蛋白，以此制備的疫苗可顯著提高小鼠血清和腸黏液特異性IgG水平以及糞便和膽汁中的SIgA水平，產(chǎn)卵率明顯降低，發(fā)揮了良好的免疫效果。PHAM等[13]研究發(fā)現(xiàn)，通過連續(xù)飼喂表面展示VP28蛋白的重組枯草桿菌芽孢可大大提升黑虎蝦對白斑綜合征病毒的抵抗力。表面錨定的優(yōu)點在于異源蛋白能更好地與黏膜接觸，有助于激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，本試驗亦通過CotB將異源抗原表達(dá)在芽孢表面，以提高遞呈效力，熒光檢測結(jié)果充分證明了其良好的表面展示能力。此外，作為重要的益生菌，枯草芽孢桿菌還具有許多益生特性，可通過競爭性排斥病原菌定植，刺激宿主黏蛋白分泌[15]，激活免疫反應(yīng)等途徑增強抗球蟲感染的能力，抵御球蟲入侵，防止球蟲病繼發(fā)感染。

綜上所述，鑒于枯草芽孢桿菌表面展示系統(tǒng)具有以上優(yōu)勢，本研究將枯草芽孢桿菌錨定蛋白CotB與柔嫩艾美耳球蟲EtMIC2抗原融合表達(dá)構(gòu)建重組質(zhì)粒，通過同源重組將外源基因整合到枯草芽孢桿菌基因組中，成功制備了表面展示EtMIC2抗原蛋白的重組芽孢。下一步將開展雞體動物試驗，研究其對球蟲的攻毒保護(hù)效力，為研發(fā)高效、安全、熱穩(wěn)定性強的新型口服球蟲黏膜疫苗打下良好的工作基礎(chǔ)。