犬流感病毒誘導(dǎo)的Beagle犬NLRP3炎性小體相關(guān)基因表達(dá)譜

陶 攀,寧章勇,王貴平,賈愛卿，周 沛,李守軍*,張桂紅*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東海大集團(tuán) 畜牧獸醫(yī)研究院，廣東 廣州511400)

犬流感(canine influenza,CI)是犬群的一種接觸性呼吸道傳染病，該病由正黏病毒科A型流感病毒屬的犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)引起。患犬主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、打噴嚏、食欲減退、精神沉郁等，嚴(yán)重者可因呼吸系統(tǒng)衰竭而死亡。由于流感病毒基因組是由單股分節(jié)段的RNA所組成，這使得流感病毒基因很容易發(fā)生重組而導(dǎo)致跨物種傳播。此外，與其他RNA病毒相比，流感病毒的RNA依賴于自身聚合酶，在病毒復(fù)制過(guò)程中容易出錯(cuò)，無(wú)法通過(guò)常規(guī)方法控制突變病毒的進(jìn)化，對(duì)全球公共安全造成了巨大的危害[1-2]。CIV主要有2個(gè)亞型：馬源H3N8[3-6]和禽源H3N2[7-9]。2004年馬源H3N8 CIV首次報(bào)道，在美國(guó)弗羅里達(dá)州賽犬場(chǎng)的賽犬身上檢測(cè)出。2007年首次從犬上分離到禽源H3N2 CIV。H3N2 CIV最初僅在亞洲國(guó)家流行[9-11]，現(xiàn)已傳播到美國(guó)和世界其他地區(qū)[12-13]。H3N2 CIV能引起犬典型呼吸道癥狀，如流鼻涕、打噴嚏和咳嗽等，以及呼吸道以外的其他許多器官的損傷[14-15]。

NLRP3炎性體途徑是宿主早期關(guān)鍵的炎癥反應(yīng)機(jī)制之一，能夠檢測(cè)病原體并啟動(dòng)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞聚集到感染部位。2002年首次提出炎癥小體通路，現(xiàn)被認(rèn)為是宿主防御感染先天效應(yīng)機(jī)制的一個(gè)組成部分[16]。NLRP3炎性體激活后能導(dǎo)致細(xì)胞炎癥因子IL-1β和IL-18前體的成熟以及分泌，進(jìn)而導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集到感染部位以及驅(qū)動(dòng)宿主炎癥反應(yīng)。IL-1β和IL-18的誘導(dǎo)和激活被認(rèn)為是炎性體激活的關(guān)鍵特征。除了調(diào)節(jié)宿主炎癥外，炎癥小體還被證明對(duì)后天性免疫反應(yīng)的發(fā)展至關(guān)重要，包括免疫記憶[17]。NLRP3炎癥小體的激活是宿主抵抗甲型流感病毒(IAV)感染的重要組成部分[18]。由IAV感染引起的致死性疾病往往與肺內(nèi)嚴(yán)重的免疫病理反應(yīng)有關(guān)[19]，如高致病性IAV暴發(fā)的特征是超炎性細(xì)胞因子反應(yīng)，這可能導(dǎo)致高死亡率[20-22]。而季節(jié)性IAV感染中，NLRP3炎癥小體的激活在限制感染導(dǎo)致的肺損傷方面起著關(guān)鍵作用[18,23]，炎癥反應(yīng)微弱，有助于清除IAV。因此，NLRP3炎癥小體的激活代表了IL-1β和IL-18炎癥細(xì)胞因子受控產(chǎn)生的關(guān)鍵平衡，因?yàn)檫^(guò)度旺盛或長(zhǎng)時(shí)間的刺激會(huì)增加炎癥疾病的負(fù)擔(dān)[23]，而適當(dāng)?shù)募せ顒t能夠?qū)Σ《靖腥竞颓宄a(chǎn)生有效的反應(yīng)。炎癥細(xì)胞因子對(duì)流感病毒感染的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不完全清楚，越來(lái)越多的證據(jù)表明炎癥小體激活可能對(duì)炎癥性疾病產(chǎn)生顯著影響[24]。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞、菌株、質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物H3N2 CIV(A/canine/Guangdong/B/2013)、犬腎上皮細(xì)胞系(madin-darby canine kidney,MDCK)由本實(shí)驗(yàn)室保存；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(唯地生物有限公司)；pET32a為本實(shí)驗(yàn)室保存；pET32a-NLRP3、pET32a-ASC和pET32a-Caspase-1為本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建；新西蘭大白兔(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。本試驗(yàn)使用的比格犬組織為本實(shí)驗(yàn)室保存的樣本，動(dòng)物試驗(yàn)所有程序經(jīng)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)SYXK(YUE)2014-0136)。

1.2 犬NLRP3炎癥小體相關(guān)基因的克隆和原核表達(dá)載體的構(gòu)建以NCBI上預(yù)測(cè)的犬NLRP3 mRNA(序列號(hào)：XM_025467830.1)、ASC mRNA(序列號(hào)：XM_014114362.2)、Caspase-1 mRNA(序列號(hào)：XM_025465696.1)為模板，通過(guò)Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)NLRP3、ASC和Caspase-1基因開放閱讀框(ORF)的PCR擴(kuò)增引物(表1)并通過(guò)華大基因有限公司合成?？寺LRP3、ASC和Caspase-1基因并連接至pET32a載體上，獲得pET32a-NLRP3、pET32a-ASC和pET32a-Caspase-1表達(dá)載體。

1.3 NLRP3、ASC與Caspase-1的原核誘導(dǎo)表達(dá)及重組蛋白的純化分別將鑒定正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組表達(dá)蛋白。采用切膠方法對(duì)蛋白進(jìn)行純化并濃縮，使蛋白終質(zhì)量濃度達(dá)到1 g/L左右。

1.4 NLRP3、ASC與Caspase-1蛋白多克隆抗體的制備及多抗特異性檢測(cè)將上述純化的蛋白(約為1 g/L)與弗氏佐劑等體積混合乳化后免疫新西蘭大白兔，無(wú)菌雙蒸水免疫耳靜脈作為陰性對(duì)照。免疫時(shí)重組蛋白的用量為500 μg/只，背部皮下多點(diǎn)注射法進(jìn)行免疫。2周后進(jìn)行2次免疫，以后間隔7 d加強(qiáng)免疫，共4次。最后1次免疫后7 d耳靜脈少量采血，經(jīng)ELISA測(cè)血清抗體效價(jià)，合格后即可采血，分離血清獲得抗體，然后用Western blot方法檢測(cè)多抗特異性。

1.5 熒光定量PCR檢測(cè)犬炎癥相關(guān)基因的表達(dá)譜

1.5.1檢測(cè)感染H3N2 CIV的MDCK細(xì)胞炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄 首先用MDCK鋪6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)到85%左右后，用H3N2 CIV感染(MOI = 1)，分別在12，24,48 h收取細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。用熒光定量PCR檢測(cè)炎癥相關(guān)基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平(表2)。

表2 熒光定量PCR引物序列

1.5.2檢測(cè)犬各組織炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平 感染H3N2 CIV后3，7 d，將比格犬安樂(lè)死，取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、氣管和淋巴放-80℃ 冰箱保存，檢測(cè)犬各組織炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)犬各組織NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的表達(dá)分別在感染H3N2 CIV后3和7 d對(duì)比格犬安樂(lè)死，取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、氣管和淋巴結(jié)用10%福爾馬林固定2 d，制作HE染色切片和免疫組織化學(xué)染色切片，并通過(guò)顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 比格犬NLRP3、ASC和Caspase-1基因的克隆與蛋白序列分析以比格犬脾臟組織RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)特異性引物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，分別得到比格犬NLRP3、ASC與Caspase-1基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，都分別得到1條單一的條帶，其大小分別與預(yù)測(cè)的NLRP3、ASC和Caspase-1基因的理論大小相符。將目的片段分別克隆到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)。經(jīng)質(zhì)粒PCR鑒定和測(cè)序分析結(jié)果均為正確，并將重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-NLRP3、pMD18-T-ASC和pMD18-T-Caspase-1。

2.1.1比格犬NLRP3蛋白氨基酸序列分析 將比格犬NLRP3蛋白序列與人(NM_004895)、小鼠(NM_145827)、大鼠(NM_001191642)、貓(XM_023253644.1)、牛(NM_001102219)、羊(KM236558.1)、馬(XM_023618258.1)、豬(NM_001256770)、雞(KF318520)、獼猴(NM_001114351.1)、黑猩猩(XM_024254358.1)、兔(XM_017339176.1)和非洲象(XM_023540335.1)的對(duì)應(yīng)蛋白序列用DNAStar進(jìn)行序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)比格犬NLRP3蛋白與貓的對(duì)應(yīng)蛋白同源性最高，為90.2%，與雞的對(duì)應(yīng)蛋白同源性最低，為33.7%(圖1)。構(gòu)建的NLRP3蛋白氨基酸序列進(jìn)化樹顯示，該蛋白在種屬內(nèi)具有保守性，種屬間具有差異性。用DNAStar對(duì)NLRP3蛋白的理化性質(zhì)分析表明，比格犬NLRP3基因編碼976個(gè)氨基酸，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為112.45 kDa。Conserved domains工具分析發(fā)現(xiàn)該蛋白存在PYD、NACHT和LRR結(jié)構(gòu)域，是結(jié)構(gòu)保守蛋白。

A.犬NLRP3基因的擴(kuò)增；B.NLRP3氨基酸同源性比較；C.NLRP3的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

2.1.2比格犬ASC蛋白氨基酸序列分析 將比格犬ASC蛋白氨基酸序列與人(NM_145182.2)、大鼠(NM_172322.1)、小鼠(NM_023258.4)、貓(XM_003998633.5)、牛(NM_174730.2)、羊(KM576770.1)、馬(XM_014842338.1)、斑馬魚(NM_131495.2)、獼猴(NM_001194572.1)、蝙蝠(XM_006106048.3)、猩猩(XM_002826376.3)、豬(MK302492.1)、非洲爪蟾(NM_001113079.1)的對(duì)應(yīng)蛋白用DNAStar進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)比格犬ASC蛋白與貓的對(duì)應(yīng)蛋白同源性最高，為78.6%，與斑馬魚的對(duì)應(yīng)蛋白同源性最低，為27.5%(圖2)。構(gòu)建的ASC蛋白序列進(jìn)化樹顯示，該蛋白在種屬內(nèi)具有保守性，種屬間具有差異性。用DNAStar對(duì)ASC蛋白的理化性質(zhì)分析表明，比格犬ASC基因編碼195個(gè)氨基酸，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為21.80 kDa。Conserved domains工具分析發(fā)現(xiàn)該蛋白存在PYD、CARD結(jié)構(gòu)域，是結(jié)構(gòu)保守蛋白。

A.犬ASC基因的擴(kuò)增；B.ASC氨基酸同源性比較；C.ASC的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

2.1.3比格的Caspaase-1蛋白氨基酸序列分析 將比格犬Caspase-1蛋白氨基酸序列與人(NM_001257118.3)、小鼠(NM_009807.2)、大鼠(NM_012762.2)、牛(XM_019975839.1)、羊(KP999980.1)、馬(AF090119.1)、豬(NM_214162.1)、貓(AF135968.1)、雞(AF031351.1)、猩猩(XM_009247004.2)、家蠶(AF448494.1)、斑馬魚(MG957992.1)的對(duì)應(yīng)蛋白序列用DNAStar進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)比格犬Caspase-1蛋白氨基酸序列與貓的對(duì)應(yīng)蛋白同源性最高，為75.9%，與斑馬魚的對(duì)應(yīng)蛋白同源性最低，為32.5%(圖3)。構(gòu)建的Caspase-1蛋白氨基酸序列進(jìn)化樹顯示，該蛋白在種屬內(nèi)具有保守性，種屬間具有差異性。用DNAStar對(duì)Caspase-1蛋白的理化性質(zhì)分析表明，比格犬Caspase-1基因編碼404個(gè)氨基酸，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為45.60 kDa。Conserved domains工具分析發(fā)現(xiàn)該蛋白存在CASc和CARD_CASP1-like結(jié)構(gòu)域，是結(jié)構(gòu)保守蛋白。

A.犬Caspase-1基因的擴(kuò)增；B.Caspase-1氨基酸同源性比較；C.Caspase-1的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

2.2 比格犬NLRP3、ASC和Caspase-1基因的原核表達(dá)與蛋白純化及多克隆抗體制備將鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取生長(zhǎng)良好的菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)過(guò)不同條件的誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)NLRP3、ASC基因在37℃下表達(dá)量較高，而Caspase-1基因在25℃誘導(dǎo)表達(dá)量較高。pET-32a空載誘導(dǎo)未見目的蛋白表達(dá)(圖4A)。誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白通過(guò)切膠回收方式在變性條件下進(jìn)行純化回收后，可見回收蛋白基本上為條帶單一的目的蛋白(圖4B)。用抗His標(biāo)簽的抗體檢測(cè)重組蛋白是否具有抗原特性，及抗原決定簇是否完整。結(jié)果表明，制備并純化的重組蛋白能夠被His標(biāo)簽抗體檢測(cè)到，抗原決定簇的完整性沒(méi)有受到破壞，能夠用于多克隆抗體制備(圖4C)。通過(guò)純化蛋白4次免疫新西蘭大白兔，得到高免血清。將制備好的兔抗NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白多克隆抗體做間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)，結(jié)果顯示血清效價(jià)都能達(dá)到1∶320 000，血清可以用于后續(xù)試驗(yàn)。Western blot檢測(cè)抗體的抗原性，結(jié)果條帶單一，無(wú)明顯的雜帶(圖4D)，表明所制備的抗血清的抗原性較好。

A.蛋白Marker;1.NLRP3;2.ASC;3.Caspase-1;4.Control

2.3 H3N2 CIV感染MDCK細(xì)胞后炎癥因子的表達(dá)對(duì)感染H3N2 CIV的MDCK細(xì)胞進(jìn)行炎癥相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)，結(jié)果表明MDCK細(xì)胞感染H3N2 CIV后炎癥相關(guān)基因的表達(dá)水平均在病毒快速?gòu)?fù)期間下降，病毒復(fù)制后期升高，只有IL-6一直保持高水轉(zhuǎn)錄(圖5)。

注：數(shù)據(jù)代表3組獨(dú)立數(shù)據(jù)下同

2.4 H3N2 CIV感染比格犬后炎癥因子的表達(dá)分別在H3N2 CIV感染比格犬后3和7 d安樂(lè)死比格犬，解剖并獲取了心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、氣管和淋巴結(jié)組織器官。分別對(duì)各個(gè)組織器官進(jìn)行熒光定量檢測(cè)炎癥因子mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示H3N2 CIV感染比格犬3 d后犬各組織炎癥相關(guān)基因的表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著降低，而7 d后在脾臟、肺臟、腦、氣管、淋巴結(jié)等組織中表達(dá)顯著升高(圖6)。

a～h.分別為心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、氣管、淋巴結(jié)的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

2.5 H3N2 CIV感染比格犬后各組織器官病理變化采集對(duì)照犬及攻毒3,7 d犬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、氣管等，常規(guī)固定、制片并進(jìn)行HE染色后觀察其病理組織學(xué)變化，結(jié)果表明：各組織器官與對(duì)照組沒(méi)有明顯的差異，只是攻毒7 d的犬肺組織間質(zhì)有明顯增生。表明是機(jī)體正在清除病毒，修復(fù)損傷組織(圖7)。

a.未攻毒犬組織；b.攻毒3 d犬組織；c.攻毒7 d犬組織；各組織依次為心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦，淋巴結(jié)和氣管，放大倍數(shù)為×200。下同

2.6 H3N2 CIV感染比格犬后各組織NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的表達(dá)采集對(duì)照犬、攻毒3和7 d 犬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、淋巴結(jié)、氣管等，常規(guī)固定、制片1式4份，并分別用未免疫陰性血清(圖8)、NLRP3、ASC和Caspase-1抗體血清進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，對(duì)NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白進(jìn)行組織特異性表達(dá)的分析。結(jié)果表明：攻毒3 d的犬各組織NLRP3蛋白的陽(yáng)性反應(yīng)與對(duì)照組相比整體上沒(méi)有明顯的變化，但攻毒7 d的犬各組織NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的陽(yáng)性反應(yīng)整體上明顯高于3 d，特別是在脾臟中的陽(yáng)性反應(yīng)更加明顯。說(shuō)明NLRP3蛋白在犬感染流感病毒后期高表達(dá)，這與熒光定量PCR結(jié)果一致(圖9，10，11)。

a.未攻毒犬組織；b.攻毒3 d犬組織；c.攻毒7 d犬組織

a.未攻毒犬組織；b.攻毒3 d犬組織；c.攻毒7 d犬組織

3 討論

犬的攻毒試驗(yàn)表明,比格犬感染H3N2 CIV后早期肺部的病理變化與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯的差異，炎癥反應(yīng)微弱，但感染晚期出現(xiàn)明顯病理變化，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。NLRP3炎癥小體的活化是機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)活動(dòng)的主要標(biāo)志之一。所以本研究通過(guò)熒光定量PCR對(duì)炎癥反應(yīng)的相關(guān)的基因NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α的mRNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CIV感染MDCK或比格犬早期細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄會(huì)被抑制，而后期會(huì)逐漸恢復(fù)。本研究進(jìn)一步克隆比格犬NLRP3炎癥小體組成蛋白NLRP3、ASC和Caspase-1的基因，通過(guò)DNAStar進(jìn)行蛋白序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)比格犬NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白均與貓的對(duì)應(yīng)蛋白同源性最高，分別為90.2%，8.6%,75.9%，說(shuō)明犬與貓的親緣關(guān)系比較接近。用DNAStar對(duì)NLRP3蛋白的理化性質(zhì)分析表明，比格犬NLRP3基因編碼976個(gè)氨基酸，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為112.45 kDa。Conserved domains工具分析發(fā)現(xiàn)該蛋白存在PYD、NACHT和LRR結(jié)構(gòu)域，是結(jié)構(gòu)保守蛋白。對(duì)ASC蛋白的理化性質(zhì)分析表明，比格犬ASC基因編碼195個(gè)氨基酸，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為21.80 kDa。Conserved domains工具分析發(fā)現(xiàn)該蛋白存在PYD和CARD結(jié)構(gòu)域，是結(jié)構(gòu)保守蛋白。對(duì)Caspase-1蛋白的理化性質(zhì)分析表明，比格犬Caspase-1基因編碼404個(gè)氨基酸，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為45.60 kDa。Conserved domains工具分析發(fā)現(xiàn)該蛋白存在CASc結(jié)構(gòu)域、CARD-CASP1-like結(jié)構(gòu)域，是結(jié)構(gòu)保守的蛋白。

通過(guò)原核表達(dá)蛋白純化，免疫新西蘭大白兔，成功獲得免疫原性較好的多克隆抗體。由于在純化蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)NLRP3蛋白是在大腸桿菌包涵體，嘗試不同方法，依然不能得到大量的純化蛋白，本試驗(yàn)采用切膠純化蛋白，通過(guò)His標(biāo)簽檢測(cè)蛋白抗原決定簇的完整性，結(jié)果表明切膠純化的蛋白可以被His標(biāo)簽抗體識(shí)別，純化蛋白可以用于下一步試驗(yàn)。

隨后用制備的多克隆抗體對(duì)比格犬NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白進(jìn)行組織表達(dá)譜檢測(cè)。對(duì)攻毒后3，7 d的犬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、淋巴結(jié)和氣管進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達(dá)譜，結(jié)果表明：攻毒7 d的犬各組織NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白陽(yáng)性反應(yīng)更強(qiáng)，而攻毒3 d的與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異。說(shuō)明犬NLRP3炎癥小體蛋白在犬感染流感病毒后期高表達(dá)，從而清除感染的病毒粒子。這些結(jié)果表明CIV可能在早期能夠抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，從而逃逸機(jī)體的免疫反應(yīng)。

克隆犬NLRP3、ASC和Caspase-1基因，通過(guò)蛋白序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，犬的NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白與貓的對(duì)應(yīng)蛋白同源性最高；通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)了MDCK細(xì)胞和比格犬感染H3N2 CIV后炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)在感染流感病毒早期炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，而在感染流感病毒后期的炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄比早期顯著升高；對(duì)NLRP3、ASC和Caspase-1基因進(jìn)行原核表達(dá)，制備多克隆抗體，通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)犬組織器官中炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在感染H3N2 CIV后3 d犬組織中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的陽(yáng)性反應(yīng)與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯的變化，而在感染7 d的犬組織中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白陽(yáng)性反應(yīng)明顯增強(qiáng)。

a.未攻毒犬組織；b.攻毒3 d犬組織；c.攻毒7 d犬組織

炎癥小體在炎癥性疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也是炎癥調(diào)控的靶標(biāo)。炎癥小體激活導(dǎo)致誘導(dǎo)宿主炎癥反應(yīng)以對(duì)抗病毒感染，現(xiàn)在被認(rèn)為是先天免疫的關(guān)鍵機(jī)制之一。盡管炎性體的活化導(dǎo)致病毒的有效清除和傷口愈合，但是過(guò)度和長(zhǎng)時(shí)間的活化對(duì)疾病恢復(fù)有不利影響。顯然，如果要有效地靶向治療炎癥以減輕疾病負(fù)擔(dān)，就必須更好地理解流感病毒感染期間炎癥因子的動(dòng)態(tài)平衡。本研究克隆了比格犬NLRP3、ASC和Caspase-1基因，并對(duì)其進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析，為進(jìn)一步探究犬NLRP3炎癥小體的功能及其在感染中的作用奠定理論基礎(chǔ)。