豬偽狂犬病病毒流行毒株JZ-45的分離鑒定與變異分析

苗信永，孔令昊，陳 雨，趙世杰，崔志瑩，李 聞，徐朋麗，陳 靜，張宜娜，李新生，夏平安*，吳 斌

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

偽狂犬病(pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的一種高度接觸性傳染病，該病沒有特異性宿主，可感染豬、熊、牛、羊等多種哺乳動(dòng)物[1]，感染后主要引起動(dòng)物發(fā)熱、奇癢(豬除外)以及腦脊髓炎等臨床癥狀[2]。自1902年在匈牙利首次發(fā)現(xiàn)PRV以來，該病毒一直被認(rèn)為是最重要的病原體之一[3]。1947年，李樹清等[4]首次發(fā)現(xiàn)貓PRV，此后該病在我國(guó)不同物種間的傳播被廣泛記錄。豬作為該病毒的唯一自然宿主，是PRV最主要的傳播媒介[5]，并且每個(gè)階段的豬均可感染PRV，感染后的豬普遍表現(xiàn)為體溫升高，但仔豬主要以神經(jīng)癥狀為主，病死率高達(dá)100%；育肥豬感染PRV后沒有明顯的癥狀，基本為隱性感染，但可長(zhǎng)期攜帶病毒，成為豬場(chǎng)最主要的傳染源；妊娠母豬感染PRV后會(huì)引起流產(chǎn)、死胎以及呼吸系統(tǒng)疾??；公豬感染后會(huì)引起繁殖障礙[6]。20世紀(jì)60-90年代，PRV在我國(guó)不少地區(qū)一直存在，并有流行的趨勢(shì)，嚴(yán)重阻礙了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。近年來，隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模的不斷發(fā)展以及生豬飼養(yǎng)市場(chǎng)之間的頻繁交流，PR在我國(guó)范圍內(nèi)開始廣泛流行，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨額損失[7]。雖然我國(guó)通過廣泛應(yīng)用從匈牙利引進(jìn)的商業(yè)疫苗Bartha-K61(一種基于PRV Bartha-K61株的減毒活疫苗)，使得PR在我國(guó)得到了很大程度地控制[8]。但2011年以后，在我國(guó)使用過商品化PRV疫苗的規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)再次出現(xiàn)了與PR極為相似的疫病，導(dǎo)致妊娠母豬產(chǎn)死胎、流產(chǎn)，仔豬患有神經(jīng)癥狀導(dǎo)致其死亡[9]。后經(jīng)我國(guó)學(xué)者證實(shí)，該病是由PRV的變異株暴發(fā)引起的[10]。本試驗(yàn)利用PCR檢測(cè)方法對(duì)2018—2020年河南省部分地區(qū)的疑似PRV病料進(jìn)行檢測(cè)，所獲得的陽性樣品進(jìn)行病毒分離鑒定，獲得1株P(guān)RV毒株JZ-45，進(jìn)行核苷酸序列對(duì)比分析等研究，從遺傳變異方面解釋現(xiàn)階段流行毒株與2011年變異毒株的親緣關(guān)系，以期為中國(guó)PRV的流行病學(xué)以及新型PRV疫苗研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 樣品來源2020年間河南省開封、周口、信陽、焦作、新鄉(xiāng)、濟(jì)源、登封等地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)送檢的臨床樣品。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞健康新西蘭白兔2只，購自鄭州幸福養(yǎng)殖場(chǎng)；4～6周齡SPF級(jí)昆明雌鼠30只，購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；豬睪丸細(xì)胞(ST),由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)基購自上?？寺∩锘瘜W(xué)有限公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司；高保真DNA聚合酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司；病毒DNA提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)參照GenBank收錄的PRV全基因序列設(shè)計(jì)PRV gB、gE檢測(cè)引物；gE、gC全基因引物，用以臨床病料的檢測(cè)、病毒核酸鑒定以及病毒變異性分析(表1)。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體信息見表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 5 min；98℃ 30 s,58℃ 30 s,68℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸10 min。

表1 引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度

1.5 病毒分離培養(yǎng)取適量陽性組織樣品，剪碎、研磨、勻漿、反復(fù)凍融3次后取上清，用0.22 μm無菌濾器過濾。按1 mL/25 cm2接種于匯合度至80%左右的ST細(xì)胞，盲傳2～3代后，ST細(xì)胞出現(xiàn)穩(wěn)定且典型CPE，待80%的細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收集備用。

1.6 空斑純化病毒液進(jìn)行10倍倍比稀釋(10-1～10-5)后，接種于6孔板內(nèi)匯合度至80%左右的ST細(xì)胞，500 μL/孔，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中作用1 h后，加入含2%血清和1%低熔點(diǎn)瓊脂糖的細(xì)胞培養(yǎng)基，室溫冷卻至凝固后，倒置放入細(xì)胞培養(yǎng)箱待出現(xiàn)CPE現(xiàn)象后，使用槍頭挑取空斑置于培養(yǎng)液中，反復(fù)凍融3次后，用RPMI-1640稀釋并繼續(xù)接種ST細(xì)胞和繼續(xù)進(jìn)行下輪的空斑純化。經(jīng)過6輪空斑純化，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.7 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)將病毒液接種于6孔板中單層ST細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，12 h左右未出現(xiàn)明顯CPE時(shí)，棄上清，加入1.5 mL的細(xì)胞組織固定液，固定30 min棄掉，加入1.5 mL 5%的BSA，封閉2 h棄去，加豬抗PRV多抗，37℃孵育1 h棄掉，加入FITC標(biāo)記的兔抗豬IgG，37℃孵育1 h，PBS洗滌，于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.8 病毒TCID50測(cè)定將病毒液10倍倍比稀釋(10-1～10-10)后，接種于96孔板內(nèi)匯合度至80%左右的ST細(xì)胞，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中作用1 h后，加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)96 h，按照Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度TCID50。

1.9 病毒LD50的測(cè)定及動(dòng)物試驗(yàn)將病毒液10倍倍比稀釋(10-1～10-5)后，于腹股溝皮下注射小鼠，100 μL/只，每組5只，對(duì)照組注射等量RPMI-1640。逐日觀察小鼠狀態(tài)及記錄小鼠的死亡數(shù)量，對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢制作組織病理切片，觀察心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦等組織的病理變化。根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算PRV JZ-45分離毒株的LD50。同時(shí)將100×LD50病毒液接種家兔，500 μL/只，每天觀察家兔的健康狀態(tài)，記錄出現(xiàn)的癥狀及病死時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 PRV核酸鑒定將送檢的臨床樣品研磨，離心抽取上清，用DNA提取試劑盒提取病毒基因組DNA，用gB、gE基因雙重PCR鑒定。凝膠電泳在383，603 bp左右出現(xiàn)特異性條帶，樣品擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

M.DL2000 DNA Marker；1.送檢樣品；2.陰性對(duì)照

2.2 病毒分離培養(yǎng)將上述檢測(cè)為陽性的PRV病毒液，接種ST細(xì)胞，10～12 h后，細(xì)胞折光性增強(qiáng)出現(xiàn)亮點(diǎn)，且細(xì)胞變大變圓、細(xì)胞脫落、拉網(wǎng)、破碎(圖2)。

A.正常的ST細(xì)胞；B.感染PRV病變的ST細(xì)胞

2.3 病毒空斑純化將病毒液接種細(xì)胞36～48 h后，在倒置的6孔板中可看到明顯的空斑(圖3)，待空斑長(zhǎng)至一定大小后，從中挑取單個(gè)空斑，經(jīng)過連續(xù)純化6輪，獲得純化的病毒株，命名為JZ-45。

A.PRV接種ST細(xì)胞空斑形態(tài)；B.陰性對(duì)照

2.4 間接免疫熒光試驗(yàn)分離的JZ-45毒株接種ST細(xì)胞，將豬抗PRV陽性抗體做100倍稀釋，后用FITC標(biāo)記的兔抗豬抗體與一抗結(jié)合，進(jìn)行免疫熒光鑒定。結(jié)果顯示，在熒光顯微鏡下可以觀察到細(xì)胞出現(xiàn)熒光標(biāo)記的細(xì)胞(圖4)，進(jìn)一步證明該分離株為PRV。

A,B,C.PRV接種ST細(xì)胞；D.空白對(duì)照

2.5 病毒TCID50測(cè)定PRV JZ-45毒株接種ST細(xì)胞72 h后，觀察每孔CPE，按Reed-Muench方法計(jì)算其TCID50為10-6.58/0.1 mL。

2.6 病毒LD50測(cè)定及組織病理學(xué)觀察PRV JZ-45毒株接種小鼠3 d后出現(xiàn)PRV典型癥狀：奇癢、流涎，啃咬接種部位，致使皮膚出血，記錄小鼠病死數(shù)量，持續(xù)觀察14 d，根據(jù)Reed-Muench法測(cè)得病毒LD50為10-2.681/0.1 mL；對(duì)測(cè)LD50過程中死亡小鼠剖檢制作組織病理切片，觀察其組織病理變化結(jié)果(圖5)。

A.心肌纖維溶解(黑色箭頭)，點(diǎn)狀炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(紅色箭頭)；B.肝臟有炎性細(xì)胞灶性浸潤(rùn)(黑色箭頭)，胞質(zhì)內(nèi)有空泡(黃色箭頭)；C.紅髓中有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(紅色箭頭)；D.肺組織肺泡壁增厚(黑色箭頭)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(紅色箭頭)，肺泡壁毛細(xì)血淤血(黃色箭頭)，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(橙色箭頭)；E.腎臟組織腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落(黑色箭頭)，腎小管管腔內(nèi)可見脫落的壞死細(xì)胞碎片(黃色箭頭)；F.腦部有炎性細(xì)胞點(diǎn)狀浸潤(rùn)

2.7 動(dòng)物試驗(yàn)將該病毒液接種家兔后，1 d內(nèi)無明顯臨床癥狀，2 d時(shí)，體溫升高，且食欲不振、3 d 時(shí)出現(xiàn)四肢痙攣、身體蜷縮，且對(duì)注射部位抓撓啃咬，注射部位脫毛、皮膚撕裂出血，并死亡。

2.8 PRV gC、gE基因擴(kuò)增將分離所得毒株用DNA提取試劑盒提取病毒基因組DNA，用PRV gC、gE全基因特異性引物擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳在1 791，1 862 bp左右出現(xiàn)特異性條帶，樣品擴(kuò)增結(jié)果見圖6。

2.9 病毒分離株變異性分析基于PRV分離株gC、gE基因推導(dǎo)氨基酸序列，利用MEGA 7.0軟件繪制其遺傳進(jìn)化樹。結(jié)果如圖7,8所示，PRV gC、gE基因遺傳進(jìn)化樹將參照毒株分為2個(gè)基因型，即Group 1和Group 2型：Group 1型均為國(guó)內(nèi)毒株，且Group 1型可進(jìn)一步分為2個(gè)基因亞型，分別是以HN1201為代表的變異毒株組成的基因亞型Group1.1和以Ea為代表的國(guó)內(nèi)經(jīng)典毒株組成的基因亞型Group 1.2。Group 2型均為美洲和歐洲毒株。由圖6，7可知分離得到的PRV毒株JZ-45 gC、gE基因與國(guó)內(nèi)經(jīng)典毒株(LA、Ea、Fa、NIA3、LXB6株等)均位于不同的進(jìn)化分支，而與國(guó)內(nèi)變異毒株親緣關(guān)系更近。經(jīng)核酸序列分析gC基因與國(guó)內(nèi)變異毒株GDWH、DL14、HN1201等同源性為99.9%～100.0%，與國(guó)內(nèi)經(jīng)典毒株Ea、Fa等同源性為99.2%～99.7%，與國(guó)外經(jīng)典毒株NIA3、Kaplan等同源性為96.0%～96.2%，氨基酸序列對(duì)比表明，與國(guó)內(nèi)變異毒株相比，氨基酸沒有發(fā)生變異或缺失，與國(guó)內(nèi)經(jīng)典毒株Ea毒株相比，有4處變異：T34N、E99K、G194E和S233R，與國(guó)外經(jīng)典毒株NIA3相比，在63位氨基酸位點(diǎn)處連續(xù)插入7個(gè)氨基酸(AAASTPA)，并且gC全基因序列中存在30處氨基酸替換。經(jīng)核酸序列分析gE基因與國(guó)內(nèi)變異毒株CH、HeN1、HN1201等同源性為99.7%～99.8%，與國(guó)內(nèi)經(jīng)典毒株Ea、SC等同源性為96.7%～99.4%，與國(guó)外經(jīng)典毒株NIA3、Kaplan等同源性為95.3%～97.8%，氨基酸序列對(duì)比表明，與國(guó)內(nèi)變異毒株相比，氨基酸沒有發(fā)生變異或缺失，與國(guó)內(nèi)經(jīng)典毒株Ea相比，有7處變異：G54D、Y286F、A308P、P403A、V448T、G510S和S518P以及2處氨基酸插入第447位(A)和492位(DG)，與國(guó)外經(jīng)典毒株NIA3相比，有27處氨基酸發(fā)生替換，在492位氨基酸位點(diǎn)處連續(xù)插入2個(gè)氨基酸(DG)。

M.DL2000 DNA Marker；1.PRV JZ-45；2.陰性對(duì)照

圖7 PRV JZ-45株gC基因遺傳進(jìn)化樹

3 討論

PR是一種在世界范圍內(nèi)廣泛流行，且多種動(dòng)物均可感染的高度接觸性傳染病[11]。自我國(guó)首次報(bào)道PR以來，PRV便成為了危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)最重要的病原之一[12]。2011年末，PRV變異毒株的出現(xiàn)，使得市場(chǎng)上傳統(tǒng)PR疫苗的保護(hù)力度大大下降，規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)再次出現(xiàn)了PR流行趨勢(shì)[13-14]。尤其在2017—2018年，PRV病原檢測(cè)陽性率在河南省規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)有所上升[15]。本試驗(yàn)通過ST細(xì)胞培養(yǎng)、空斑純化、動(dòng)物接毒、間接免疫熒光等分離鑒定方法，從PCR檢測(cè)為陽性的組織樣品中分離獲得1株可在ST細(xì)胞上增殖，且具有較強(qiáng)毒力的變異毒株P(guān)RV JZ-45。

圖8 PRV JZ-45株gE基因遺傳進(jìn)化樹

PRV的基因組為線狀雙股DNA，全長(zhǎng)約150 kb，相對(duì)分子質(zhì)量約9.2×104kDa，編碼70～100種蛋白，而影響病毒毒力強(qiáng)弱的主要是毒力基因編碼的毒力蛋白，包括TK、gC、gE等[16-17]，gC蛋白屬于Ⅰ型膜蛋白，全長(zhǎng)1 500 bp，共編碼了479個(gè)氨基酸。該蛋白與病毒吸附和誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體方面起到至關(guān)重要的作用[18]。gC蛋白的缺失會(huì)影響病毒的感染力，因此gC蛋白也是我國(guó)學(xué)者研究豬PRV疫苗的重要蛋白。本研究測(cè)序的PRV JZ-45毒株經(jīng)核酸序列分析gC基因與國(guó)內(nèi)變異毒株GDWH、DL14、HN1201等同源性為99.9%～100.0%，氨基酸序列沒有發(fā)生變異，與國(guó)內(nèi)經(jīng)典毒株Ea毒株相比同源性為99.2%～99.7%，氨基酸序列有4處變異：T34N、E99K、G194E和S233R，與國(guó)外經(jīng)典毒株NIA3、Kaplan等同源性為96.0%～96.2%，且在63位氨基酸位點(diǎn)處連續(xù)插入7個(gè)氨基酸(AAASTPA)，表明近年來的PRV變異毒株正在向著遠(yuǎn)離經(jīng)典毒株的方向發(fā)生變異，這也可能進(jìn)一步解釋了2011年末已免疫過Bartha-K61減毒苗的規(guī)?；i場(chǎng)再次出現(xiàn)PRV感染流行的狀況。gE基因是PRV主要毒力基因之一，全長(zhǎng)1 737 bp，共編碼了577個(gè)氨基酸。其編碼的蛋白屬于典型的囊膜蛋白，該蛋白可介導(dǎo)病毒在細(xì)胞與細(xì)胞之間的擴(kuò)散以及病毒粒子的釋放[19]。但gE蛋白的缺失不影響PRV病毒的復(fù)制，卻可以顯著影響PRV的毒力[20]，因此，gE蛋白成為了人們研究減毒苗的關(guān)鍵蛋白之一。本研究測(cè)序的PRV JZ-45毒株經(jīng)核酸序列分析gE基因與國(guó)內(nèi)變異毒株CH、HeN1、HN1201等同源性為99.7%～99.8%，氨基酸沒有發(fā)生變異或缺失，與國(guó)內(nèi)經(jīng)典毒株Ea、SC等同源性為96.7%%～99.4%，與國(guó)外經(jīng)典毒株NIA3、Kaplan等同源性為95.3%～97.8%，與國(guó)內(nèi)經(jīng)典毒株Ea相比，有7處變異：G54D、Y286F、A308P、P403A、V448I、G510S和S518P以及2處氨基酸插入第447位(A)和492位(DG)，有報(bào)道證明第48位和492～496位天冬氨酸(D)插入是鑒別PRV毒株是否為變異毒株的重要特征[21-22]。同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)了分離得到的PRV JZ-45毒株為變異毒株。

據(jù)報(bào)道，引起PRV毒株變異的主要原因可能是某些規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)注射不同基因缺失減毒苗導(dǎo)致的不同疫苗毒株之間發(fā)生重組，使其毒力返強(qiáng)[23]，現(xiàn)如今，變異毒株的流行，仍然對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而PRV JZ-45變異毒株的分離，為下一步變異毒株的研究和相關(guān)疫苗的制備奠定基礎(chǔ)。