皮質抑素通過p38 MAPK信號通路抑制急性心肌梗死后心力衰竭大鼠氧化應激及心肌細胞凋亡

顧 崢，王顧浩，劉 戀

目前，世界范圍內心力衰竭(heart failure，HF)病人已超過2300萬例，其發(fā)病率仍在持續(xù)上升。雖然近30年來心力衰竭的治療取得了很大進步，但心力衰竭病人5年死亡率仍高達50%[1]。心力衰竭的一個常見原因是急性心肌梗死(acuate myocardial infarction，AMI)。AMI通常預示著心功能不全的開始，由于心肌損傷、反復缺血、心肌頓抑和冬眠、心室重塑和慢性神經內分泌刺激等原因，AMI最終可能發(fā)展為心力衰竭[2]。據統(tǒng)計，急性心肌梗死住院病人的心力衰竭發(fā)病率介于14%～36%[3]。因此，開發(fā)關于心力衰竭新的治療藥物對于改善急性心肌梗死后心力衰竭(post-acuate myocardial infarction heart failure，HF-AMI)疾病現狀有重要意義。皮質抑素(cortistatin，CST)是一種含有FWKT (Phe-Trp-Lys-Thr)四聚體的小分子生物活性肽，廣泛分布于神經、免疫和內分泌系統(tǒng)。皮質抑素及其受體也廣泛分布于心血管系統(tǒng)，如主動脈、冠狀動脈和心臟。許多研究表明，皮質抑素具有調節(jié)睡眠、學習記憶、誘導免疫耐受、抑制炎癥反應、調節(jié)內分泌代謝等多種生物學效應[4]。近年來，越來越多的研究表明皮質抑素在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，如皮質抑素通過阻斷細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2信號通路抑制腹主動脈瘤小鼠巨噬細胞浸潤，抑制細胞凋亡，從而抑制腹主動脈瘤的產生[5]； 皮質抑素可減少頸動脈、心臟、主動脈弓和主動脈中動脈粥樣硬化斑塊的數量和大小，抑制Th1/Th17誘導的炎癥反應，從而抑制小鼠動脈粥樣硬化[6]。此外，已有研究表明，伊伐布雷定通過抑制p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信號通路介導的炎癥反應和心肌細胞凋亡，改善糖尿病心肌病小鼠心功能障礙[7]。目前，關于皮質抑素對HF-AMI的作用機制尚不明確。因此，本研究旨在探究皮質抑素對HF-AMI后心臟的保護作用，并明確其心臟保護機制是否與p38 MAPK信號通路和心肌細胞凋亡有關。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 40只雄性清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質量為220～250 g，購自蘇州大學實驗動物中心；大鼠皮質抑素-14肽購自美國Phoenix Pharmaceuticals Inc公司；總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒(羥胺法)、活性氧(ROS)測定試劑盒和丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA法)購自南京建成生物工程研究所；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)凋亡檢測試劑盒購自德國Roche；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗購自英國Abcam公司；磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶-6(p-MKK6)抗體、絲裂原活化蛋白激酶激酶-6(MKK6)抗體、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)抗體購自美國Cell Signaling Technology；二維M型和B型超聲診斷儀購自加拿大Visual Sonics；PowerLab ML880系統(tǒng)購自澳大利亞AD公司；熒光酶標儀購自美國Biotek。

1.2 HF-AMI動物模型制備[8]及給藥處理 40只SD大鼠飼養(yǎng)于標準動物房，提供充足的飲水及飼料，待大鼠適應環(huán)境1周后，將大鼠隨機分為假手術組、模型組、皮質抑素高劑量組(CST-H組)和皮質抑素低劑量組(CST-L組)，每組10只。1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，劑量為50 mg/kg，仰臥位，氣管插管，連接呼吸機、麻醉劑及心電監(jiān)護儀。模型組、CST-H組和CST-L組大鼠無創(chuàng)性結扎冠狀動脈左前降支，隨后可見結扎線下方心肌顏色發(fā)白、心電圖出現ST-T及Q波，此時HF-AMI動物模型建立成功。假手術組大鼠進行穿線，但不結扎。CST-H組和CST-L組大鼠腹膜內分別注射皮質抑素175.0 mg/(kg·d)和87.5 mg/(kg·d) ，假手術組和模型組大鼠腹膜內注射等量生理鹽水，持續(xù)給藥1周。

1.3 超聲心動圖 1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，通過二維M型和B型超聲心動圖評估左心室功能，監(jiān)測左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期內徑(LVESD)、左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESV)、射血分數(EF)、收縮分數(FS)。

1.4 血流動力學測量 超聲心動圖檢查后，進行血流動力學測量以評估左心室(LV)功能。 使用PowerLab ML880系統(tǒng)記錄平均血壓(MBP)、左心室壓力的最大升高速率(+dp/dtmax)和左室壓力的最大降低速率(-dp/dtmax)。

1.5 蘇木素-伊紅(HE) 染色 戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，取出心臟，用4%多聚甲醛固定左心室組織72 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明。石蠟包埋、切片。石蠟切片常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水，蘇木素染色10 min，0.7%鹽酸乙醇分化數秒，流水洗滌后，伊紅液浸染3 min。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。切片于光學顯微鏡下觀察分析。

1.6 ROS、超氧化物歧化酶(SOD)和MDA檢測 ROS檢測：大鼠持續(xù)給藥1周后，取出心臟。剪碎心臟后，0.25%胰酶消化心臟組織，1 000 r/min離心5 min，棄上清。含20%胎牛血清(FBS)的DMEM終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入新鮮含20%FBS的DMEM，靜置10 min后，離心棄上清。含20%FBS的DMEM重懸細胞，過100目篩網，離心棄上清。2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)重懸細胞，調整細胞密度至5×106個/mL。根據ROS測定試劑盒說明書檢測組織ROS含量。

SOD和MDA的檢測：大鼠持續(xù)給藥1周后，收集大鼠腹主動脈血液樣本，3 000 r/min離心10 min，收集血清，根據T-SOD測試盒和MDA測定試劑盒說明書，檢測大鼠血清中SOD和MDA含量。

1.7 TUNEL染色 按照方法1.5進行心臟取材及石蠟切片制備。心肌石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后，3%過氧化氫(H2O2)浸洗10 min，加入蛋白酶K工作液，37 ℃反應20 min，PBS漂洗后，滴加TUNEL反應混合液，濕盒中37 ℃孵育1 h。PBS漂洗，加入轉化劑，濕盒中37 ℃孵育20 min。PBS漂洗，3，3′-二氨基聯苯胺(DAB)顯色。中性樹膠封片。切片于光學顯微鏡下進行觀察分析。

1.8 蛋白質印跡(Western Blot)法 戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，取出心臟，把心臟組織剪切成細小的碎片，RIPA裂解液裂解組織，離心取上清，BCA法測定蛋白濃度。取20 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，隨后轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。10%脫脂奶粉封閉，隨后加入Bcl-2(1∶2 000)抗體、Bax(1∶2 000)抗體、p-MKK6(1∶5 000)抗體、MKK6(1∶3 000)抗體、p-p38 MAPK(1∶2 500)抗體、p38 MAPK(1∶2 500)抗體和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)(1∶5 000)抗體，4 ℃條件下過夜孵育。加入辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h后，滴加BeyoECL Star工作液到膜上，化學發(fā)光成像儀檢測。

2 結 果

2.1 皮質抑素對HF-AMI大鼠心功能及血流動力學的影響 超聲心動圖檢測各組大鼠心功能，結果見圖1A。與假手術組相比，模型組大鼠LVEDD和LVESD明顯升高(P<0.05)，EF和FS明顯降低(P<0.05)，MBP、+dp/dtmax和-dp/dtmax值明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，CST-H組和CST-L組大鼠LVESD明顯降低(P<0.05)，EF和FS明顯升高(P<0.05)，MBP、+dp/dtmax和-dp/dtmax值明顯升高(P<0.05)，其中CST-H組大鼠變化更為顯著。詳見圖1B、圖1C。

注：1 mmHg=0.133 kPa；與假手術組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.2 皮質抑素對HF-AMI大鼠心肌病理組織學變化的影響 HE染色結果顯示，假手術組大鼠心肌排列整齊，無明顯炎性細胞浸潤，模型組大鼠心肌排列紊亂，心肌組織大面積壞死并伴有炎性細胞浸潤；與模型組相比，CST-H組和CST-L組大鼠心肌排列趨于整齊，其中CST-H組大鼠變化更明顯。詳見圖2。

圖2 各組HF-AMI大鼠心肌病理組織學變化(×400)

2.3 皮質抑素對HF-AMI大鼠ROS、SOD和MDA水平的影響 ELISA檢測結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠MDA和ROS含量明顯升高(P<0.05)，SOD含量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，CST-H組和CST-L組MDA和ROS含量明顯降低(P<0.05)，SOD含量明顯升高(P<0.05)，其中，CST-H組變化更明顯。詳見圖3。

與假手術組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.4 皮質抑素抑制HF-AMI大鼠心肌細胞凋亡 TUNEL染色和Western Blot實驗結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠心肌細胞凋亡率和Bax蛋白表達明顯升高(P<0.05)，Bcl-2表達明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，CST-H組和CST-L組大鼠心肌細胞凋亡率和Bax蛋白表達明顯降低(P<0.05)，Bcl-2表達明顯升高(P<0.05)，其中CST-H組大鼠變化更明顯。詳見圖4。

與假手術組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

2.5 皮質抑素可抑制HF-AMI大鼠p38 MAPK通路 Western Blot結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠p-MKK6/MKK6和p-p38 MAPK/p38 MAPK表達明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，CST-H組和CST-L組大鼠p-MKK6/MKK6和p-p38 MAPK/p38 MAPK表達明顯降低(P<0.05)，其中CST-H組變化更明顯。詳見圖5。

與假手術組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討 論

HF-AMI是一種全身性疾病。挪威心血管病項目的數據顯示，2001年—2009年共有86 771例首次AMI病人，其中18.7%的病人在住院期間出現或發(fā)生心力衰竭，心力衰竭的發(fā)生率隨年齡增長而增加[9]。研究表明，細胞凋亡在AMI后的心功能不全和結構改變中起重要作用，并參與左室重構和心功能不全的發(fā)展過程，直至出現癥狀性心力衰竭[10]。因此，抗凋亡被認為是一種改善心力衰竭的可能方式。近年來，生物活性肽在預防和治療心血管疾病方面引起了越來越多的關注。內皮抑素作為一種小分子生物活性肽，具有調節(jié)睡眠與學習記憶、誘導免疫耐受、抑制炎癥反應、調節(jié)內分泌代謝等多種生物學效應。此外，內皮抑素在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[4]。因此，本研究旨在探究內皮抑素對HF-AMI的作用及對心肌細胞凋亡的影響，以期為明確內皮抑素在HF-AMI的作用機制及開發(fā)新的治療藥物提供理論依據。

有研究在探究內皮抑素與主動脈鈣化的關系及其機制時發(fā)現，內皮抑素可能通過糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和蛋白激酶C(PKC)信號通路抑制血管平滑肌細胞鈣化和大鼠動脈鈣化[11]。有證據顯示，外源性內皮抑素通過抑制內質網應激和心肌細胞凋亡，改善大鼠急性心肌梗死后心功能，具有明顯的心肌保護作用[12]。內皮抑素可抑制環(huán)孢素誘導的大鼠心肌細胞凋亡，從而發(fā)揮對心肌細胞的保護作用[13]。另有研究表明，內皮抑素可抑制腹主動脈瘤小鼠的ROS水平[5]。本研究顯示，內皮抑素可改善HF-AMI大鼠心功能和血流動力學障礙，改善心肌組織病理學變化，抑制心肌細胞凋亡和氧化應激。

p38 MAPK通路參與心臟疾病的發(fā)生發(fā)展，研究表明，心肌肥厚大鼠p38 MAPK磷酸化水平與正常大鼠相比上調；環(huán)維黃楊星D通過抑制p38 MAPK磷酸化水平，減輕心肌肥厚大鼠左室肥厚，改善組織病理學、血流動力學和心功能[14]。銀杏葉提取物通過抑制p38 MAPK通路抑制心肌細胞凋亡和炎癥，減少AMI小鼠梗死面積[15]。近年來，研究表明，血管平滑肌細胞的增殖和遷移參與了動脈粥樣硬化、再狹窄和移植性血管病等血管疾病的發(fā)生發(fā)展[16]。內皮抑素通過抑制細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2、p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和ERK5信號通路在血管緊張素Ⅱ刺激的血管平滑肌細胞中發(fā)揮抗增殖和抗遷移作用[17]。以上研究結果說明，內皮抑素可能通過抑制p38 MAPK通路，在心血管疾病中發(fā)揮作用。本研究顯示，HF-AMI大鼠p38 MAPK磷酸化水平與正常大鼠相比明顯上調，而內皮抑素可下調HF-AMI大鼠p38 MAPK磷酸化水平，該結果表明內皮抑素通過抑制p38 MAPK通路活化在HF-AMI中發(fā)揮保護作用。

綜上所述，內皮抑素通過抑制p38 MAPK通路抑制HF-AMI大鼠氧化應激及細胞凋亡，從而在HF-AMI中發(fā)揮保護作用。本研究為探明內皮抑素在HF-AMI中的作用機制及開發(fā)新的HF-AMI治療藥物提供了新的科學依據。