病毒哪里藏
——核酸檢測金標(biāo)準(zhǔn)

高耿欣，陳建成

1南京大學(xué)新生書院安邦書院，南京 210023

2南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，南京 210023

2022年春，新冠疫情在國內(nèi)卷土重來。大學(xué)生小何通過與同學(xué)和醫(yī)護(hù)人員的交流，逐步了解了核酸檢測的原理，明白了核酸檢測被稱為新冠病毒檢測“金標(biāo)準(zhǔn)”的原因。

1 全民核酸

“小何，排隊的人好多呀，還要等多長時間才輪到我們采樣呀？”同學(xué)小智不停地向小何抱怨著。

小何往前看去，核酸檢測點前，人們排著長長的隊伍，緩慢地前進(jìn)。

來勢洶洶的疫情又一次爆發(fā)在小何所在的城市。為了應(yīng)對突然爆發(fā)的疫情，所有人被緊急通知前來接受核酸檢測。

“今天好熱，排隊等待核酸檢測真難受啊！難道核酸檢測的過程非常復(fù)雜嗎？不然為什么隊伍前進(jìn)的速度這么慢！”小何很是疑惑。

“整個檢測過程確實很復(fù)雜，不過我們參與完成的其實只是檢測最簡單的第一部分，麻煩的是實驗室檢測過程。”小智解釋道。

“啊，我不太了解呢。”小何撓撓頭，雖然接受過很多次核酸檢測，但是它的原理是什么，小何并不知道。

還沒來得及向小智請教，隊伍前面一陣熙熙攘攘的聲音引起了小何的注意。

“小伙子啊，我這個確實不會用，不能做核酸檢測嗎？”排在前面的一個老人著急地向醫(yī)護(hù)人員問道。

“老人家，核酸檢測得提前預(yù)約啊，您找人幫您預(yù)約一下，再來檢測，好嗎？”

原來是一位老人家不會使用智能手機(jī)，沒有提前在網(wǎng)上進(jìn)行預(yù)約，所以被醫(yī)護(hù)人員攔了下來。

“小何你看，在網(wǎng)上提前預(yù)約，再到采樣點進(jìn)行采樣，這樣的流程對我們而言很簡單，但是對于那些不會上網(wǎng)的老人家來說，是非常不方便的?！毙≈歉袊@道。

“為什么不上門檢測？就是醫(yī)護(hù)人員到家里來采樣？這樣我們就不用冒著這么熱的天來參加了?！?/p>

“沒有你想的那么簡單。我們的城市有這么多人口，而醫(yī)護(hù)人員和志愿者的數(shù)量是十分有限的，都采取上門采樣不現(xiàn)實。更何況，在這次緊急的疫情中，時間就是生命，上門檢測效率太低，沒法達(dá)到時效性?！?/p>

“可是你看我們在這里排隊，等待時間長不說，人員也非常聚集，萬一有病毒感染者，不是非常危險嗎？”小何問道。

“這確實是避免不了的問題，大規(guī)模的集中核酸檢測效率高，但是難免導(dǎo)致人員聚集，帶來感染的風(fēng)險，所以我們必須戴好口罩，站在‘一米線’外，盡量做好防護(hù)！”

“好了，到我們了，先采樣吧?！?/p>

2 核酸檢測——金標(biāo)準(zhǔn)

“搞定！明天應(yīng)該可以在手機(jī)上查詢到檢測的結(jié)果?！?/p>

“剛剛你說了，疫情中時間就是生命，那這段時間的等待在疫情中其實還蠻長的！”小何感嘆道。

完成了核酸采樣，回寢室的路上，回想剛剛接受核酸采樣的經(jīng)歷，小何做了許多思考。核酸檢測其實有許多不便之處：網(wǎng)上預(yù)約不方便；排隊非常消耗時間；集中采樣有較高的感染風(fēng)險；得到結(jié)果的時間較長。但人們都說，核酸檢測是檢測新冠病毒的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

除了小智說的集中大規(guī)模采樣效率高，核酸檢測還有哪些特點，使其成為了病毒檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”？

“小智，你能給我講講核酸檢測的原理嗎？”

“好呀！其實我們參與的只是核酸檢測的第一步：采樣。

醫(yī)護(hù)人員用咽拭子在我們喉嚨里擦拭，其實是在采取呼吸道上皮細(xì)胞樣本。這是因為新冠病毒可以存活在我們的呼吸道細(xì)胞中。還有一種拭子是從鼻咽取樣，叫作鼻拭子。”

“可是那一點點的樣品怎么能檢測出有沒有感染病毒呢？”小何想到醫(yī)護(hù)人員只采了那么一點點樣品，不禁擔(dān)心道。

“不用擔(dān)心，要想解釋這個問題，就必須提到樣品檢測的具體過程。目前檢測新冠病毒常用的是一種名為RT-PCR實時熒光法的基因檢測方法。

大體上來說，這是一種嘗試精確復(fù)制基因并判斷目的基因是否存在的技術(shù)。醫(yī)護(hù)人員采集到的樣品首先需要在實驗室中純化提取，得到核酸。如果被測樣品含有病毒，那么病毒的核酸就可以被擴(kuò)增并通過實時熒光法檢測到。

了解這個方法的具體操作之前，我們得先知道RT，PCR和實時熒光分別是什么。

RT是Reverse Transcription的簡稱，即反轉(zhuǎn)錄。由于新冠病毒是RNA單鏈病毒，想要大量擴(kuò)增其核酸，首先需要在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈結(jié)構(gòu)的cDNA。cDNA的兩條單鏈符合核苷酸的堿基互補(bǔ)配對原則，在氫鍵的連接下形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。

PCR是Polymerase Chain Reaction的簡稱，即DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是擴(kuò)增基因的主要過程。在反應(yīng)體系中，核苷酸原料在聚合酶的催化和引物的引導(dǎo)下，利用堿基互補(bǔ)配對原則與模板基因配對產(chǎn)生大量副本。如果把某段基因的擴(kuò)增比作復(fù)印一本書中的某一部分內(nèi)容，PCR反應(yīng)就是在復(fù)印機(jī)上復(fù)印的過程。需要擴(kuò)增的目的基因序列就是一本書；DNA聚合酶就像是復(fù)印機(jī)的打印噴頭，復(fù)印得到的內(nèi)容從聚合酶產(chǎn)出；游離的各種核苷酸像是復(fù)印所需要的各種顏色的墨水，是這個擴(kuò)增反應(yīng)的原料；根據(jù)特定目的基因序列設(shè)計出的正向引物和反向引物就像是用來標(biāo)記復(fù)印起點和終點的書簽，限制著復(fù)印的范圍。

熒光探針，本質(zhì)上是一小段可以和目的基因互補(bǔ)配對結(jié)合的基因序列，它應(yīng)位于正向引物和反向引物之間。在這一小段的基因序列兩端，分別含有一個熒光信號源和信號淬滅劑。在特定光照下，熒光信號源會發(fā)出相應(yīng)的熒光信號；而如果它的附近有信號淬滅劑，那么熒光就會被吸收。這種熒光淬滅機(jī)制使得這個探針在保持完整的時候是不會發(fā)出熒光信號的。一旦熒光信號源處于游離狀態(tài)，它發(fā)出的熒光就可以被檢測到[3]?！?/p>

聽過小智的簡單介紹，小何似乎更加困惑了。

“那我們不妨用具體的反應(yīng)過程來說明，”小智看出了小何的困惑。

“假設(shè)被測的樣品是含有病毒的。

首先是反轉(zhuǎn)錄過程。在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，樣品中的病毒RNA轉(zhuǎn)化成為雙鏈的cDNA。

然后是PCR反應(yīng)過程。PCR總共分為三個步驟[1,2]。

第一步，變性。被送入PCR反應(yīng)體系的cDNA在95 °C的高溫下斷開成為兩條單鏈，使得核酸的堿基可以暴露出來。

第二步，退火。這個過程中，溫度降低到55 °C左右。針對目的基因設(shè)計的引物可以連接到病毒的單鏈DNA上。與此同時，“探針書簽”——熒光探針也會結(jié)合到目標(biāo)基因序列的相應(yīng)互補(bǔ)位置上。引物就像是一個書簽，標(biāo)記了在PCR過程中目的基因的位置，確定了復(fù)制的范圍。病毒核酸的復(fù)制過程在正向引物結(jié)合的地方正向開始，在反向引物結(jié)合的地方反向開始，于是復(fù)制被限制在這兩端引物之間。這樣復(fù)制出的部分就是我們需要的目的基因片段。

可能你會疑惑，我們?yōu)槭裁匆O(shè)計引物來限制復(fù)制的片段呢？直接把整條核酸全部復(fù)制下來不可以嗎？其實設(shè)計引物的目的有以下兩點：第一，引物是DNA聚合酶結(jié)合的位置，所以沒有引物反應(yīng)是沒法發(fā)生的；第二，正向反向兩種引物的限制可以節(jié)約反應(yīng)原料。

第三步，延伸。反應(yīng)溫度再次被升高到72 °C左右，激活體系中的DNA聚合酶。聚合酶分別從正向引物和反向引物處開始不斷接入核苷酸，延伸新的核酸鏈。而在延伸的過程中，觸碰到兩個引物之間的熒光探針，導(dǎo)致熒光信號源游離出來，淬滅機(jī)制被破壞，使得熒光可以顯現(xiàn)。

PCR不斷重復(fù)變性、退火、延伸的過程。本來極少量的病毒核酸會在一次一次的循環(huán)中以指數(shù)形式實現(xiàn)數(shù)量的增長。這個過程正如圖1所示。”

圖1 PCR反應(yīng)原理圖

“哦，我明白了！原來PCR反應(yīng)中，病毒核酸的數(shù)量是指數(shù)爆炸式的增長??！那么只需要一點點樣本，就可以反應(yīng)得到很多很多的一模一樣的核酸了！”小何恍然大悟。

“你說的沒錯，也正是因為核酸在數(shù)量上呈現(xiàn)指數(shù)增長，我們才可以通過熒光強(qiáng)度的增長來判斷是否含有目的基因。

如果被檢測的樣本是含有病毒核酸的，每經(jīng)歷一次循環(huán)，被檢測的目的基因就會擴(kuò)增一倍，接入目的基因的熒光探針和釋放的熒光源也會增加一倍，直到反應(yīng)結(jié)束。當(dāng)然，隨著原料的消耗，反應(yīng)也會趨于停止，所以目的基因的數(shù)量和熒光強(qiáng)度會呈現(xiàn)S型增長。那么如果檢測到了熒光也就代表檢測到了病毒基因，所以結(jié)果就稱為陽性。

如果被檢測的樣本不含病毒核酸，那么在PCR反應(yīng)過程中就沒有目的基因被擴(kuò)增，熒光探針也無法結(jié)合，其淬滅機(jī)制仍然存在，就不會檢測到熒光。”小智進(jìn)一步解釋道。

“那我們檢測的目的基因到底有哪些呀？”

“目前我們檢測的主要是新冠病毒特殊的N基因和ORF (open reading frame) 1ab基因，引物和熒光探針也是根據(jù)這兩個基因的序列設(shè)計的。中國最早發(fā)布的冠狀病毒全基因組序列幫助科學(xué)家們迅速確認(rèn)了兩種目的基因。”

“精確的病毒遺傳信息，巧妙的復(fù)制過程，可靠的熒光檢測法，這些都保證了核酸檢測的準(zhǔn)確性，難怪我們稱核酸檢測為金標(biāo)準(zhǔn)！”

3 單采，混采和混檢

過了幾天，疫情形勢依然嚴(yán)峻，按照學(xué)校要求，小何和小智參與了第二輪核酸篩查。

一樣的網(wǎng)上預(yù)約，一樣的排隊。

每一次篩查的范圍都是全民的，那么要采集的樣本數(shù)量也是巨大的。如果對每一個樣品都要單獨進(jìn)行擴(kuò)增的話，那豈不是要很多很多的PCR儀器？小何一邊排著隊，一邊思考著。

采樣時，小何注意到了一個奇怪的現(xiàn)象：醫(yī)護(hù)人員并沒有單獨存放每一個人采樣的咽拭子，而是把多個咽拭子放在一個試管里。為什么這么做[1,2]？

“護(hù)士姐姐您好，請問為什么把不同人的咽拭子放在一個試管里呀？這樣不會互相污染嗎？”

“同學(xué)你好，這是因為我們采用的是混合采樣呀。”

“混合采樣？就是把好幾個人的樣品混合到一起嗎？可是這樣，結(jié)果的準(zhǔn)確性還能保證嗎？”小何坐不住了。

“你的懷疑是有道理的，我來給你解釋吧?！毙≈且话牙^做完采樣的小何。

“其實混合采樣是充分權(quán)衡準(zhǔn)確性和檢測效率的結(jié)果，這其中蘊含著非常巧妙的數(shù)學(xué)原理?；旌喜蓸硬⒉皇前央S意數(shù)量的樣本放在一起拿去檢測?！?/p>

“我們要檢測的樣本那么多，如果每個人都用一個試管收集樣本，每個樣本都需要單獨檢測，那得需要多少檢測設(shè)備和時間??！

你想一想，其實接受檢測的大部分人都沒有感染新冠病毒，所以大部分人的檢測結(jié)果其實都是陰性。這就為混合采樣提供了可能?！毙≈窍蛐『谓忉尩馈?/p>

“哦！所以把多人的樣品放在一起，如果這個試管的樣品都沒有檢測出陽性，就可以說明這些人都是未感染的！畢竟在感染率較低的地區(qū)，即使樣品混合在一起，最終的檢測結(jié)果為陰性才是大概率事件！”小何恍然大悟。

“是這樣的，用混采的方式采集樣本，不僅節(jié)約了大量的試管，也節(jié)約了時間，尤其對于這樣的大范圍篩查。我們必須要考慮到效率和成本??！此外，混合采樣不僅方便了采樣過程，也極大地方便了實驗室的檢測過程。”小智說道。

“可是如果發(fā)現(xiàn)陽性了呢？我們沒法確定混合樣品的提供者中，到底誰是感染者?！毙『渭?xì)細(xì)一想，又發(fā)現(xiàn)了問題。

“如果這個混采樣品的反應(yīng)結(jié)果是陽性，那么混合采樣的這一組人都有可能是病毒感染者，所以必須再次單獨地對這幾個人進(jìn)行檢測，最后確定病毒的感染者?！?/p>

“那么確定混合的人數(shù)就顯得非常重要！如果混合比例過高，極容易因為一個陽性就要讓許多人都要再檢測一次，反而浪費時間和原料?！毙『伟l(fā)現(xiàn)了混采的關(guān)鍵。

“你說的沒錯，混合的比例和多個因素相關(guān)。簡單來說，如果被檢測的人群中感染率很高，那我們就應(yīng)該適當(dāng)降低混合比例；如果感染率不高，就可以提高混合的比例。事實上，我們有一套完整的數(shù)學(xué)模型來計算混合的比例。”小智詳細(xì)地向小何解釋道。

“全民的核酸篩查是大規(guī)模、大范圍的檢測，如何保證高效率同時盡可能節(jié)約人力物力檢測，確實是一門學(xué)問??！”小何感嘆道。

4 抗原試劑盒

嚴(yán)峻的疫情形勢下，小何的大學(xué)進(jìn)行了封校封樓的疫情管控措施。聚集采樣確實會帶來不小的感染風(fēng)險。那有沒有不用核酸采樣，一個人在隔離期間可以自行完成的檢測方法呢？

學(xué)校為同學(xué)們提供了一種更加方便快速的檢測方法——抗原試劑盒。

“小智，你覺得抗原試劑盒可以做到核酸檢測那樣準(zhǔn)確嗎？”小何看著手中的試劑盒問道。

“你知道，病毒是由外層的蛋白質(zhì)外殼和內(nèi)層的核酸遺傳物質(zhì)組成的，如果說核酸檢測中檢測的是病毒的內(nèi)核，那么抗原檢測就是檢測病毒的外衣。

抗原自測的原理是抗原和抗體的結(jié)合?？乖涂贵w就像是一個榫頭一個卯。抗原是病毒的外衣，有特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)?？乖瓩z測中，鼻拭子上會被放置一些專門的抗體，如果被檢測的樣本是帶有病毒的，那病毒的抗原就會和拭子上的抗體結(jié)合，發(fā)生反應(yīng)，從而被我們觀察到。

但是，蛋白質(zhì)沒法像核酸那樣通過PCR技術(shù)擴(kuò)增，所以如果病毒量不大，抗原檢測就很難準(zhǔn)確檢測。所以，抗原檢測是肯定不能代替核酸檢測的[2]！”

“但是抗原檢測確實非常方便快捷，自己在家就可以完成測試，雖然不像核酸檢測那么準(zhǔn)確，但是也有它發(fā)揮用處的地方，比如我們這些封樓隔離的人，等待結(jié)果的時間也大大縮短了?！闭f著，小何和小智都笑了。

然而，抗原自測的準(zhǔn)確性和個人操作的規(guī)范性是否達(dá)標(biāo)有很大關(guān)系。倘若自測人員的操作不夠規(guī)范，也會影響到采集到的樣品和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

5 結(jié)語

總之，無論核酸檢測還是抗原檢測，都是利用現(xiàn)有方法檢測新冠病毒的特異性成分。不同之處在于，檢測核酸的過程中，我們可以利用生物化學(xué)的方法把采集到的少量樣本，通過擴(kuò)增反應(yīng)得到大量副本，從而提高檢測精度；而對于抗原自測，當(dāng)病毒量較少以及自測操作不夠準(zhǔn)確規(guī)范時，其可靠性會大大下降。

新冠疫情來勢洶洶，對于新冠病毒的檢測我們目前有多種可行的方法，可以在不同的需求和情境下，各取所長。但是，核酸檢測依然是新冠病毒檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。