生防菌Bacillus subtilis DNKAS全基因組測序及生物膜形成相關(guān)基因分析

王 騫，包慧芳，丁榮榮，史應武，楊紅梅，楚 敏，王 寧*

（1.新疆維吾爾自治區(qū)土壤肥料工作站，烏魯木齊 830006；2.新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點實驗室，烏魯木齊 830091；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第七師農(nóng)業(yè)科學研究所，新疆 奎屯 833200）

引言

生物防治是在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中形成的一種科學治理方式，微生物源生物農(nóng)藥是防治作物病蟲草害行之有效的方法之一?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subiltis）具有繁殖快、所需營養(yǎng)簡單，耐受性強等優(yōu)點，同時，其易于形成芽孢的特點在生產(chǎn)過程中利于生防菌劑的制備、劑型加工及保存[1]。因此，作為生物農(nóng)藥的重要資源，受到越來越多的關(guān)注與開發(fā)。隨著分子測序技術(shù)的發(fā)展，明確菌株基因組序列信息對揭示其生防潛力具有重要意義?？莶菅挎邨U菌可通過營養(yǎng)競爭、分泌抗菌物質(zhì)、誘導抗性等機制發(fā)揮生防作用，但能否在作物根際有效定殖是其發(fā)揮作用的首要條件，通常生防菌群體定殖數(shù)量高低與其防效好壞呈正相關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，生防細菌在植物根際土壤中主要以生物膜的形態(tài)附著在土壤粒子表面或植物根系表面。生物膜的形成可增強微生物對外界環(huán)境的耐受性，使細菌群體數(shù)量以群聚的形式維持在較高水平，利于有效占據(jù)保護植物根系的侵染位點，達到保障營養(yǎng)競爭和空間競爭的群體數(shù)量，同時還和其它生防機制協(xié)同作用，降低病蟲草害的發(fā)生，最終達到促進植物健康生長的目的[3]。所以，生防細菌生物膜形成的研究將為生防菌株的遺傳改良及其合理使用提供科學依據(jù)和遺傳信息。瓜列當又稱分枝列當（Orobanche acgyptiaca Pers.），是列當科一年生全寄生性植物，對新疆甜瓜、番茄、辣椒等經(jīng)濟作物危害嚴重。本研究前期對一株源自新疆番茄田的枯草芽孢桿菌DNKAS進行抗瓜列當?shù)姆佬炞C，小區(qū)實驗表明菌劑添加量為3.2 kg/畝時，防治效果可達52.33%，番茄增產(chǎn)56.48%[4]。本研究主要從基因組信息角度揭示DNKAS菌株的生防機理。本實驗利用全基因組測序技術(shù)對菌株DNKAS基因組進行功能注釋與比較基因組分析，獲得該菌株基因組基本特征。重點比對分析該菌株群體感應與生物膜形成相關(guān)基因的組成和差異，為深入研究其定殖特性，揭示其防控瓜列當草害的防效作用機制積累了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌DNKAS（B.subtilis DNKAS），由新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所保藏，分離自新疆加工番茄農(nóng)田。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種保存、活化及擴增培養(yǎng)基均為營養(yǎng)肉湯（NB）和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA），購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試劑與試劑盒

細菌基因組DNA提取試劑盒（Tiangen）、DL2000（Takara）、瓊脂糖（Takara）、50×TAE buffer（Takara）和GelGreen核酸染料（Biotium），用于DNKAS菌株基因組DNA提取和檢測。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取與檢測

菌株活化后無菌接種于NB培養(yǎng)基中，在37℃、180 r/min條件下培養(yǎng)16 h，將發(fā)酵液8 000 g離心10 min收集菌體，使用基因組提取試劑盒提取DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA樣品的濃度和降解程度，NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測樣品純凈度。

1.2.2 基因組測序與基因功能注釋

將檢測合格的基因組DNA委托青島華大基因研究院運用BGISEQ-50平臺測序，SOAPdenovo組裝軟件對reads數(shù)據(jù)進行組裝，得到的scaffold序列使用BLAST軟件與KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）、GO（Gene Ontology）、NR（Non-Redundant Protein Database）、COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）、SwissProt（UniProtKB/Swiss-Prot）、NOG(evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups)等6個數(shù)據(jù)庫進行序列比對分析，完成基因功能注釋[5]。

1.2.3 同源基因組學分析

基于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)完成全基因組序列比對，找出與DNKAS序列相似度99%以上的菌株信息。將DNKAS菌株基因組序列與相關(guān)參考菌進行比較分析，統(tǒng)計其同源基因基本特征。運用OrthoMCL軟件，選擇perl腳本分析特有和共有基因，單拷貝直系同源基因運用single-copy orthologs進行鑒定。系統(tǒng)進化樹利用TreeBeST軟件構(gòu)建[6]，設(shè)置自展1 000次的置信值，5%的序列差異。

1.2.4菌株生物膜形成相關(guān)基因分析

根據(jù)全基因組進化分析結(jié)果，選取與DNKAS菌株親緣關(guān)系最近的8株B.subtilis與相對較遠的1株B.thuringiensis。使用Diamond(v0.8.23.85)軟件[7]與KEGG(v87)[8]數(shù)據(jù)庫比對，確定生物被膜相關(guān)的基因，并根據(jù)基因信息確定其位置信息。通過blast比對查看生物被膜基因序列同源性，與選取的參考菌株的相應蛋白序列基因進行比對和同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組數(shù)據(jù)組裝與基因預測

測序得到的DNKAS菌株原始reads數(shù)據(jù)進行質(zhì)控、質(zhì)量評估和組裝后共得到24個基因組重疊群(contig)，基因組總長度為4 248 244 bp，組成19個基因組框架(scaffold)，GC含量為43.42%。DNKAS基因組序列已經(jīng)提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得全基因組注冊號JABUOT000000000。DNKAS菌株基因組總長度為4 248 244 bp，預估可編碼4 359個基因，占全基因組的88.88%，編碼基因平均長度是866.19 bp，獲得序列中包括69個tRNA，4個rRNA和49個sRNA基因。含有串聯(lián)重復序列（TR序列）68個，其中微衛(wèi)星DNA（Microsatellite DNA）1個，小衛(wèi)星DNA（MinisatelliteDNA）47個。

2.2 枯草芽孢桿菌DNKAS功能注釋

采用本地BLASTP的方法對DNKAS進行COG功能注釋，在DNKAS基因組中共有3 796個基因被成功注釋。通過聚類分析，發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)功能主要集中在8個方面，包括：一般性功能預測基因（389個)、氨基酸代謝及轉(zhuǎn)運基因（328個）、碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝基因（327個）、轉(zhuǎn)錄基因（327個）、細胞壁/膜/包膜生物發(fā)生基因（242個）、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成基因（231個）、信號轉(zhuǎn)導機制基因（212個）、輔酶的運輸和代謝基因（199個）、無機離子的轉(zhuǎn)運和代謝基因（197個），各基因的功能注釋占COG數(shù)據(jù)庫功能注釋總基因數(shù)的百分比依次為10.2%、8.6%、8.6%、8.6%、6.4%、6.1%、5.6%、5.2%、5.2%、5.1%、4.6%。功能未知基因有239個，占比6.3%。氨基酸代謝及轉(zhuǎn)運、碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝占比較高，這可能說明該菌株可廣泛利用環(huán)境中營養(yǎng)，即環(huán)境適應性強，該特征是優(yōu)良生防菌具備的特征之一。

在KEGG數(shù)據(jù)庫中，枯草芽孢桿菌DNKAS共有2 775個基因得到功能注釋，可以分成30個亞分類圖，關(guān)于菌株膜運輸和碳水化合物代謝功能的基因得到較多的注釋。利用注釋的功能基因構(gòu)建代謝通路圖，最終獲得159個代謝通路。GO數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)共有5 793個基因得到功能注釋，主要注釋為生物過程、細胞成分和分子功能3部分，具體的注釋基因數(shù)量結(jié)果見圖1。NR即非冗余的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，經(jīng)過比對，在NR數(shù)據(jù)庫中DNKAS基因組有3 924個基因得到注釋。Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫主要對蛋白質(zhì)序列進行注釋，擁有較高的可靠性，DNKAS基因組中有3 924個基因的蛋白序列在該數(shù)據(jù)庫中得到功能注釋。

圖1 枯草芽孢桿菌DNKAS基因組GO功能分類

2.3 同源基因組分析

經(jīng)NCBI比對，與DNKAS全基因組序列同源性97%以上菌株有289株，高度相似即同源性99%以上菌株有8株，選取這8株菌與DNKAS進行同源性比較，ATCC10792為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis），為B.subtilis同屬不同種的菌株，是本研究選取的基因組外群，基本情況見表1。維恩圖（圖2）表明包括DNKAS在內(nèi)的9株枯草芽孢桿菌共有2 400個同源基因，其中同源基因家族數(shù)量為1 354個。依據(jù)這10個菌株全基因組同源基因分析數(shù)據(jù)，進行直系同源單拷貝基因多序列比對，基于TreeBeST軟件構(gòu)建進化樹（圖3），結(jié)果顯示9株B.subtilis與B.thuringiensis形成明顯分枝，DNKAS與NCD-2、UD1022遺傳距離更近，與ZD01、BSD-2、HJ5、BAB-1、SX01705、XF-1遺傳距離相對較遠。

表1 基因組基本情況

圖2 DNKAS菌株與其它芽孢桿菌的同源性比較

圖3 進化樹分析

2.4 基因功能注釋生物被膜相關(guān)基因比較

利用Diamond(v0.8.23.85)軟件將DNKAS菌株的蛋白序列在KEGG(v87)數(shù)據(jù)庫中進行比對，找到與生物被膜相關(guān)的基因，隨后根據(jù)基因信息找到重疊群的信息，DNKAS菌株生物膜形成相關(guān)基因的具體定位信息見表2，共有26個生物膜形成基因，行使20種功能，分布于7個contig中，其中38.5%的基因位于contig27中，19.2%的基因位于contig24。選取XF-1、NCD-2這兩株與DNKAS遺傳距離存在差異的菌株基因組進行生物膜形成相關(guān)基因的同源性比較，兩兩比較結(jié)果與進化樹結(jié)果相似，即DNKAS的生物膜功能基因與NCD-2的基因同源性更高，見表3，只在PTS-Glc-EIIA，crr基因存在差異，NCD-2J菌株缺少DNKAS位于contig25的相同基因。

表2 DNKAS菌株生物膜形成相關(guān)基因

表3 菌株間生物膜形成基因的同源性比對

3 討 論

化學除草劑在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的高產(chǎn)豐收中起到十分重要的作用，但長期大劑量連續(xù)噴施產(chǎn)生了諸多問題。目前，利用微生物防除列當雜草的研究日益增多。已報道的具有防除列當潛能的微生物主要是列當病原菌、寄主植物共生菌或其他微生物，包括鐮刀菌[9]、根瘤菌[10]、假單胞菌[11]和叢枝菌根真菌[12]等。Nemat Alla等利用盆栽試驗證明尖孢鐮刀菌FoxyⅠ和FoxyⅡ的孢子懸浮液對鋸齒列當和分枝列當有顯著防效，將兩種菌的劑型加工為固態(tài)顆粒也有相同效果[13]。Mabrouk等試驗發(fā)現(xiàn)接種根瘤菌P.1236和P.SOM可顯著降低豌豆根部鋸齒列當?shù)拿劝l(fā)率，增加列當塊莖的壞死率[14]。枯草芽胞桿菌（B.subtils）菌株DNKAS作為一種高效生防菌株，已完成列當防除的田間實驗。DNKAS菌株綠色環(huán)保，對人畜無毒無害，具有較高的生防潛力，有待進一步防效驗證。

本次參與比對的菌株多作為益生菌進行過報道。UD1022是美國特拉華大學報道的一株根際促生細菌[15]，NCD-2、BAB-1、BSD-2、XF-1為河北農(nóng)林科學院、河北工業(yè)大學、云南農(nóng)業(yè)大學研發(fā)的生防菌，主要用于棉花黃萎病、番茄灰霉病、十字花科根腫病等的防治[16-19]。與DNKAS全基因組進化分析親緣關(guān)系最近的NCD-2、UD1022均是定殖能力強的菌株，因此DNKAS可有效發(fā)揮生防作用，推測也與其易于定殖有關(guān)。通過基因組基本特征的統(tǒng)計，DNKAS菌株編碼4 217個基因，數(shù)目最多，通過后續(xù)基因注釋可繼續(xù)深入挖掘其生防機理。

對生防微生物全基因組序列進行比較和同源基因分析是獲取其功能相關(guān)核心基因的常用方法。高圣風將胡椒瘟病生防菌B.subtilsVD18R19與B.Subtilis 168、B.subtilisW23、B.velezensisFZB42進行比較分析，發(fā)現(xiàn)4個菌株共有基因2 745個，特有基因1 055。生防菌VD18R19的特有基因為397個，含有6個抑菌代謝產(chǎn)物編碼基因簇，與模式菌株168具有極高的同源性[20]。王曉宇在對B.subtils BS-916的全基因組測序分析發(fā)現(xiàn)，與其它已測序全基因組芽孢桿菌相比，其GC含量最高，達到46.4%，含有多種典型的抗菌物質(zhì)編碼基因簇[21]。隨著測序菌株數(shù)量及測序深度的不斷提高，獲得的基因資源在不斷積累，從菌株共有基因中獲取的關(guān)鍵基因數(shù)量也在不斷增多，通過同源基因比較可深入挖掘與生物性狀相關(guān)的關(guān)鍵基因位點。

生物膜是細菌生長過程中為適應周圍環(huán)境，而分泌的胞外聚合物，具有一定三維結(jié)構(gòu)，使微生物群體能附著于固體或生物表面[22]。oxyR是細菌抗氧化系統(tǒng)OxyR調(diào)節(jié)蛋白的編碼基因，oxyR調(diào)節(jié)子可抑制細菌外膜蛋白相變，增強菌株抗逆性。SinR是Spo0A-P的主要調(diào)節(jié)子編碼基因，受其調(diào)控的Spo0A基因起到中央轉(zhuǎn)錄監(jiān)管作用，控制著包括生物膜基質(zhì)所必需的基因表達在內(nèi)的100多個基因的表達。SlrR基因表達水平的高低調(diào)控SlrR-SinR開關(guān)，介導抑制自溶素產(chǎn)生，決定著維持生物膜中細胞鏈結(jié)構(gòu)的完整性。DNKAS菌株的這些基因與NCD-2相似性一致，二者僅在PTS-Glc-EIIA蛋白組分存在差異，DNKAS菌株具有2個，而NCD-2只有1個該基因。PTS-Glc-EIIA是由crr基因編碼的PTS系統(tǒng)葡萄糖特異性EIIA組分，是依賴于磷酸烯醇丙酮酸的糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，與糖類物質(zhì)在細胞膜上的轉(zhuǎn)運攝入有關(guān)，因此菌株間對碳水化合物的轉(zhuǎn)運能力可能存在差異。

4 結(jié) 論

定殖能力是芽孢桿菌發(fā)揮其生防功能的重要前提，對其生物膜形成分子機制的解讀是研究生防作用的關(guān)鍵所在，全基因組測序及比較基因組分析是實現(xiàn)這一目標的有力工具。本研究對菌株DNKAS進行全基因組測序和比較分析，為枯草芽孢桿菌的功能基因組學研究提供了參考數(shù)據(jù)，為深入研究其定殖特性和作用機制，以更有效地開發(fā)和應用芽孢桿菌除草劑提供依據(jù)。