碳酸鈣納米粒子用于靶向光動力治療胰腺癌的實驗研究

郭坤雄 王志華 郭嬋娟 范應方

南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院肝膽一科（廣州 510280）

胰腺癌是世界上最常見且致命的癌癥之一，總體5年生存率不足10%［1-2］。目前胰腺癌的臨床治療方法包括手術、化療、放療和靶向治療等療效欠佳，研究進展緩慢，未能有效改善胰腺癌患者的預后［3-4］。因此，亟需開發(fā)有效治療胰腺癌的新方法，以提高胰腺癌患者的遠期生存率。

近年來，光動力治療以其安全有效、創(chuàng)傷小等優(yōu)點，在腫瘤的治療中備受關注，有望為胰腺癌治療提供新的思路和方法［5］。在特定波長激發(fā)光的照射下，光敏劑通過氧氣生成活性氧，損傷癌細胞中線粒體等細胞器，導致癌細胞死亡［6-7］。光動力治療療效取決于癌細胞對光敏劑的攝?。?］，然而，既往研究表明單純光敏劑在胰腺癌中難以達到有效的治療劑量［9］。如何高效遞送光敏劑至腫瘤區(qū)域、增強腫瘤細胞對光敏劑的攝取是提高光動力治療療效的關鍵。隨著納米醫(yī)學的發(fā)展，納米遞藥系統成為提高藥物遞送效率、降低毒副作用、增強療效的重要手段［10］；而主動靶向型納米載體能將藥物靶向轉運到腫瘤細胞，最大程度提高藥物的抗腫瘤效果［11-12］。因此，利用主動靶向型納米粒子遞送光敏劑，增強腫瘤細胞對光敏劑的攝取，有望提高光動力治療療效。同時，腫瘤細胞溶酶體存在低pH 的特點，構建酸響應納米遞藥系統以提高光敏劑胞內釋放的特異性，也可進一步提高光動力治療療效。

本研究以胰腺癌細胞高表達的胰島素樣生長因子1 受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）為靶點，以二氫卟吩e6（chlorine e6，Ce6）為光敏劑，構建酸響應的主動靶向型碳酸鈣納米粒子Ce6/Lins@CaCO3-PEG（CLCP），通過體內外實驗觀察CLCP 光動力治療對胰腺癌的治療效果，并對其作用機制進行探索。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞 5 ～6 周齡的Balb/c 裸鼠和C57BL/6J 小鼠購自維通利華公司；人源性胰腺癌Bxpc-3 細胞株和C57 小鼠源性胰腺癌Pan-02 細胞株購自PerkinElmer 公司。

1.2 主要試劑及儀器 二水合氯化鈣（CaCl2·2H2O）購自Sigma-aldrich 公司；Ce6 購自Frontier 公司；碳酸氫銨（NH4HCO3）、膽固醇、二氯甲烷、無水乙醇、二甲基亞砜（DMSO）購自北京伊諾凱科技有限公司；Linsitinib、1，2-二油酰-sn-丙三基-3 磷酸鈉鹽（DOPA）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；1，2-二十六烷?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿（DPPC）購自北京謹明生物科技有限公司；1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基（聚乙二醇）-5000（DSPE-PEG-5000）購自上海芃碩生物科技有限公司。RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco 公司；CCK-8 試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Calcein-AM/PI 活/死細胞雙染試劑盒購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液購自北京索萊寶科技有限公司；流式細胞術抗體（anti-CD16/32，FITC-anti-CD3，PE-anti-CD4，APC-anti-CD8）購自BioLegend 公司。635nm激光器購自中山鼎碩光電科技有限公司；粒度和電位分析儀（Zetasizer Nano ZS）購自Malvern 公司；透射電子顯微鏡（JEOL-1011）購自JEOL 公司；酶標儀（VICTOR Nivo）購自PerkinElmer 公司；倒置熒光顯微鏡（DMIL Led）購自Leica 公司；流式細胞儀（FACS Canto Ⅱ）購自Becton，Dickinson and Company 公司。

1.3 Ce6@CaCO3-PEG 的合成 采用氣體擴散法合成Ce6@CaCO3。200 mg CaCl2·H2O、10 mg Ce6 溶于100 mL 無水乙醇。燒杯口用錫紙包封，留置多個小孔。燒杯與5 g NH4HCO3粉末共同放置在密閉箱中30 ℃下避光反應36 h，得到Ce6@CaCO3納米粒子。20 mg Ce6@CaCO3、4 mg DOPA 溶于5 mL無水乙醇，超聲反應20 min 得Ce6@CaCO3-DOPA。隨后加入2 mL 二氯甲烷、16 mg DPPC、8 mg 膽固醇、32 mg DSPE-PEG-5000 攪拌反應過夜。真空旋蒸后PBS 超聲振蕩重懸，得到Ce6@CaCO3-PEG 納米粒子。

1.4 Ce6@CaCO3-PEG 表面裝載Linsitinib 5 mg Ce6@CaCO3-PEG、1 mg Linsitinib 溶于2 mL PBS 溶液，室溫攪拌24 h。100 kDa 超濾管離心過濾即可得到Ce6/Lins@CaCO3-PEG 納米粒子。

1.5 納米粒子CLCP 的理化表征驗證 將CLCP稀釋成0.01 ～0.05 mg/mL 的溶液，振蕩分散5 min后，分別通過粒度和電位分析儀、透射電子顯微鏡進行水合粒徑、形貌像分析。CLCP 分別于pH=7.4和pH = 6.5 的緩沖溶液孵育4 h 后，隨后制樣并于透射電子顯微鏡下拍攝樣品形貌像。

1.6 細胞培養(yǎng) Bxpc-3 和Pan-02 細胞株采用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RMPI-1640培養(yǎng)基，于恒溫37 ℃、含5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.7 Bxpc-3 細胞對納米粒子的攝取實驗 將Bxpc-3 細胞以2 × 105個/孔種植到共聚焦皿培養(yǎng)24 h后，分別與50 μg/mL CCP 或CLCP 納米粒子共培養(yǎng)24 h。隨后棄去培養(yǎng)基，每孔加入1 mL DAPI 染色工作液孵育20 min，PBS 洗滌后共聚焦顯微鏡下觀察DAPI 和Ce6 熒光信號并拍照。

1.8 CCK-8 法檢測納米粒子的體外光動力治療效果 將Bxpc-3 細胞以1×104個/孔種植到96 孔板培養(yǎng)24 h 后，分別與0、3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL CCP 和CLCP 納米粒子共培養(yǎng)24 h，在635 nm 激光下照射，功率為0.1 W/cm2，照射時間為5 min。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，棄去舊培養(yǎng)基，加入100 μL 含10%CCK-8 溶液的完全培養(yǎng)基，用酶標儀讀取450 nm處吸光度。

1.9 活死細胞染色 處理基本同上，根據處理不同分為對照組、激光（PBS + L）組、非靶向治療（CCP + L）組和靶向治療（CLCP + L）組。在激光照射24 h 后，棄去培養(yǎng)基，加入Calcein-AM 和PI 工作液染色30 min后，在熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.10 Bxpc-3 原位胰腺癌及Pan-02 胰腺癌皮下移植瘤模型構建 取Bxpc-3 細胞和Balb/c 裸鼠用于構建原位胰腺癌模型。通過消化、離心、洗滌收集Bxpc-3 細胞沉淀，與PBS 溶液、基質膠溶液以1∶1∶1 的比例混勻配置細胞懸液。手術暴露小鼠胰腺組織，抽取50 μL 細胞懸液注射進胰腺組織中。用小動物活體成像設備進行腫瘤自發(fā)光成像，將成功建模的小鼠進行后續(xù)實驗。

取Pan-02 細胞和C57 小黑鼠用于皮下腫瘤模型構建。Pan-02 細胞懸液配置同上。將100 μL 細胞懸液注射到小鼠左側大腿根部。當腫瘤逐漸成形生長至100 mm3可進行后續(xù)實驗。

1.11 CLCP 光動力治療原位胰腺癌的療效觀察 將成功構建的原位胰腺癌模型裸鼠隨機分為對照組、PBS + L 組、CCP + L 組和CLCP + L 組。精密稱取少量的CCP 和CLCP 粉末，用PBS 溶解并稀釋為1 mg/mL。通過尾靜脈注射的方式，給對照組和PBS + L 組 注 射200 μL PBS 溶 液，CCP + L 組 和CLCP + L 組分別注射200 μL 1 mg/mL CCP、CLCP溶液。24 h 后，手術暴露腫瘤組織，在635 nm 激光下以0.1 W/cm2照射15 min。對照組進行假手術處理，不接受激光照射。定期記錄小鼠生存期。

小鼠死亡后，及時獲取腫瘤組織進行原位末端轉移酶標記技術染色（TUNEL 染色）觀察腫瘤內細胞凋亡情況。

1.12 CLCP 光動力治療對胰腺癌組織中T 細胞浸潤的分析 將皮下胰腺癌移植瘤小鼠分組同上。在腫瘤形成后的第1、8 天進行治療，藥物注射劑量和方式同上。24 h后，對腫瘤區(qū)域進行激光照射，功率為0.1 W/cm2，照射時間為15 min。第21 天取腫瘤組織，用組織消化液消化得到單細胞懸液，裂紅處理后anti-CD16/32 抗體封閉15 min。隨后anti-CD3、anti-CD4 和anti-CD8 抗體染色25 min，及時用流式細胞儀檢測。

1.13 統計學方法 所有實驗至少進行了3 次重復。計量資料用（）表示。兩組之間差異采用t檢驗，Kaplan-Meier 法評估生存曲線。本研究中的所有數據分析均使用GraphPad Prism 8 進行。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CLCP 理化性質表征 通過透射電子顯微鏡觀察CLCP 的形貌像。見圖1A，CLCP 電鏡下為直徑（80.4±12.3）nm 的球形結構。在水溶液中，CLCP的流體動力學尺寸為（121.5±5.2）nm（圖1B）。通過紫外分光光度計檢測發(fā)現CLCP 對Ce6 的包封率為63.2%，包載率為16.37%。CaCO3在酸性條件下可降解為無害產物CO2和H2O［13］。見圖1C，CLCP在pH=7.4 條件下形態(tài)和結構保持穩(wěn)定。而在pH=6.5弱酸性條件下，CLCP 被降解，4 h 后沒有觀察到可見的形態(tài)和結構。

圖1 納米粒子CLCP 理化性質表征Fig.1 Physicochemical properties of CLCP nanoparticles

2.2 CLCP體外細胞靶向性分析 見圖2A，用DAPI對Bxpc-3 細胞核進行染色定位（圖中顯示為藍色），并觀察細胞內Ce6 熒光信號（圖中顯示為紅色）。結果表明，沒有主動靶向能力的Ce6@CaCO3-PEG（CCP）只有少量進入細胞中，而有主動靶向能力的CLCP 能夠被Bxpc-3 細胞大量攝取，表現為強烈的Ce6 熒光信號。對圖像中的Ce6 熒光信號進行定量分析，表明相比未結合的納米粒子，Bxpc-3 細胞對表面結合Linsitinib 的納米粒子CLCP 具有更強的攝取量（P＜0.001），見圖2B。

圖2 CLCP 體外細胞靶向性分析Fig.2 In vitro cells targeting assay of CLCP nanoparticles

2.3 CLCP光動力治療體外療效評估 通過CCK-8法檢測CCP和CLCP對Bxpc-3細胞的光毒性。見圖3A，相比于CCP，CLCP 在激光照射下表現出更強的細胞活力抑制作用。通過活/死細胞染色來進一步分析細胞活力下降的原因，Calcein-AM 標記活細胞而表現為綠色熒光信號，作為核染色染料的PI僅在死細胞中進入細胞核而發(fā)出紅色熒光信號。見圖3C，對照組、激光（PBS + L，L 代表激光照射）組的細胞存活未受影響，CCP光動力治療（CCP+L）組可以引起部分細胞死亡，而CLCP 光動力治療（CLCP + L）組造成了顯著的細胞死亡。通過對死細胞進行計數，可以更直觀地發(fā)現CLCP + L 組具有更強的癌細胞殺傷作用（圖3B）。

圖3 CLCP 納米粒子的體外療效檢測Fig.3 In vitro therapeutic effect of CLCP nanoparticles

2.4 CLCP 光動力治療在體療效評估 在原位胰腺癌模型裸鼠中評估不同治療對小鼠生存期的影響。見圖4A，CLCP+L、CCP+L、PBS+L 和對照組的中位生存期分別為46、40、28 和20 d。CLCP+L組的小鼠具有更長的生存期，并且其中位生存期是對照組的2.3 倍（P＜0.001）。對獲取的腫瘤組織進行TUNEL 凋亡染色發(fā)現，與其他組相比，CLCP+L 處理后腫瘤組織中凋亡細胞顯著增加（圖4C）。見圖4B，對腫瘤組織中凋亡/正常細胞數量的比值進行分析發(fā)現，CLCP + L 組的凋亡細胞占比最大，多于CCP+L 組（P＜0.05）。

圖4 CLCP 納米粒子在體療效評估Fig.4 In vivo therapeutic effect of CLCP nanoparticles

2.5 CLCP 光動力治療對腫瘤免疫調節(jié)作用分析 腫瘤內死亡細胞誘導的炎癥可有效提高腫瘤微環(huán)境的免疫原性［14］。通過流式細胞術來定量分析不同治療后腫瘤中浸潤T 細胞比例，以評估CLCP 光動力治療對腫瘤免疫的調節(jié)作用。見圖5A，在各組中CD4+T 細胞比例沒有顯著差異，但CLCP + L 組中腫瘤細胞毒性T 細胞（CD3+CD8+）比例最高。定量結果（圖5B）顯示，在對照組、PBS+L之間，腫瘤內細胞毒性T 細胞比例的差異無統計學意義；CLCP + L 組中細胞毒性T 細胞比例不僅顯著高于對照組（P＜0.01），并且高于CCP + L 組（P＜0.05），表明CLCP 光動力治療能夠更有效地刺激腫瘤中CD8+T 細胞的募集。

圖5 腫瘤浸潤T 細胞流式分析Fig.5 Flow analysis of tumor-infiltrating T cells in vivo

3 討論

胰腺癌惡性程度高、預后差；除了少部分患者得以手術治療外，藥物治療效果不佳，亟需開發(fā)新的治療手段［15］。近年來，光動力治療在膽道腫瘤中表現出良好的治療效果，也有臨床試驗探索光動力治療胰腺癌的臨床療效［16-17］。Ce6 由于其安全性良好、光吸收能力強、活性氧產率高而備受關注，是目前用于光動力治療的常用光敏劑［5，18-19］。然而，由于光敏劑難以遞送到腫瘤區(qū)域，限制了光動力治療在胰腺癌中的應用［20］。納米載藥技術可實現藥物的高負載及高效遞送，提高藥物療效、降低毒副作用［21］，故采用納米載藥技術遞送光敏劑，有望提高光動力治療效果。研究表明，根據腫瘤細胞特異性高表達的分子靶標設計的主動靶向型納米載體更有助于藥物在腫瘤區(qū)域的聚集［10］。前期研究表明胰腺癌細胞高表達IGF-1R，且靶向IGF-1R 的納米探針可實現良好的胰腺癌分子成像及治療效果［22］。此外，根據腫瘤細胞中溶酶體低pH的特點，構建酸響應型納米載體遞送光敏劑可實現腫瘤細胞內的特異性釋放，發(fā)揮精準光動力治療效應［23］。研究表明，納米碳酸鈣具有價格低廉、合成簡單、安全無毒、載藥量大的優(yōu)點，且對酸性環(huán)境敏感，在弱酸性條件（pH=6.5）下能夠迅速降解為無毒物質Ca2+和CO2，因此，納米碳酸鈣已被廣泛作為酸響應型載體應用于藥物的遞送［13］。本研究以IGF-1R 的靶向分子Linsitinib 作為主動靶向元件、納米碳酸鈣作為載體、Ce6 作為光敏劑合成了納米粒子CLCP，其水合粒徑為（121.5 ± 5.2）nm（圖1C），呈均勻球形結構（圖1B）。CLCP 中Ce6 包封率為63.2%，包載率為16.37%，可高效負載Ce6。除此之外，CLCP 具有敏感的酸環(huán)境降解能力（圖1C），允許其在酸性的溶酶體內迅速降解釋放Ce6 并進入胞質，為精準、有效的光動力治療奠定了基礎。體外實驗表明CLCP 具有良好的胰腺癌細胞靶向性，能夠被Bxpc-3 細胞大量攝取并釋放Ce6（圖2）?；?死細胞染色及CCK-8 實驗表明，CLCP在激光照射下，可顯著殺傷Bxpc-3細胞（圖3）。體內實驗表明CLCP 光動力治療可引起明顯的腫瘤組織細胞死亡，顯著延長了荷瘤小鼠的生存期（圖4）。上述結果表明，構建的CLCP 具有良好的酸響應性能和IGF-1R 主動靶向性，能夠有效遞送光敏劑Ce6 至腫瘤細胞，進而發(fā)揮光動力效應殺傷胰腺癌細胞，抑制腫瘤生長。

現有研究認為光動力治療主要通過線粒體損傷介導的細胞死亡通路殺傷腫瘤細胞［24］?；贑LCP 的光動力治療導致顯著的細胞活性下降甚至死亡，推測與更高劑量的光敏劑Ce6 腫瘤區(qū)域遞送及癌細胞攝取有關。其可能機制如下：CLCP經實體瘤高通透性和滯留效應在腫瘤組織中聚集，Linsitinib 識別結合胰腺癌細胞表面IGF-1R，CLCP 經內吞方式進入細胞，到達酸性溶酶體內后，降解并釋放光敏劑Ce6 至胞質并聚集在線粒體周圍，Ce6 在激光照射下產生大量活性氧，損傷線粒體膜導致細胞死亡［24-25］。

也有研究表明光動力治療具有腫瘤免疫調節(jié)作用，通過促進腫瘤相關抗原的釋放激活抗腫瘤免疫，特別是增強細胞毒性CD8+T 細胞浸潤［5，26-27］。研究發(fā)現，與其他組比較，CLCP 介導的光動力治療能夠誘導廣泛的腫瘤細胞死亡（圖4B 和C），CLCP光動力治療組腫瘤組織中CD8+T 細胞明顯增多（圖5），提示CLCP 光動力治療能夠實現更強的免疫激活反應。其可能機制為CLCP 光動力治療導致腫瘤細胞死亡后，腫瘤細胞內鈣網蛋白等免疫原性物質暴露，激活并募集了更多細胞毒性T 細胞，從而激活抗腫瘤免疫反應［5］。

綜上所述，本研究成功構建了酸響應的主動靶向型納米粒子CLCP，高效攜載光敏劑Ce6 進行光動力治療，可誘導胰腺癌細胞死亡，并激活抗腫瘤免疫。研究結果提示納米載體靶向遞送光敏劑可進一步提高光動力治療的療效，且光動力治療聯合免疫治療具有協同抗腫瘤效應，為胰腺癌治療提供了新思路。然而，本研究僅對CLCP 光動力治療胰腺癌的療效及其機制進行初步驗證，后續(xù)尚需對CLCP 光動力治療誘導胰腺癌細胞死亡和免疫激活的機制進行更深入的探索。