1，25-二羥維生素D3通過上調(diào)Nrf2表達(dá)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善小鼠中性粒細(xì)胞性哮喘的研究

韋麗瑩 張景鴻

廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科（南寧 530007）

支氣管哮喘是常見的呼吸道慢性疾病，以氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征，臨床表現(xiàn)復(fù)雜。哮喘是一種的異質(zhì)性疾病，具有不同的臨床和分子表型（phenotype）。根據(jù)氣道炎癥浸潤細(xì)胞類型的不同，分嗜酸粒細(xì)胞哮喘、中性粒細(xì)胞哮喘（neutrophilic asthma，NA）、混合細(xì)胞哮喘及寡細(xì)胞哮喘4 種類型［1］。中性粒細(xì)胞性哮喘是非嗜酸性粒細(xì)胞性哮喘中最主要的類型，對(duì)糖皮質(zhì)激素治療不敏感，需要進(jìn)一步探索其機(jī)制并尋找針對(duì)性的治療方案。目前研究表明中性粒細(xì)胞性哮喘的發(fā)生與Th17 細(xì)胞、NLRP3 炎性小體（inflammasome named nod-like receptor family pyrin domain containing-3）的激活、中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）等關(guān)系密切。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）誘導(dǎo)的NLRP3 炎性小體活化是眾多炎癥性疾病的病理生理基礎(chǔ)，其對(duì)于重癥哮喘的誘導(dǎo)和維持起著關(guān)鍵作用。

維生素D3 是體內(nèi)調(diào)節(jié)鈣磷代謝的脂溶性維生素，并發(fā)現(xiàn)其具有免疫調(diào)節(jié)作用。維生素D 缺乏與哮喘發(fā)作和嚴(yán)重程度之間具有相關(guān)性［2］，實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)血清維生素D3 濃度降低和肥胖哮喘的癥狀表現(xiàn)相關(guān)，和NLRP3 的活性也有相關(guān)性［3］。許多研究觀察了1，25-二羥維生素D3 在哮喘模型中減輕氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)性的作用；維生素D3 可通過激活Nrf2/HO-1 途徑，抑制TGF-β/Smad 信號(hào)傳導(dǎo)改善哮喘氣道重塑［4］。核因子E2 相關(guān)因子（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）是細(xì)胞內(nèi)的一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，參與機(jī)體抗氧化應(yīng)激和炎性組織損傷。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧（ROS）是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，可引起未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的積聚，加重ERS 狀態(tài)。維生素D3 是否通過上調(diào)Nrf2 表達(dá)而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，改善中性粒細(xì)胞哮喘的氣道炎癥，尚需進(jìn)一步探究明確。本研究通過制作中性粒細(xì)胞性哮喘小鼠模型，使用1，25-二羥維生素D3［1，25（OH）2D3］進(jìn)行干預(yù)，觀察Nrf2 表達(dá)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)、ROS 生成、炎性細(xì)胞因子分泌及哮喘氣道炎癥表現(xiàn)，探討1，25（OH）2D3治療中性粒細(xì)胞性哮喘的效果及對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 雞卵清蛋白（OVA，Grade V，美國Sigma 公司，# A5503），小鼠IL-4、IL-17、IL-5、CXCL2、CXCL8 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)試劑盒（美國R&D 公司，#M4000B，#M5000，#M1700，#MM200，#D8000C），蘇木素-伊紅染液試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司KGA224），瑞氏染色液，小鼠抗Ly6G 抗體（美國Thermo Fisher scientific公司，thermo 14-5931-82），Western blot 檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，# KGP1201），Anti-GAPDH（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，#KGAA002）、Anti-Nrf2、Anti- CHOP、Anti- GRP78 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司，# 12721S，#5554S，# 3177S）；TRIzol 總RNA 提取試劑盒（Invitrogen 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green 核酸染料、PCR 引物設(shè)計(jì)合成（TaKaRa 公司）。多功能酶標(biāo)儀（美國MD Spectramac M3），電泳儀（美國Bio-Rad Power Supplies Basic），Trans-Blot Turbo 全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國Bio-Rad 170-4150），凝膠成像系統(tǒng)（英國SYNGENE G，BOXChemiXR5），病理圖像分析系統(tǒng)（德國Leica 公司），5810R 高速低溫離心機(jī)（德國Eppendorf 5810R），超聲霧化器及自制霧化吸入箱等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 Balb/c 雌性小鼠購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（桂）2020-0003。無特定病原體（SPF）級(jí)，鼠齡6 周，體重18 ～22 g，飼養(yǎng)于SPF 屏障系統(tǒng)內(nèi)，溫度：（22 ±2）℃，相對(duì)濕度60% ～70%，保證通風(fēng)，自由進(jìn)食及飲水，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案嚴(yán)格按照廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)范執(zhí)行，經(jīng)倫理委員會(huì)審核通過，倫理審查件批號(hào)：2018-KY-國基-111。將24 只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組，每組8 只，分別為正常對(duì)照組（A）、中性粒細(xì)胞性哮喘模型組（B）、1，25（OH）2D3治療組（C）。參照文獻(xiàn)［5］及預(yù)實(shí)驗(yàn)的方法，B 組和C 組采用CFA+OVA（完全弗氏佐劑+雞卵清蛋白）誘導(dǎo)的方法制作中性粒細(xì)胞性哮喘模型。適應(yīng)性喂養(yǎng)后，小鼠在第0、7 和14 天經(jīng)腹腔注射含20 μg 雞卵清蛋白（OVA）和75 μL CFA 的乳化溶液，對(duì)照組注射生理鹽水；致敏后，小鼠在第21 天和第22 天接受0.1%的OVA 溶液50 μL 鼻內(nèi)滴入激發(fā)。觀察小鼠行為學(xué)變化。正常對(duì)照組以PBS 代替行注射及鼻內(nèi)滴入。C 組小鼠另給予0.1%的1，25（OH）2D3按4 μg/kg 在每次予以O(shè)VA鼻腔滴入激發(fā)前1 h 腹腔注射。

1.3 氣道反應(yīng)性測(cè)定 在小鼠末次激發(fā)24 h 采用雙腔體積描記系統(tǒng)進(jìn)行無創(chuàng)氣道反應(yīng)性檢測(cè)，記錄數(shù)據(jù)并分析小鼠氣道反應(yīng)性。采用美國BUXCO 公司TBL3999 雙腔體積描記系統(tǒng)，以乙酰甲膽堿相應(yīng)濃度激發(fā)下的特殊氣道阻力（sRaw）平均值與PBS 激發(fā)下的特殊氣道阻力平均值來反映，公式為：sRaw 值=Mch sRaw 值-PBS sRaw 值，單位為：cmH2O。將小鼠放入密閉艙內(nèi)適應(yīng)時(shí)間為5 min，以PBS 和12.5、25、50 mg/mL 3 個(gè)乙酰甲膽堿的濃度進(jìn)行激發(fā)霧化，記錄數(shù)據(jù)比較小鼠氣道反應(yīng)性。

1.4 標(biāo)本收集 各組在氣道反應(yīng)性測(cè)定后處死小鼠，收集標(biāo)本，使用500 μL 冰PBS 灌洗并收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）。保存BALF 的上清液備用以檢測(cè)細(xì)胞因子。收取肺組織，左上葉肺組織福爾馬林固定，下一步做常規(guī)病理檢查；左下葉肺組織行氧化應(yīng)激指標(biāo)的生化檢測(cè)；右肺葉織用液氮速凍處理后保存于-80 ℃低溫冰箱，用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)以及Western blot 分析。

1.5 炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù) BALF 離心，細(xì)胞沉淀重懸于200 μL PBS 中。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)的計(jì)數(shù)。另一部分懸液經(jīng)離心重懸，涂片行瑞氏染色，對(duì)每張玻片進(jìn)行至少觀察300 個(gè)炎癥細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和染色性質(zhì)光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類（分嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞），由三位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師進(jìn)行盲法閱片，取平均值。

1.6 肺組織病理 小鼠肺組織用4%多聚甲醛固定24 h，進(jìn)行清洗、脫水、石蠟包埋、切片，切成5 μm 薄片，脫蠟后進(jìn)行蘇木精伊紅（HE）染色，觀察小鼠肺部察炎癥細(xì)胞浸潤及支氣管肺組織結(jié)構(gòu)改變等炎癥病理變化。

1.7 細(xì)胞因子水平檢測(cè) ELISA 法檢測(cè)BALF 中IL-4、IL-17、IL-5、CXCL2、CXCL8 細(xì)胞因子濃度，操作嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各細(xì)胞因子水平。

1.8 免疫組化染色測(cè)定肺組織中性粒細(xì)胞的浸潤 肺組織切片常規(guī)脫蠟，抗原修復(fù)，3% 過氧化氫（H2O2）溶液浸泡阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。5%牛血清蛋白室溫封閉。小鼠Ly-6G 抗體（1∶50）4 ℃下敷育過夜，加HRP 標(biāo)記的二抗室溫敷育1 h。DAB 顯色試劑盒顯色，以及蘇木素復(fù)染，返藍(lán)、常規(guī)脫水、二甲苯透明、干燥、中性樹膠進(jìn)行封固。在顯微鏡下觀察染色結(jié)果判定中性粒細(xì)胞表面抗原Ly-6G 表達(dá)情況并拍照。

1.9 Western blot 檢測(cè)CHOP、GRP78 和Nrf2 蛋白 Western blot 檢測(cè)肺組織CHOP、GRP78 和Nrf2蛋白水平的表達(dá)變化。肺組織液氮充分研磨，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液，混勻冰上裂解30 min，按照說明書提取蛋白、測(cè)定蛋白濃度。樣品中加2×十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣液，100 ℃煮10 min，進(jìn)行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜，加相應(yīng)的一抗和二抗孵育，ECL顯影、拍照、進(jìn)行圖像分析。內(nèi)參照為GAPDH。

1.10 生化檢測(cè)小鼠肺組織GSH、MDA 濃度 將保存的左肺組織制備肺組織勻漿，采用還原型谷胱甘肽（GSH）測(cè)定試劑盒和丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒檢測(cè)肺組織GSH、MDA 濃度，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書操作。

1.11 實(shí)時(shí)熒光定量（RT-PCR）檢測(cè)肺組織醌氧化還原酶1（NQ01）mRNA 的表達(dá)水平 采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)Nrf2 的靶基因NQO1 mRNA的表達(dá)。使用Trizol 試劑提取肺組織總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒的使用說明用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，定量PCR 分析采用SYBR 綠色核酸染料，熒光定量PCR 系統(tǒng)擴(kuò)增分析產(chǎn)物。以β-actin 為內(nèi)參照基因，采用2-ΔΔCT法相對(duì)定量，計(jì)算NQO1 mRNA表達(dá)水平。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠氣道反應(yīng)性的變化 各組小鼠氣道反應(yīng)性測(cè)定表明，中性粒細(xì)胞性哮喘模型組經(jīng)不同濃度Mch 激發(fā)有明顯氣道高反應(yīng)性，其sRaw 增長值均高于對(duì)照組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療組小鼠（1，25（OH）2D3治療）在25 mg/mL 和50 mg/mL Mch 濃度的激發(fā)情況下，氣道反應(yīng)性對(duì)比模型組小鼠顯著下降，sRaw 增長值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 氣道高反應(yīng)性測(cè)定結(jié)果Fig.1 Airway hyper-responsiveness test results

2.2 BALF 中細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類BALF 中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞細(xì)胞比例在中性粒細(xì)胞性模型組小鼠中增高，和對(duì)照組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；1，25（OH）2D3治療組細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞比例與模型組相比有明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類Tab.1 Total and differential cell counts in BALF ±s

表1 支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類Tab.1 Total and differential cell counts in BALF ±s

注：與對(duì)照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05

組別對(duì)照組模型組治療組F 值P 值例數(shù)8 8 8細(xì)胞總數(shù)（× 104/mL）26.45 ± 5.13 62.70 ± 5.61#45.90 ± 4.19*196.4＜0.001細(xì)胞分類計(jì)數(shù)（%）嗜酸性粒細(xì)胞0.90 ± 0.45 14.00 ± 1.94#8.95 ± 2.16*100.7＜0.001淋巴細(xì)胞12.30 ± 1.57 14.50 ± 2.83 21.70 ± 2.95 196.6＜0.001中性粒細(xì)胞10.90 ± 163 20.70 ± 1.25#13.40 ± 2.10*65.21＜0.001單核細(xì)胞75.90 ± 2.49 54.80 ± 2.84 51.70 ± 3.24 124.3＜0.001

2.3 支氣管肺組織病理改變 病理HE 染色觀察小鼠肺組織病理改變：對(duì)照組小鼠肺組織肺泡壁及支氣管結(jié)構(gòu)、上皮黏膜完整，肺泡壁未見增厚，肺泡間隔、氣道周圍未見炎癥細(xì)胞浸潤。模型組小鼠肺組織可見肺組織的結(jié)構(gòu)破壞，肺泡壁增厚和肺泡大小不一，支氣管管腔可見分泌物，支氣管周圍可見較多炎性細(xì)胞浸潤，可見肺泡及間質(zhì)充血。治療組炎癥細(xì)胞浸潤減少，支氣管管腔通暢，黏膜層完整，肺泡及間質(zhì)可見輕度充血現(xiàn)象，對(duì)比模型組肺泡壁增厚減輕。見圖2。

圖2 肺組織的病理學(xué)HE 染色（× 400）Fig.2 Histologic changes of lung tissue（× 400）

2.4 BALF 中細(xì)胞因子IL-4、IL-17、IL-5、CXCL2、CXCL8 濃度水平ELISA 檢測(cè) BALF 中細(xì)胞因子結(jié)果提示，中性粒細(xì)胞性哮喘模型組的IL-4、IL-17、IL-5、CXCL2、CXCL8 水平較對(duì)照組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療組細(xì)胞因子濃度較模型組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞因子濃度Tab.2 Cytokine levels in BALF ±s，pg/mL

表2 支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞因子濃度Tab.2 Cytokine levels in BALF ±s，pg/mL

注：與對(duì)照組比較，#P ＜0.05, ##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05

組別對(duì)照組模型組治療組F 值P 值例數(shù)8 8 8 IL-4 19.61 ± 1.42 84.56 ± 9.33#49.56 ± 3.76*452.8＜0.001 IL-5 24.32 ± 2.44 100.75 ± 6.27##39.36 ± 11.63**429.4＜0.001 IL-17 8.32 ± 1.13 25.64 ± 3.23#16.62 ± 4.23*144.7＜0.001 CXCL2 27.66 ± 1.04 62.72 ± 3.49#41.13 ± 8.54*74.78＜0.001 CXCL8 50.15 ± 5.38 136.91 ± 41.28##73.80 ± 12.04*117＜0.001

2.5 中性粒細(xì)胞Ly-6G 免疫組織化學(xué)染色 肺組織免疫組化染色顯示，模型組小鼠肺組織與對(duì)照組比較可見中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)量顯著增加；在1，25（OH）2D3治療組小鼠肺組織中Ly-6G 陽性染色降低，提示中性粒細(xì)胞浸潤減少。見圖3。

圖3 中性粒細(xì)胞Ly-6G 免疫組化染色（× 400）Fig.3 Immunohistochemical staining for Ly-6G in lung tissue

2.6 肺組織CHOP、GRP78 和Nrf2 蛋白表達(dá) Western blot 方法檢測(cè)各組小鼠肺組織CHOP、GRP78、Nrf2 蛋白的表達(dá)水平，中性粒細(xì)胞性哮喘模型組小鼠肺組織CHOP、GRP78 蛋白水平與對(duì)照組相比均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；1，25（OH）2D3治療組CHOP、GRP78 表達(dá)較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Nrf2 的蛋白表達(dá)較模型組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 肺組織Western blot 檢測(cè)CHOP、GRP78 和Nrf2 蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of CHOP、GRP78 and Nrf2 in the lung tissue by Western blot

2.7 肺組織GSH、MDA 含量測(cè)定結(jié)果 模型組小鼠肺組織中MDA 水平明顯高于對(duì)照組；模型組的GSH 低于對(duì)照組。1，25（OH）2D3治療顯著降低了中性粒細(xì)胞性哮喘小鼠肺組織中的MDA 水平，并增加了GSH 水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

圖5 肺組織GSH、MDA 含量Fig.5 MDA，GSH contents in lung tissue

2.8 肺組織NQO1 mRNA 表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果NQO1 mRNA 的表達(dá)水平測(cè)定顯示模型組中肺組織NQO1 mRNA 表達(dá)升高。在1，25（OH）2D3治療組，NQO1 mRNA 的水平與正常對(duì)照組相比，表達(dá)水平顯著提高（P＜0.01），與模型組比較也有提高（P＜0.05）。見圖6。

圖6 肺組織NQO1 mRNA 表達(dá)水平測(cè)定Fig.6 NQO1 mRNA expression in lung tissue

3 討論

中性粒細(xì)胞哮喘的發(fā)病機(jī)制尚不明確，因?yàn)閷?duì)糖皮質(zhì)激素治療抵抗，且臨床癥狀相比于其他類型的哮喘嚴(yán)重，給患者生活工作等方面帶來極大影響。病毒、真菌等感染、大氣污染、肥胖等合并因素導(dǎo)致以中性粒細(xì)胞性炎癥為主的難治性哮喘增多。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞為應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白聚集等狀況，從而激活未折疊蛋白反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)等信號(hào)途徑的反應(yīng)過程［6］。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以誘導(dǎo)NLRP3 炎性小體活化，加劇了炎癥小體誘導(dǎo)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這可能為系列炎癥性疾病的治療提供新的靶向途徑［7］。而機(jī)體氧化應(yīng)激引起未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)，加重ERS。Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵通路，維持體內(nèi)抗氧化物與過氧化物平衡［8］。Nrf2 的激活可啟動(dòng)下游多種靶蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)氧化還原平衡。筆者的研究結(jié)果證實(shí)在臭氧誘導(dǎo)的哮喘急性發(fā)作的小鼠模型中，通過激活Nrf2 恢復(fù)氧化抗氧化平衡，降低ROS，減少IL-17A、IL-4、IFN-γ 等的產(chǎn)生，并減少γδT17 細(xì)胞比例，減輕哮喘的氣道炎癥［9］。PATHINAYAKE 等［10］研究證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的增強(qiáng)與嚴(yán)重嗜酸性粒細(xì)胞哮喘和中性粒細(xì)胞性哮喘有關(guān)，在哮喘的發(fā)病中起關(guān)鍵作用。通過下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物可以減輕OVA 誘導(dǎo)的小鼠哮喘氣道炎癥［11］。GRP78 是一種多功能蛋白，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)的主要調(diào)節(jié)者；未折疊蛋白反應(yīng)的持續(xù)會(huì)上調(diào)CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAATenhancer-binding protein homologous protein，CHOP）的表達(dá)，GRP78 與CHOP 蛋白表達(dá)的變化是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志［12］。在本實(shí)驗(yàn)研究中，中性粒細(xì)胞性哮喘模型小鼠出現(xiàn)氣道反應(yīng)性增高，支氣管肺組織觀察到明顯炎癥反應(yīng)，中性粒細(xì)胞浸潤增加，肺組織氧化應(yīng)激及CHOP、GRP78 蛋白表達(dá)增強(qiáng)，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的增強(qiáng)加劇了哮喘的氣道中性粒細(xì)胞性炎癥。

1，25-（OH）2D3是維生素D3 的生物活性形式，主要生理功能是調(diào)節(jié)鈣磷代謝，對(duì)固有免疫和特異性免疫功能也有明顯的調(diào)節(jié)效應(yīng)。較多研究顯示了維生素D3 用于控制哮喘的作用［13-14］?；钚跃S生素D3 在人體內(nèi)表現(xiàn)的抗炎作用與抑制氧化應(yīng)激有關(guān)，有研究報(bào)道1，25（OH）2D3可以通過激活Nrf2 從而抑制ROS-NLRP3-IL-1β 信號(hào)軸，減輕高滲誘導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞炎癥［15］。維生素D3 運(yùn)用于預(yù)防和治療糖尿病性視網(wǎng)膜病等炎癥，維生素D3 可降低糖尿病誘導(dǎo)的ROS 上升并抑制ROS/TXNIP/NLRP3 途徑，減輕視網(wǎng)膜血管損傷和細(xì)胞凋亡［16］。本實(shí)驗(yàn)觀察了1，25-二羥維生素D3 治療對(duì)中性粒細(xì)胞性哮喘的效果，在模型小鼠中降低了氣道AHR 和炎性細(xì)胞浸潤，減輕了肺組織中性粒細(xì)胞炎癥和相關(guān)因子如IL-4、IL-17、IL-5、CXCL2、CXCL8 的水平，并且降低了氧化應(yīng)激產(chǎn)物水平，提示1，25（OH）2D3對(duì)中性粒細(xì)胞性炎癥的抑制作用和對(duì)氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用。

1，25（OH）2D3治療通過何種機(jī)制抑制中性粒細(xì)胞性氣道炎癥，是否通過調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化還原反應(yīng)而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激？不少研究揭示1，25（OH）2D3通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)呼吸道感染、炎癥反應(yīng)、糖尿病、細(xì)胞凋亡、缺血再灌注損傷的改善作用［17-21］。HU 等［22］的研究結(jié)果表明，1，25（OH）2D3可以通過抑制PERK-ATF4-CHOP 途徑阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中使用1，25（OH）2D3治療使哮喘動(dòng)物肺組織CHOP、GRP78 表達(dá)水平降低，提高了Nrf2 蛋白表達(dá)以及其下游基因NQO1 mRNA 的表達(dá)，提示其可能通過上調(diào)Nrf2 表達(dá)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善小鼠中性粒細(xì)胞性哮喘炎癥反應(yīng)。

總之，本研究結(jié)果顯示1，25-二羥維生素D3可通過增強(qiáng)Nrf2 蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，并抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少炎癥細(xì)胞因子的分泌，從而減輕中性粒細(xì)胞性哮喘小鼠氣道炎癥。這為臨床治療中性粒細(xì)胞性哮喘或難治性哮喘提供了新的思路和理論研究，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討，以及進(jìn)行必要的臨床試驗(yàn)以證實(shí)其治療效果。