早期剝除卵丘細胞對凍融單囊胚移植妊娠結局及新生兒結局的影響

張卉，王常燕，王玉紅，常文亮，盧靜，景麗，柴亮聽

(1.邯鄲市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學科，邯鄲 056000；2.邯鄲市第一醫(yī)院檢驗科，邯鄲 056000)

自1978年以來，輔助生殖技術(ART)取得了極大進步，但常規(guī)體外受精(IVF)后完全受精失敗的可能性仍不可避免[1-2]。在受精16～18 h后采用補救卵胞漿內(nèi)單精子注射(R-ICSI)，雖然能獲得較好的受精率和卵裂率，但因卵母細胞老化，隨后的胚胎發(fā)育和妊娠結局并不理想[1]。近年來，縮短精卵共培養(yǎng)時間，結合早期R-ICSI被認為是避免常規(guī)IVF周期中完全受精失敗的有效策略[3]。

卵丘細胞在卵母細胞生長、成熟、受精和胚胎發(fā)育過程中起著至關重要的作用[4]。然而，為了識別未受精卵母細胞并進行早期R-ICSI，需要在精卵共培養(yǎng)4～6 h(短時受精)后剝除卵丘細胞，以確定卵母細胞中是否出現(xiàn)第二極體[5]。有研究表明，短時受精可以顯著改善受精率、囊胚質(zhì)量和胚胎種植能力[6]，也有研究認為早期剝除卵丘細胞對受精、多精受精、胚胎發(fā)育沒有顯著影響[7]。但大多數(shù)研究均認為，在精卵共培養(yǎng)4～6 h剝除卵丘細胞，可以早期發(fā)現(xiàn)低受精或完全受精失敗。目前，對于早期剝除卵丘細胞仍沒有共識，且很少有研究探討早期卵丘細胞剝除對胚胎移植后活產(chǎn)和新生兒結局的影響。本文旨在研究IVF周期中4 h和16～18 h剝除卵丘細胞組的正常受精率、多原核受精率、胚胎和囊胚發(fā)育潛力差異，同時探討兩者凍融單囊胚移植后的妊娠結局和新生兒結局。

資料與方法

一、研究對象及分組

回顧性分析2018年1月至2020年12月于邯鄲市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學科接受常規(guī)IVF治療的單囊胚解凍移植患者的臨床資料。

納入標準：(1)女方年齡≤40歲；(2)取卵周期獲得≥4個卵母細胞；(3)移植胚胎為常規(guī)IVF周期凍融單囊胚；(4)解凍后存活且培養(yǎng)2 h擴張程度達1/2以上的囊胚。

排除標準：(1)ICSI或R-ICSI周期的凍融囊胚移植；(2)患有先天或繼發(fā)子宮異常、宮腔粘連的患者；(3)轉(zhuǎn)化日子宮內(nèi)膜厚度<8 mm的患者；(4)單囊胚移植后單卵雙胎分娩的患者。

本研究共納入241個周期，根據(jù)卵丘細胞剝除時間，將患者分為兩組：4 h組(n=116)和16～18 h組(n=125)，4 h組在精卵共培養(yǎng)4 h后剝除卵丘細胞并進行卵母細胞第二極體觀察，16～18 h組在精卵共培養(yǎng)16～18 h后剝除卵丘細胞直接進行原核觀察。4 h組患者至少有一個不受精的高危因素：女方有影響卵母細胞質(zhì)量的因素(如子宮內(nèi)膜異位癥或多囊卵巢綜合征)、不孕年限≥3年、不明原因不孕。

二、研究方法

1.促排卵方案和卵母細胞獲取：所有患者均接受控制性卵巢刺激(COS)，COS方案包括促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)長方案、促性腺激素釋放激素拮抗劑(GnRH-ant)方案或微刺激方案。當≥3個卵泡直徑達到18 mm時，肌肉注射5 000～10 000 U的HCG(珠海麗珠)，以觸發(fā)卵母細胞成熟。HCG注射35～37 h后經(jīng)陰道B超引導下穿刺取卵。將采集的卵丘-卵母細胞復合(COCs)置于G-IVF plus受精培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中，在5% O2、6% CO2的37℃培養(yǎng)箱(Cook，美國)中等待受精。

2.精子制備和受精：在禁欲2～7 d后，取卵當日男方手淫取精，精液在室溫條件下液化至少30 min。根據(jù)《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第五版)標準，對精液質(zhì)量進行評估，采用常規(guī)不連續(xù)密度梯度離心法和上游法處理精液，處理后的精子保存在室溫下備用。注射HCG 38～40 h后按照10～20萬條精子/ml受精體系將精子加入COCs所在的G-IVF plus受精液中進行授精。

3.卵丘細胞剝除：4 h組將精卵共培養(yǎng)4 h，用140 μm剝卵管(Cook，美國)反復抽吸卵母細胞，直到移除大部分卵丘細胞，將受精卵轉(zhuǎn)移到G-1 plus 卵裂培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)微滴中觀察極體情況。若卵母細胞存在兩個極體判斷為受精，低于30%的受精率屬于低受精，當所有卵母細胞均未出現(xiàn)第二極體時，判定受精完全失敗。低受精或完全受精失敗的患者在授精6 h后進行早期R-ICSI。16～18 h組將COCs與精子共培養(yǎng)16～18 h后剝除卵丘細胞，直接觀察原核情況。

4.受精、胚胎發(fā)育評估及移植：在卵母細胞授精約16～18 h后，觀察兩組卵母細胞是否存在原核(PN)，以確定受精情況。當觀察到2PN時，判斷為正常受精；觀察到0PN、1PN或多PN(>2PN)時，判斷為異常受精。多PN受精卵直接丟棄，2PN、1PN或0PN卵裂的受精卵于受精后的1～3 d在G-1 plus卵裂培養(yǎng)液中培養(yǎng)，4～6 d在G-2 plus囊胚培養(yǎng)液(vitrolife，瑞典)中培養(yǎng)，第3 天可利用胚胎定義為細胞數(shù)≥6個、細胞碎片比例≤25%的2PN 胚胎。除外第3天移植及冷凍的胚胎，將剩余2PN 胚胎及所有1PN和0PN 卵裂期胚胎進行囊胚培養(yǎng)。根據(jù)Gardner評分系統(tǒng)對囊胚進行評分，可利用囊胚進行玻璃化冷凍或解凍。

5.內(nèi)膜準備：如前所述[8]，患者采用人工周期或自然周期準備子宮內(nèi)膜。人工周期方案：月經(jīng)第3天起口服戊酸雌二醇(補佳樂，拜耳，德國)4～10 mg/d，當B超監(jiān)測內(nèi)膜厚度≥8 mm時，肌肉注射黃體酮(浙江仙琚)40～60 mg/d使內(nèi)膜轉(zhuǎn)化為分泌期，轉(zhuǎn)化第6天行凍融單囊胚移植。自然周期方案：于月經(jīng)周期的第8～10天開始B超監(jiān)測卵泡及內(nèi)膜，當優(yōu)勢卵泡直徑>14 mm時，同時監(jiān)測血黃體生成素(LH)水平，確定排卵時間，排卵前肌肉注射HCG(珠海麗珠)5 000～10 000 U，卵泡破裂后第5天行凍融單囊胚移植。移植后繼續(xù)給予黃體支持。隨訪所有移植患者的妊娠結局，直到分娩或流產(chǎn)。

6.臨床結局判斷：胚胎移植后14 d血清β-HCG≥3 U/L定義為HCG陽性，移植后28 d行B超檢查見妊娠囊及原始心管搏動定義為臨床妊娠。孕28周之前的胚胎丟失或妊娠終止定義為流產(chǎn)。早產(chǎn)(PTB)定義為妊娠前37周的分娩。低出生體重(LBW)為新生兒出生體重<2 500 g。

7.觀察指標：兩組患者的基本資料，包括女方年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、不孕年限、基礎FSH、不孕類型、不孕原因以及促性腺激素(Gn)總量、促排卵天數(shù)、平均獲卵數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜準備方案、移植囊胚期；受精及胚胎發(fā)育情況，包括2PN率、多PN率、囊胚形成率、可利用胚胎率；妊娠結局，包括HCG陽性率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率及活產(chǎn)率；新生兒結局，包括新生兒胎齡、早產(chǎn)兒比例、新生兒體重、低體重兒比例、新生兒性別比例和畸形兒比例。

2PN率=2PN卵母細胞數(shù)/IVF加精卵母細胞數(shù)×100%；多PN率=>2PN卵母細胞數(shù)/IVF加精卵母細胞數(shù)×100%；囊胚形成率=形成囊胚數(shù)/進行囊胚培養(yǎng)胚胎數(shù)×100%，可利用胚胎率=(移植胚胎數(shù)+冷凍胚胎數(shù))/總卵裂數(shù)×100%；HCG陽性率=HCG陽性周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；胎齡=囊胚移植后的天數(shù)+19。

三、統(tǒng)計學方法

結 果

一、兩組患者的基本資料

本研究共分析了241個凍融單囊胚移植周期，根據(jù)受精過程中卵丘細胞剝除時間，將患者分為4 h組(n=116)和16～18 h組(n=125)。分析兩組患者的基本資料，結果顯示：4 h組不孕年限和原發(fā)不孕比例均顯著高于16～18 h組(P<0.01)，兩組之間的不孕原因也有顯著差異(P<0.05)；兩組患者在女方年齡、BMI和基礎FSH水平方面無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般情況比較[M(P25，P75)，(-±s)，n(%)]

二、兩組患者的促排卵及受精情況

統(tǒng)計結果顯示，與16～18 h組相比，4 h組Gn總量和可利用胚胎率顯著增加(P<0.05)；而在促排卵天數(shù)、平均獲卵數(shù)、2PN率、多PN率、囊胚形成率、子宮內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜準備方案和移植囊胚期方面，兩組間均無顯著差異(P>0.05)(表2)。

三、兩組患者的臨床結局比較

兩組患者的HCG陽性率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率及活產(chǎn)率比較均無顯著差異(P>0.05)(表3)。

表2 兩組患者的促排卵及受精情況比較[M(P25，P75)，%，n(%)]

表3 兩組患者的妊娠結局比較(%)

四、兩組患者新生兒結局比較

兩組間的新生兒胎齡、新生兒體重、早產(chǎn)兒比例、低體重兒比例以及性別比均無顯著差異(P>0.05)，兩組均無畸形兒出生(表4)。

表4 兩組間新生兒結局比較[M(P25，P75)，(-±s)，%]

五、早期剝除卵丘細胞對妊娠結局和新生兒結局的影響

通過多因素線性回歸及多因素Logistic回歸分析探討早期剝除卵丘細胞與妊娠結局及新生兒結局之間的獨立關聯(lián)。在調(diào)整了女性年齡、BMI、不孕年限、基礎FSH、不孕類型、不孕原因、Gn總量、移植囊胚期、子宮內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜準備方案后，兩組患者間的臨床妊娠結局比較均無顯著性差異(P>0.05)(表5)；新生兒結局分析中，兩組間的新生兒胎齡、新生兒體重、早產(chǎn)兒比例、低體重兒比例比較也均無顯著性差異(P>0.05)，但4 h組新生兒男性比例顯著高于16～18 h組(P=0.04)(表6)。

表5 早期剝除卵丘細胞對妊娠結局影響的多因素Logistic回歸分析

表6 早期剝除卵丘細胞對新生兒結局影響的多因素線性/Logistic回歸分析

討 論

卵丘細胞在卵母細胞發(fā)育和自然受精過程中必不可少，但在ICSI周期中胚胎在沒有卵丘細胞的情況下能夠正常發(fā)育，這一事實表明，早期剝除卵丘細胞可能不會影響胚胎發(fā)育。此外，Chen等[9]發(fā)現(xiàn)，卵母細胞與精子共培養(yǎng)2～4 h后受精，約90%卵母細胞在授精6 h出現(xiàn)第二極體。Jin等[10]發(fā)現(xiàn)，在精卵共培養(yǎng)4 h時觀察到第二極體的卵母細胞中93.3%于授精14～18 h后觀察到受精跡象，其中84.8%表現(xiàn)為正常受精；如果在早期卵丘細胞剝除過程中未觀察到第二極體排出，可進行早期R-ICSI，與晚期R-ICSI相比，早期R-ICSI可獲得更高的受精率和更具有發(fā)育潛力的胚胎。

既往研究表明，原發(fā)不孕和較長的不孕時間是完全受精失敗的高危因素[11]，不明原因不孕患者完全受精失敗的發(fā)生率也較高[12]。本研究將這些原因?qū)е虏辉械幕颊呒{入4 h組，必要時進行早期R-ICSI。因此，4 h組與16～18 h組在原發(fā)不孕率、不孕持續(xù)時間、不育原因等方面存在顯著差異。與16～18 h組相比，4 h組Gn總量顯著增加，這可能是由于4 h組患者卵巢功能反應欠佳所致。

早期剝除卵丘細胞對多精受精的影響仍存在爭議。受精早期較晚期剝除卵丘細胞更困難，同時，在受精早期，卵母細胞由于紡錘體和微管的活躍而更加脆弱，重復性的抽吸可能會對卵母細胞結構的完整性造成不利影響，從而損傷其多精受精的保護機制[13]。已有研究顯示，早期剝除卵丘細胞后多PN率顯著增加[14]。然而，也有研究報道，短時受精并沒有增加多PN率[13]。有學者觀察到早期剝除卵丘細胞后正常受精率顯著降低[15-16]。我們的研究顯示，4 h組的多PN率增高，而2PN率降低，盡管兩組之間的差異均無統(tǒng)計學意義，但仍有一定的變化趨勢，這一結果與之前的報道[7]一致。卵丘細胞為卵母細胞提供了一系列在卵母細胞成熟、受精和發(fā)育中發(fā)揮重要作用的物質(zhì)[17]。但我們的結果顯示，4 h組的可利用胚胎率顯著高于16～18 h組，這可能是由于隨著共培養(yǎng)時間的延長，卵丘細胞和精子產(chǎn)生的有毒代謝物會對胚胎發(fā)育產(chǎn)生不利影響[18]。然而，也有報道認為早期剝除卵丘細胞并不影響胚胎的活力、質(zhì)量以及臨床結局[19-20]。產(chǎn)生這些矛盾結果的原因可能是研究設計和患者的異質(zhì)性。卵丘細胞對卵母細胞的受精結局有利有弊，其確切性質(zhì)有待進一步研究證實。

關于受精過程中早期剝除卵丘細胞對臨床結局和新生兒結局的影響，一項前瞻性隨機對照研究顯示，與20 h組相比，4 h剝除卵丘細胞對新鮮胚胎移植周期的HCG陽性率和臨床妊娠率無不良影響[21]。另一項回顧性研究也表明，在年齡小于40歲的患者中，與常規(guī)卵丘細胞剝除相比，早期卵丘細胞剝除對臨床妊娠、流產(chǎn)和活產(chǎn)率沒有不利影響[22]。本研究中，4 h組與16～18 h組的凍融單囊胚移植結局比較，在HCG陽性率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率方面差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。上述數(shù)據(jù)表明，在新鮮胚胎移植和凍融單囊胚移植周期中，受精過程中早期卵丘細胞剝除可能對妊娠結局沒有不利影響。

目前，關于早期卵丘細胞剝除對新生兒預后的研究還很有限。已有研究發(fā)現(xiàn)，4 h和20 h剝除卵丘細胞組的新鮮胚胎移植后單胎和雙胎的新生兒在出生體重、早產(chǎn)率、新生兒性別比例等方面相似[22]。尚未有文獻對早期剝除卵丘細胞后的凍融胚胎結局進行研究，本文針對凍融單囊胚移植，分析了胚胎移植后的單胎妊娠和新生兒結局。研究結果顯示，排除混雜因素干擾后，兩組間新生兒胎齡、早產(chǎn)兒比例、新生兒體重及低體重兒比例比較均無顯著差異(P>0.05)，兩組均無重大畸形兒出生，但4 h組中男性新生兒比例顯著高于16～18 h組(P=0.04)，提示早期剝除卵丘細胞可能會增加凍融單囊胚移植后男性新生兒的出生比例。

本研究的主要優(yōu)勢在于探究了早期卵丘細胞剝除后凍融周期囊胚移植的臨床妊娠和新生兒結局。由于雙胎妊娠與不良妊娠和新生兒結局的風險增加相關，因此本研究只納入了單囊胚移植及單胎新生兒出生的病例，排除了多胎妊娠產(chǎn)生的不利影響；此外，本研究進行了回歸分析，盡量減少與妊娠和新生兒結局可能相關的混雜因素。但本研究也存在一定的局限性：首先，作為一個回顧性分析，數(shù)據(jù)收集來自病歷記錄，不能排除所有可能影響研究結局的自變量因素；其次，研究數(shù)據(jù)來自單中心，納入的周期數(shù)較少，出生的新生兒數(shù)量也相對較少。因此，后期需要進行多中心前瞻性研究，以消除混雜因素的影響。

綜上所述，在凍融單囊胚移植周期中，受精過程中早期剝除卵丘細胞對妊娠結局和除新生兒性別比以外的新生兒結局沒有顯著影響。對于有不受精高危因素的患者，可以選擇早期卵丘細胞剝除聯(lián)合早期R-ICSI。但尚需對早期剝除卵丘細胞后新生兒性別及新生兒長期隨訪進行關注，進一步驗證早期卵丘細胞剝除的安全性。